粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用的制作技术
核酸适配体及其在化学领域的相关应用
202
学术论丛
核酸适配体及其在化学领域的相关应用
王致浩
青岛17中
摘要：化学是自然科学中的一种，根据其相关规律的研究
和创新，能够创造出新物质的科学。化学能够充分融入到各种先进的学科当中，并且对其他相关技术的发展具有一定推动作用。本文根据对核酸适配体的研究，着重分析了其在化学领域当中的重要应用，及其相关应用成果。
关键词：化学领域；核酸适配体；筛选技术
引言：
现代文明的发展和科学的应用与创新，都在不断推动着民众生活水平和质量的提升。其中相关学者在化学领域的有关应用，也在不同程度地促进现代科学的发展，以及各个领域的科学完善。例如，核酸适配体在化学领域中的应用，具有十分重要的现实应用价值。本文通过对核酸适配体的研究和应用，以及其在化学领域中取得的相关研究成果进行分析和阐述。
一、核酸适配体概述
核酸适配体，简而言之就是通过人工手段合成的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。Aptamer(核酸适配体)通常情况下是由10-100个碱基(Base)组成，在与靶标进行适当的结合时，会通过Base配对之后形成稳定的二级结构，例如Hairpin、G-四聚体等，在此类结构中Base也是促进靶标结合的重要组成部分。相关材料还表明，Aptamer的作用与靶标的作用并不是单纯的同一种作用力，而是有多种不同的作用力共同起作用的结果[1]。
二、核酸适配体的筛选方法
(一)传统筛选方法
受先进科学研究技术不断进步的影响，对核酸适配体的研究和筛选方式也逐渐成熟。其中传统的核酸筛选方式，究其根本，是以构建较大容量Aptamer文库为基本原理，之后通过靶标与Aptamer之间的相互作用，采用先进的科学分离方式将Aptamer中与靶标结合或未结合的分子互相分离，之后洗脱收集，最后进行光电导继电器反应，成就核酸适配体指数富集。在重复多次操作之后，最终得到具有有效的特异性和高亲和力的靶分子结合核酸适体[2]。
新型核酸适配体技术在基因编辑中的应用
新型核酸适配体技术在基因编辑中的应用在科学技术不断进步的今天，基因编辑技术已经越来越成为研究和治疗疾病的新方向。随着新型核酸适配体技术(Nucleic Acid Adaptor Technology, NAAT)的应用，基因编辑技术进一步提高了其准确性和效率，为人类健康带来前所未有的利益。
一、新型核酸适配体技术的原理
新型核酸适配体技术是一种依赖于纳米粒子的生物荧光探针，它是由核酸序列和适配体组成的。适配体是一种异氰酸铵基团修饰的化合物，它可以与靶分子结合，发生生物荧光反应并实现生物检测。在基因编辑中，适配体的基本作用是有效识别和准确捕捉目标DNA序列，从而调控基因的表达和功能。
二、新型核酸适配体技术的优点
相较于传统的CRISPR/Cas9系统和TALENs系统，新型核酸适配体技术具有以下优点：
1. 更高的精确度
新型核酸适配体技术具有更高的精确度，因为它可以更准确地
锁定目标DNA序列，避免无意识地改变非目标DNA序列。因此，它比其他技术更安全和可靠，能够避免错误的基因编辑导致的突
变或损伤。
2. 更广泛的适用性
新型核酸适配体技术具有更广泛的适用性，因为它不仅能够编
辑基因组DNA序列，还能编辑RNA序列和蛋白质序列，从而实
现更多的生物功能调控。
3. 更高的效率
新型核酸适配体技术在基因编辑过程中具有更高的效率，因为
它可以更快地识别和捕捉目标DNA序列，从而减少基因编辑的时
间和成本。
三、新型核酸适配体技术在基因编辑中的应用
1. 编辑细胞基因
新型核酸适配体技术已经应用于编辑细胞基因，从而改变细胞
核酸适配体技术在生物学研究中的应用
核酸适配体技术在生物学研究中的应用
随着科技的不断发展，生物学研究的方法也不断地更新和实现。在这其中，核酸适配体技术被广泛应用于生物学研究领域。本文
将探讨核酸适配体技术在生物学研究中的应用，以及其研究方向
和未来的发展趋势。
什么是核酸适配体技术？
核酸适配体是一种用于识别和结合特定生物分子的人工核酸，
通常由单链RNA或DNA分子构成。其基本原理是通过高通量筛
选和进化来识别结合到目标分子的核酸序列。核酸适配体通常具
有高度的选择性和亲和力，能够专门结合到目标分子，并且可以
在研究生命过程中发挥重要作用。
核酸适配体技术在生物学研究中的应用
核酸适配体技术在生物学研究中广泛应用于识别和分离目标分子。核酸适配体可以用于疾病诊断、基因编辑、蛋白质分离、信
号转导和药物发现等领域。
1. 疾病诊断
核酸适配体技术可以通过识别和分离体液中患者的疾病标志物来进行疾病的诊断。例如，在乳腺癌诊断中，可以利用核酸适配体来识别人血清中的乳腺癌标志物并诊断患者的病情。
2. 基因编辑
核酸适配体技术可以用于基因编辑。通过设计适当的核酸适配体序列，可以将它们用于引导CRISPR基因编辑系统进行基因操作。利用此技术，人们可以更精确地进行基因编辑，获得更好的实验效果。
3. 蛋白质分离
核酸适配体技术可以用于蛋白质的识别和分离。通过筛选一些特定结合目标蛋白的核酸适配体可以分离出目标蛋白，这对于研究蛋白在生物进程中的功能和作用有积极的作用。
4. 信号转导
核酸适配体技术在信号转导中也有一定的应用。通过识别和绑定到信号分子的核酸适配体，可以研究多种信号转导途径的活动和特性。
核酸适体筛选方法的研究进展
Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） 技术 ， 筛选 到其相应 的核酸适体 。近年来 ， 在传统 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ技术的基础上 ， 新的 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ技 术不断出现 ， 如毛细
管 电泳 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ （ ｃ ａ ｐ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ ｙ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ， Ｃ Ｅ 。 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） 、 荧光磁珠 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ （ Ｆ ｌ ｕ Ｍａ ｇ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） 、 自动化 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ（ ａ ｕ ｔ ｏ ～ ｍａ ｔ ｅ ｄ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） 、 细胞． Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ（ ｃ ｅ ｌ ｌ — Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） 、 消减 Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ（ ｓ ｕ ｂ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） 技术等 。这些新技术的出现 ， 在不 断完善
中国生物制品学杂志 ２ ０ １ ５年 ４月第 ２ ８卷第 ４期 Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ Ａｐ ｒ ｉ ｌ ２ ０ １ ５ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ８ Ｎ ｏ ． ４
・４２ ９・
・
综
述 ・
核 酸适 体筛选方法 的研究 进展
徐 龙峰 综 述 ，王 丽 审校
ｅ ｘ ｐ ｏ ｎ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｌ ｅ ｎ ｒ ｉ ｃ ｈ ｍｅ ｎ ｔ （ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ） ． Ｉ ｎ ｒ ｅ ｃ ｅ ｎ ｔ ｙ ｅ ａ ｒ ｓ ， ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ｎ ｅ ｗ Ｓ Ｅ Ｌ Ｅ Ｘ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｅ ｓ
核酸适体的筛选制备及分析应用_刘腾飞
酸适体复合物
通过滤膜过滤 、 亲和层析 、 磁
珠分 离 、 毛细管 电泳 、 聚丙烯酞胺凝胶电泳等特定 方法 分 离结 合 与未 结合 靶标 的核酸 序列 由于 此时的文库中可能含有与分离介质结合的核酸序列 , 它们 的存 在 将会 增加 筛选 的轮次 , 甚至 导致 筛选失
败 , 因此 需 要反 筛选 与靶 分 子结合 的核 酸序 列 , 以
用茶碱筛得的核酸适体与茶碱的亲合力是其与咖啡 因的 倍 , 尽管 两 者 的结构 只 在 嚓吟 环 位
置上相 差一个 甲基 。
稳 定性好
核 酸适 体 的化学 本 质是 核酸 , 它
能 够 耐受 非 生 理状 态 的 温度 、 酸 碱 度 和 离子 强 度 ,
变性 与 复性可 逆 , 冻成 干粉后 可 室温保 存 数年 , 而 抗体本质是 蛋 白质 , 容易变性失 活 。 分子 量小 酸适体 的分子量小 适 用于高通 量筛 选 。 核 酸适 体存 在的 不足 与 问题 尽管核 酸适 体具 有诸 多优点 , 但 也存 在某 些不 同抗 体 相 比 二一 巧 , 核 , 在体 内具有很
富集系统进 化技术 和 料的
,
酸适 体是 一种 功能类 似抗 体 的新 型仿 生生 物识 别分
子 , 它的获 取不 依赖 于生 物体 或细 胞 , 所 以又被 称
〔 '刃 运 用 该 技 术 筛选 到 针对 有 机小 分 子 染 寡核 昔酸 , 并命 名为 “ ' , 该词 由
核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展
核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展
李亚楠;赵洁;张傲哲;谭琰;华茜;张子剑
【摘要】Aptamers are single-stranded oligonucleotides that are screened by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)in vitro,which can selectively bind to different target with high affinity and high specificity,including protein,small molecules, organic
compound,metal ions,drugs,etc. This technology has attracted more attentions for its advantages and thus it has been applied widely in many aspects such as biological sensor,gene chip,new drug development,nano technology,etc. However,the traditional SELEX method is cumbersome,which usually takes several months to screen out the target
of nucleic acid in high specificity. With the rapid development of SELEX,many novel screening methods have emerged in recent years. The screening cycle and the screening efficiency are improved with these new methods,and the application of aptamers is expanded. This review introduces several new screening methods in recent three years, including multiple GO-SELEX,SWCNTs-assisted cell-SELEX,on-chip Cell-
核酸适配体技术研究
前景展望
核酸适配体（Aptamer）是一类新型的识别分子。 与单克隆抗体相比，其分子量较低（15-50碱基）， 没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构 改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复 性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望 取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用 。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面 开展核酸适体的研究工作： 1.首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物 活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的 分析方法。而不囿于现有适体的缺乏。 2.研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结 构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳 定性、增加在复杂生物体系中特异性。 3.针对应用的需要，发展更巧妙、更简便的适体分子 探针；构建方便、实用的检测方法（如目视比色分 析、传感分析、原位成像分析等）。 4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别 分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于 生命活体分析。
随机核苷酸链
是在反义核苷酸链的作用基础上发展来 的。随机核苷酸链作用的靶序列除了核 酸外还可以是蛋白质、有机小分子等。 随机核苷酸链一般比反义核苷酸链要长, 而且它们折叠形成的空间结构也往往发 挥作用。
核酸适体简介
适配体的特点
• 适配体具有与抗体相似的性质,并且有优于
抗体的特点:
核酸适配体药物的研究进展
生命科学仪器2020第18卷/12月刊综述
核酸适配体药物的研究进展
刘珊，肖楠，王睿，邓玉林，李玉娟+
(北京理工大学生命学院北京100081 )
摘要：核酸适配体（A ptam er)通常是利用指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，能够与其靶标特异性结合，核酸适配体可用作药物，核酸适配体特异性结合其靶标如蛋白质、多肽、小分子等，从而抑 制其生物学功能，影响其活性，达到治疗疾病的效果=近年来，核酸适配体药物应用于眼部疾病、肿瘤、血液类疾病、心血管类疾病等诸多领域本文对已进人临床期或上市的多种核酸适配体药物进行综述，期望为后续核酸适配体药物研 发、临床试验等提供参考。
关键词：核酸适配体；药物；临床试验；疾病
中图分类号：R917 文献标识码：A D O M O.11967/2020181202
Research Progress of Aptamer Drugs
Liu Shan, Xiao Nan, Wang Rui, Deng Yulin, Li Yujuan
(School o f L ife Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)
Abstract: Aptamer is an oligonucleotide fragment selected from the nucleic acid molecular library by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamer can be used as drugs, it also can bind to its target specifically, such as proteins, peptides, and small molecules. Aptamer can inhibit the biological function of the target, affect its activity, and ultimately treat the diseases. In recent years, aptamer drugs have been used in many fields such as eye diseases, tumors, blood and cardiovascular diseases. We have summarized aptamer drugs entering the clinical stage, hoping to provide some references for the subsequent research and clinical trials of aptamer drugs.
生物化学-核酸适配体及其在检测领域中的应用
核酸适配体及其在检测领域中的应用
（学号姓名）
南京师范大学化学与材料科学学院
摘要：核酸适配体是一段DNA或者RNA序列，是利用体外筛选技术——指数级富集配体系统进化技术从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，该片段能与目标分子作用产生特殊的构象形式，对目标分子具有高度亲和力和专一的识别能力。核酸适配体通常由化学合成，不依靠生物；价格便宜；且易于保存；而且标记后的核酸适配体一般与目标分子的结合力不会改变。因此基于核酸适配体的生化检测技术到人们极大的关注[1]。本文基于对核酸适配体的基本了解，通过对SELEX技术及对核酸适配体在检测领域中的研究进展的了解做了简单的概述。
关键词：核酸适配体，检测
0 引言
核酸适配体是寡核苷酸DNA或RNA，长度一般为20-80个核苷酸，它对很广范围内的物质都具有极强的亲和性能和特异性能，这些物质如药物类、蛋白质类、碳水化合物、氨基酸、类脂、有机分子或者是无机分子类以及其它的小分子。核酸适配体的出现，使抗原抗体的反应发生了革命性的变化，它大大弥补了现有抗体的不足，也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。[2]
SELEX技术即指数级富集配基系统进化技术。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。自Tuerk 等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。
1 发现核酸适配体的技术——SELEX技术
核酸适配体，是指一小段能与相应配体专一性紧密结合的寡核苷酸序列，一般由几十个核苷酸组成，可以是DNA也可以是RNA，最早是由Tuerk和Gold 发现的。1990年，Tuerk等提出了一种新的体外筛选和扩增核酸的方法，命名为
核酸适配体筛选技术研究进展
核酸适配体筛选技术研究进展
许涛;彭智辉;王泽峰;周佳琪;邓乐
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2018(029)001
【摘要】核酸适配体是一段特殊的寡核苷酸配基,对靶标有亲和力和特异性.核酸适配体发展十分迅速,但筛选方法的研究相对来说还不能满足适配体应用的需求.笔者从筛选过程出发,针对近年来较为新颖热门的非天然核苷酸替代传统核苷酸、镜像核酸库代替核酸库等核酸库优化方法,毛细管电泳筛选、微流控芯片技术、微阵列芯片、粒子展示等筛选策略改进技术,高通量测序等次级文库序列分析,碱基突变与修饰、序列截短等适配体结构优化等具体内容进行总结,探讨各种方法的研究进展及应用前景.
【总页数】7页(P134-140)
【作者】许涛;彭智辉;王泽峰;周佳琪;邓乐
【作者单位】湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081
【正文语种】中文
【中图分类】Q75
【相关文献】
1.核酸适配体筛选技术快速检测重金属超标 [J], ;
2.用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立[J], 李慧;邵宁生;赵强;梁超;丁红梅;李洁;黄皑雪;苏雪婷;张令强;李少华
核酸适体的筛选制备及分析应用
核酸适体的筛选制备及分析应用
刘腾飞;杨代凤;邓金花;董明辉;邓青青
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2013(000)004
【摘要】核酸适体(Aptamer)是通过配体指数富集系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列,它可以和不同的靶标,如小分子物质、蛋白质、药物及抗生素等进行高亲和力和高特异性的结合.由于靶分子范围广、相对稳定、易体外合成和修饰等特性,核酸适体在疾病检测、临床治疗、生化分析、药物研发等领域得到了广泛应用.以农药为靶标的核酸适体技术在农药残留检测中也得到了初步应用.总结相关文献,介绍核酸适体的发现、特点及其筛选方法的基本原理和筛选过程中的主要分离方法,列举核酸适体在农药、抗生素、金属离子、生物毒素、微生物以及蛋白质检测中的应用,并对核酸适体的检测应用进行展望.
【总页数】10页(P39-48)
【作者】刘腾飞;杨代凤;邓金花;董明辉;邓青青
【作者单位】苏州农业职业技术学院,苏州215008
【正文语种】中文
【相关文献】
1.农药分子核酸适体筛选研究进展及其在生物传感器中的应用 [J], 邓中日
2.核酸适体在自组装法制备石墨烯/金纳米复合薄膜上的固定及凝血酶的检测 [J], 张治红;刘顺利;康萌萌;张圆厂;何领好;冯孝中;闫福丰
3.CA125抗原核酸适体的筛选及鉴定 [J], 黄百海;何雷;李保林;修尘林;赵运旺
4.肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体的筛选及其鉴定 [J], 何雷;赵运旺;李保林;安晓刚
5.功能化核酸适体的筛选及分子识别应用 [J], 吉采灵;程兴;谈洁;袁荃
核酸适配体技术和其在药物研发中的应用前景
核酸适配体技术和其在药物研发中的应用前
景
随着生物技术的发展，核酸适配体技术（Nucleic acid aptamer technology）的应用逐渐趋于成熟并广泛应用在生物医药领域。核酸适配体技术是指利用单链寡核苷酸从众多核苷酸序列中筛选出具有特定亲和力的分子配位体，从而达到识别、结合、干预和控制特异分子的目的。当前，基于核酸适配体技术研发的药物已然成为生物医药行业的重要组成部分，其在癌症、肝炎、心血管疾病等多个领域有着广泛应用前景。
一、核酸适配体技术的原理
核酸适配体技术的核心是筛选出具有亲和力的核酸寡链分子。它可以高度特异性检测和识别某种分子并与之结合。核酸适配体技术首次被报道于1990年代，随着技术的不断进步，核酸适配体技术的应用逐渐为人所熟知。
具体而言，核酸适配体技术包括两个主要步骤：筛选和化学合成。在筛选的过程中，针对目标分子的核酸库中的核酸适配体与该分子互相竞争结合，并不断筛选出具备高亲和力的寡核苷酸序
列。而在化学合成的过程中，则针对筛选出的核酸适配体序列进
行人工合成。通过这两个步骤的相结合，可以得到拥有高度亲和
力的核酸适配体。
二、核酸适配体技术在药物研发中的应用
核酸适配体技术在药物研发中的应用，主要表现在开发抗肿瘤
和心血管疾病等领域的药物。目前，许多核酸适配体药物已进入
临床试验阶段。
例如，一款名为Pegaptanib sodium的药品是迄今为止最成功的
核酸适配体药物之一。该药品是一种用于治疗年龄相关性黄斑变
性（AMD）的抗VEGF核酸适配体。它能够可靠、有效地抑制VEGF，从而减缓AMD症状进展。
核酸适配体体外筛选技术导则
核酸适配体体外筛选技术导则
核酸适配体体外筛选技术导则
一、导言
核酸适配体体外筛选技术是一种用于筛选与特定目标分子相互作
用的核酸分子的方法。本导则旨在为研究人员提供关于核酸适配体体
外筛选技术的指导，以确保实验操作的严谨性、科学性和安全性。为
了保证实验结果的可靠性和可重复性，使用者应严格按照下述导则进
行操作。
二、实验室要求
1. 实验室环境应符合生物安全标准，并保持清洁、整洁。
2. 实验室必须设有相应的安全设施，包括但不限于洗眼器、紧急淋浴
和灭火设备等。
3. 实验室应制定并实施核酸废物的处理方案，避免对环境和人员的污染。
三、实验操作
1. 实验前应认真阅读相关文献，了解适配体库的构建方法和筛
选技术的原理。
2. 在操作过程中，应严格遵守实验操作规范，避免交叉污染。
3. 使用者应按照实验方案准备所需试剂和仪器，并确保其质量和纯度
符合要求。
4. 在实验过程中，应随时记录实验条件、操作步骤和结果等重要信息，以备后续分析和验证。
5. 实验完成后，应及时清理实验台面和实验器材，避免污染和交叉感染。
四、结果分析与验证
1. 实验结果应经过多次独立重复实验以验证其可靠性和可重复性。
2. 实验结果应与既有的相关数据进行比较和分析，并进行统计学处理
和验证。
3. 可使用合适的实验方法（如荧光检测、凝胶电泳等）对筛选结果进行验证，以确保结果的准确性和可信度。
五、数据和结果报告
1. 实验数据应以明确、准确的形式记录并保存，包括但不限于实验条件、实验操作、分析结果和报告等。
2. 实验结果的报告应详细描述实验所采用的方法、分析过程和结果，并进行充分讨论和解释。
适配体的筛选技术
适配体的筛选技术——SELEX
[摘要] 适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸（RNA或DNA），其可形成的特殊的立体结构如以辨识特定的蛋白质。在一定环境下, 单链DNA 或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。在大多数情况下, 溶液中的单链DNA 或RNA 的空间构象是不确定的, 当有目标分子存在时, 在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠, 形成发夹( hairpin) 、假结( pseudokno t ) 、凸环( bulg e) 、G-四分体( G-quar tet ) 等特殊结构, 通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合。这种结合不需要依靠通常的核糖磷酸骨架的亲和力, 而且靶物质既可以是蛋白质, 也可以是多肽及小分子物质。这种寡核苷酸片段被称为适配体。适配体的产生是借由一种指数富集配体的系统进化技术
( systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。SELEX是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸配体( ap tamer) , 其解离常数可以与单克隆抗体媲美。经过十几年的发展, SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等众多研究领域, 并且衍生出了混合靶SELEX、体内SELEX、基因组SELEX等各种子技术。随着基因组学和蛋白质组学的深入开展, SELEX技术会有更广泛的应用前景。
适配体的筛选技术
适配体的筛选技术——SELEX
[摘要] 适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸（RNA或DNA），其可形成的特殊的立体结构如以辨识特定的蛋白质。在一定环境下, 单链DNA 或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。在大多数情况下, 溶液中的单链DNA 或RNA 的空间构象是不确定的, 当有目标分子存在时, 在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠, 形成发夹( hairpin) 、假结( pseudokno t ) 、凸环( bulg e) 、G-四分体( G-quar tet ) 等特殊结构, 通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合。这种结合不需要依靠通常的核糖磷酸骨架的亲和力, 而且靶物质既可以是蛋白质, 也可以是多肽及小分子物质。这种寡核苷酸片段被称为适配体。适配体的产生是借由一种指数富集配体的系统进化技术
( systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。SELEX是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸配体( ap tamer) , 其解离常数可以与单克隆抗体媲美。经过十几年的发展, SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等众多研究领域, 并且衍生出了混合靶SELEX、体内SELEX、基因组SELEX等各种子技术。随着基因组学和蛋白质组学的深入开展, SELEX技术会有更广泛的应用前景。
核酸适配体筛选方法研究进展
核酸适配体筛选方法研究进展
韩小东;符兆英;郭姝彤;张正祥
【摘要】指数富集的配基数系统进化(SELEX)技术的基本过程是用化学方法合成一个单链寡核苷酸库,将之于与靶标物质混合,寡核苷酸链与靶标物质结合形成复合物,去除未结合的核酸链后,再将结合的核酸分子与靶标物质分离,以此寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,用其产物进行下一个循环的筛选.经过数次循环,即可得到能与靶标物质高亲和力高特异性结合的核酸适配体分子.本文综述了SELEX技术筛选核酸适配体技术的一些研究进展.
【期刊名称】《陕西医学杂志》
【年(卷),期】2018(047)003
【总页数】3页(P407-409)
【关键词】@指数富集的配基数系统进化;@核酸适配体;寡核苷酸类;筛选
【作者】韩小东;符兆英;郭姝彤;张正祥
【作者单位】延安大学医学院,延安716000;延安大学医学院,延安716000;延安大学医学院,延安716000;延安大学医学院,延安716000
【正文语种】中文
【中图分类】R392.1
·综述·
*国家自然科学基金资助项目(81760732)
陕西省科学技术研究发展计划项目(2016SF-280)
△通讯作者
自从上世纪90年代L. Gold 和J.W. Szostak创立了用指数富集的配基系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术或
体外筛选(In vitro selection)技术制备寡核苷酸适配体(Aptamer)以来，适配体或
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本技术公开了一种黏附素适配体及筛选该黏附素适配体的方法，本技术以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，扩增得到其黏附素基因，将得到的基因与表达载体连接获得筛选靶标，再将筛选靶标与随机单链ssDNA文库孵育，SELEX筛选，PCR扩增文库，然后经多轮筛选得到黏附素核酸适配体。本技术还公开了该黏附素适配体在制备幽门螺杆菌的检测试剂盒以及制备幽门螺杆菌免疫药物中的应用。本技术的黏附素核酸适配体具有较高的亲和力与特异性，分子量小、渗透性强，相对现有技术能够更直观的反应机体感染Hp的状况。
技术要求
1.一种黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；或含有以下任意一种核苷酸序列：与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列同源性在60％以上、与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列进行杂交的序列、SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列转录的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被甲基化、巯基化、磷酸化、氨基化或同位素化。
3.根据权利要求1或2所述的黏附素核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、治疗性物质、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
4.一种权利要求1所述的核酸适配体的的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到幽门螺杆菌黏附素(Hpa A)基因；
(2)将得到的基因与表达载体Pet28a质粒经酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌E.coli BL21菌株并诱导表达，裂解细菌，纯化，获得的重组粘附素Hpa A即为筛选靶标；
(3)将步骤(2)得到的黏附素Hpa A与ssDNA文库进行孵育，收集与筛选靶标结合的ssDNA；
(4)将得到的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA；
(5)得到的dsDNA与pUC19质粒经酶切后连接，并转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株；
(6)选取阳性克隆测序，并验证阳性克隆扩增得到的ssDNA与Hpa A的结合力，得到核酸适配体。
5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中Hpa A引物序列为：
F:5’-CGGATCCTGCAGCCCGCATATTATTG-3’；
R:5’-CAAGCTTTCGGTTTCTTTTGCCTTTT-3’。
6.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，ssDNA文库包括序列：
5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-N45-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’；
引物P1：5’-CGGATCCATCCAGAGTGACGCAGCA-3’；
引物P2：5’-GAAGCTTACTAAGCCACCGTGTCCA-3’。
7.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，将纯化的粘附素Hpa A包被于聚苯乙烯微孔中，然后将合成的ssDNA文库溶于筛选缓冲液投入其中，洗下结合的ssDNA作为下一轮的模板；第五轮后以空白孔为负向筛选介质。
8.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备检测幽门螺杆菌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。
9.一种幽门螺杆菌检测试剂，其特征在于，含有权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体。
10.权利要求1-3任意一项所述的黏附素核酸适配体或其衍生物在制备抗幽门螺杆菌疫苗中的用途。
技术说明书
粘附素核酸适配体及其筛选方法和应用
技术领域
本技术涉及核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测幽门螺杆菌的核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
核酸适配体是采用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物酸适配体具有亲和力高、性能稳定、分子量低、免疫原性低、易于修饰改造且无毒副作用等优点。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori，Hp)感染与胃癌的高发密切相关，全球Hp感染率约为50％，亚洲地区感染率高达70％，我国的平均感染率约为59％黏膜上皮细胞结合定植于胃黏膜层。黏附过程中Hp能够激活胃黏膜上皮细胞内多种信号通路并分泌多种致病相关因子，继而引发细胞增生、凋亡、过度炎症此可见，Hp与胃粘膜上皮细胞的黏附是其侵袭机体致病过程的关键环节。
Hp进行黏附的物质基础为黏附素，黏附素的种类较多且在黏附过程中占主导地位。目前发现有多种Hp黏附素蛋白(如Hpa A、Bab A、Sab A、Alp A/B、Oip A 其定植作用。其中Hpa A在Hp在定植、致病各阶段中均发挥及其重要的作用，且有望成为幽门螺杆菌检测、预防的靶标。因而筛选黏附素相应的配基，通过因此，利用SELEX的特性针对Hpa A筛选出相应的配基对胃黏膜内Hp诊疗有非常重要的意义。
目前临床针对Hp的感染的检测主要以C14呼气试验和快速尿酶试验为主要手段，其原理主要基于Hp尿素酶催化尿素分解。但是C14呼气试验因为有一定的放射近期内服用过抗生素及空腹程度也会对呼气试验结果的判读造成影响。而快速脲酶实验往往会因为取材中Hp数量的关系以及近期服用抗生素造成一定程度的检测更为广泛，但是其对患者病程的判断仍然存在不足。而且目前培养技术仍未能标准化、商品化，亟待一种能够对以上方法进行补充的检测手段。
技术内容
针对现有技术中的缺陷，本技术提供一种特异性靶向粘附素Hpa A的适配体，还提供了上述黏附素适配体的筛选方法，其基于SELEX技术，针对黏附素Hpa A 探索该方法进行胃黏膜内Hp诊疗的可行性奠定了基础。
为了实现上述目的，本技术采用了下述技术方案：
一种黏附素核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或含有以下任意一种核苷酸序列：与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列进行杂交的序列、SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列转录的RNA序列。
进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列被甲基化、巯基化、磷酸化、氨基化或同位素化。
进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列上连接有荧光物质、治疗性物质、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。
一种上述的核酸适配体的的筛选方法，包括以下步骤：
(1)以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到幽门螺杆菌黏附素(Hpa A)基因；
(2)将得到的基因与表达载体Pet28a质粒经酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌E.coli BL21菌株并诱导表达，裂解细菌，纯化，获得的重组粘附素Hpa A即为筛
(3)将步骤(2)得到的黏附素Hpa A与ssDNA文库进行孵育，收集与筛选靶标结合的ssDNA；
(4)将得到的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA；
(5)得到的dsDNA与pUC19质粒经酶切后连接，并转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株；
(6)选取阳性克隆测序，并验证阳性克隆扩增得到的ssDNA与Hpa A的结合力，得到核酸适配体。
进一步地，步骤(1)中Hpa A引物序列为：