番茄斑萎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与分析

。据报道 , 该
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病曾在美国花生上造成接 近 95% 的损失
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, 在夏
。 1984 年, 在 我国南 方花 生病 害
, 而在 法国 和
调查时 发 现 由 番茄 斑 萎 病 毒 ( T SWV ) 引 起 新 病 害 [ 15] , 随后陆续在番 茄 ( 四川 ) 及甜菜 ( 内蒙古 ) 上
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。由于其危害性严重 , 经济损失日益加大 ,
已被作为检疫性病害。近年来 , 随着西花蓟马在我 国部分地 区的 传播 扩散 [ 20 23] , 番茄 斑萎 病 毒的 发 生情况也备受人们关注。 2009 年作者从云南昆明 半开放型大棚 内的番 茄上采集了样本 , 且在采样棚内发现传毒介体 症状 , 本文对其 N 基因进行了克隆分析。 西 花蓟马, 该样品温室接种三生烟后表现典型的环斑
通过比较 GenBank 中 T SWV 核衣壳蛋白基因 序列, 用 DNAM AN ( V6. 0. 3. 40) 设计 T SWV 核衣 壳蛋白基因 ( N 基因 ) 全长序列引物 , 其引物序列为: 上 游 5 AT GT YT AAGGT T AAGCT CACT AAG 3 ; 下游 5 T T AAGCAAGYY CT GYGA GT T T T GCC 3 ( Y= C 或 T ) 。 1 . 2. 3 . 2 cDNA 合成 mo l/ L ) , 置 于 PCR 仪 中 95 缓 冲 液, 2 保温 取 9 L 提取的番茄斑萎病毒 RNA 加 1 L 上 游引 物 ( 20 5 m in, 然 后 迅 速放 到 冰 上, 1 ~ 2 m in, 加 混 合 物 ( 5 L 反转录酶 5 dNT Ps, 0. 2 25 L , 置于 42 L 2 m mol/ L 的 L 反 转 录 酶 ) , 加 灭 菌 ddH 2 O 至 下 45~ 60 min, 以此 为模板进行
Cloning and sequence analysis of the nucleoprotein genes of Tomato spotted wilt virus isolates from Yunnan
T ang Qianjun 1 , Sun Shue2, 3 , L iu Y o ng2, 3 , T an X inqiu2 , X ia o Q im ing1 , X ie Bing ya n4 , Z hang De yo ng 2, 3 410128, China ; ( 1. Co llege o f Bio sa fety Science and Techno lo gy , Huna n A gricultur al Univer sity , Cha ngsha 2. I nstitute o f Plant Pr otection , Huna n Aca demy o f Agricultura l Sciences, Cha ngsha 3. Lo ngping Branch of G r aduate Scho ol , Centr al South University , Changsha 4. I nstitute of Vegetables and Flo wers , Chinese Academ y of Agr icultura l Sciences, Beijing Abstract
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萎病毒
。 2000 年 , 张仲凯等在研 究云南烟草 病
毒病原中发现 T SWV 在 云南烟区 广泛分布 , 主 要 引起斑块 状褪 绿、 黄化、 坏死 及灼 烧状 等症 状, 在 局部地区 可造 成 60% 以上 的 严重 损 失
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。 2004
年, 丁铭在昆明地区栽培的马铃薯病株上分离鉴定 出含有番茄斑萎 病毒属番茄斑 萎病毒和花生环 斑 病毒
收稿日期 : 基金项目 : * 通信作者
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,随
, 但番
茄斑萎病毒最早由 Samuel, Bald 和 P it tm an 于 1930 年首次正式 报道 [ 10] 。至 今 , 番茄 斑萎 病毒 病已 广 泛分布于世界各 地, 欧洲、 亚洲、 非洲、 美洲及大 洋 洲均有分 布
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66 发现
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2010 。1992 年 , 姚革在四川烟叶 上发现番茄 斑
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用缓冲液接种植株作对照。 1 . 2. 1 . 2 番茄斑萎病毒的纯化 将带毒叶片用接种缓冲液研磨后采用摩擦汁液 接种的方法接种于鉴别寄主矮牵牛 ( P et unia hy bri da ) , 接种 2~ 4 d 后便出现局部褐色斑, 将单个的褐 色斑点剪下 , 用接种缓冲液研磨接种于三生烟 , 出现 系统症状后 , 再接种于矮牵牛, 经 3 次单斑纯化后接 种于三生烟上保存。 1 . 2. 2 植物总 RN A 的提取
[ 9] [ 8]
番茄
斑萎病毒 ( T omato sp otted w il t virus , T SWV) 命名 。T SWV 是 T osp ovi rus 属 中最重 要的一 种 病毒 , 侵染 82 科 900 多种单、 双子叶植 物, 广泛 分 布于世界各地 的温带、 亚热带及热带地 区, 对许 多 经济作物及庭院植物造成严重损失 威夷造成 50% ~ 90% 的 莴苣死 亡
410125, China ; 100081, China )
410125, China ;
Tom ato spotted wilt virus ( T SW V ) wa s detected via R T PCR fr om to mato w ith mo ttle sympto m co l
番茄斑萎病毒 ( T osp ov irus) 属于布尼亚病毒科 ( Bunuyaviridae) , 是 Bunyaviridae 中 唯 一一 个 侵 染 植物的属 , 属名由该属内银莲花产生毁灭性危害[ 6] 。 T SWV 以其广泛的寄主范围和造 成的巨大经济 损 失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一[ 7] 。 早在 1919 年 , 在澳大利亚首次发现了斑萎病 后 , 发现了斑萎 病的传毒 介体 西花 蓟马
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材料与方法
材料与试剂 材料采自云南省昆明, 在湖南省植物保护研究
所分子生物学实验室温室种植的三生烟上繁殖, 实 验所用 T aq 酶、 反转录 酶均购自 F erm ent as 公 司, pGEM T Vect or 购自 P romega 公司 , PCR 纯 化回 收试剂盒为上海生工公司产品, P CR 引物由上海生 工公司合成。抗生素 ( 氨苄青霉素) 购自上海生工公 司, 其他化学试剂均为国产分析纯试剂。大肠杆菌 ( E. col i) NM 522 菌株由湖南省植物保护研究所分 子生物学实验室保存。 1. 2 方法 番茄斑萎病毒的接种 1. 2. 1 番茄斑萎病毒的接种与纯化 1. 2. 1. 1 取样品病叶少许 , 放于研钵中。加入适量接种 缓冲液[ 0. 1 mo l/ L NaH 2 PO 4 / Na 2 H P O4 pH 7. 0; 质 量浓 度 2% Poly viny lpy rolidon; 质 量 浓 度 0. 2% Na2 SO 3 ] , 用 研 棒充 分 研 磨。用 喷 粉 器将 金 刚 砂 ( 200~ 400 筛目) 撒至待接种的叶表面 ( 也可直接将 金刚砂加在研磨液中 ) , 用铅笔在接种叶上打点做标 记, 并在瓦钵内插上标签 , 注明时间及处理。用手指 或棉球、 纱布和研棒蘸取少许汁液, 在待接种植株的 叶面上从叶基到叶尖方向轻轻地、 均匀地涂擦 , 涂擦 前用肥皂洗净手指, 涂擦时用另一只手托住叶片, 涂 擦后用清水冲洗接种过的叶片 , 将植株于温室 ( 22~ 25 ) , 光照周期 L D= 16 h 8 h 条件下 培养。
取叶片组织每 0. 3 g 加 3 mL GB 溶液研磨, 取 500 L 研磨液加入 100 L 10% 的月桂酰醇 ( NL S) , 置于 70 , 10 min( 不时摇动 ) , 冰浴 5 min, 室温下 13 000 g 离心 10 min, 取 300 L 上清, 加 150 L 无水 乙醇, 300 L NaI 溶液, 25 L 硅溶液( 2 mol/ L SiO2 , pH2. 0) , 混匀( 硅溶液要充分混溶后再加) , 置于室温 10 min, 不停摇动, 室温下 6 000 g 离心1 min, 弃上清, 加 WB 溶液洗涤 2 次, 室温下 6 000 g 离心 1 min, 弃 上清, 沉淀加 150 L 灭菌 ddH 2 O, 置于 70 温下 13 000 g 离心10 min, 取上清 , - 20 1 . 2. 3 1 . 2. 3 . 1 RT PCR 的引物设计 反转录 聚合酶链式反应( RT P CR) 4 min, 室 保存备用。
lecte d f ro m Y unnan. T he N g ene, encoding nucleo pr o tein, w as cloned a nd sequenced. Sequence and analysis re sults indicated that the N g ene wa s 777 bp in length and encoded 258 a mino acids. Se quence analyse s sho wed N gene share d 99% and 97% nucleo tide identities w ith the isolates fr o m South K or ea and T aiw an, re spectiv ely. In amino a cid le vels, the sequence ide ntity was 99% and 98% , re spe ctiv ely. Ke y words T oma to spot ted wilt vir us ; nucleo pr o tein; clo ne