果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定(一)
福建师范大学14春学期课程考试《分子生物学》作业考核试题
福建师范大学网络学院《分子生物学》期末考试一．名词解释1．增色效应：当DNA 变性时吸光度增加的现象。
2．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。
3．DNA半不连续复制：一条新链连续合成而另一条链不连续合成的模式。
4．操纵子：细菌基因表达和调控的单位，包括结构基因和能被调控基因产物识别的DNA 控制元件。
5．增强子：是一个顺式作用序列，能够提高一些真核生物启动子的利用，并能够在启动子任何方向以及任何位置（上游或者下游）作用。
6．核小体：染色质的基本结构亚单位，由200bpDNA和组蛋白质八聚体组成。
7．核糖体：核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒, 其功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链，所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器。
8．启动子：结合RNA 聚合酶并起始转录的DNA 区域。
9．终止子：转录本后部所代表的DNA 序列，能够引起RNA 聚合酶终止转录。
10．DNA克隆：指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入适当细胞内，使其在细胞扩增和繁殖，从而获得该DNA分子大量拷贝的过程称为分子克隆，又叫基因克隆或重组DNA技术。
二．请选择正确的选项1．以下哪个是核蛋白（ B ）A．角蛋白B．染色质C．组蛋白D．蛋白聚糖2．DNA中的一段5''-AGTCTGACT-3''序列等同于RNA中的哪一段（ D ）A．5''-AGUCUGACU-3''B．5''-UGTCTGUTC-3''C．5''-UCAGUCUGA-3''D．5''-AGUCAGACU-3''3．DNA解链温度是指（ B ）A．A260nm达到最大值时的温度B．A260nm达到最大值50％的温度C．DNA开始解链时所需要的温度D．DNA完全解链时所需要的温度4．1953年Watson和Crick提出（ A ）A．多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋B．DNA的复制是半保留的，常常形成亲本－子代双螺旋杂合链C．三个连续的核苷酸代表一个遗传密码D．遗传物资通常是DNA而非RNA5．以下哪一个在260nm波长下具有最大的单位质量吸收（ B ）A．双链DNAB．单核苷酸C．RNAD．蛋白质6．pUC系列载体是第一次利用蓝-白斑进行筛选的载体，蓝-白斑筛选被用于（ B ）A．检测外源DNA片段是否在细菌中表达B．检测质粒是否插入外源DNA片段C．检测细菌是否含有质粒D．提示克隆化外源DNA片段的性质7．.以下哪一个是大肠杆菌和真核生物染色体的共同之处（ D ）A．DNA是环状的B．DNA被包装成核小体C．DNA位于核中D．DNA是负超螺旋8．反密码子中哪个碱基对参与了密码子的简并性（摇摆）（ A ）A．第一个B．第二个C．第三个D．第一个和第二个9．PCR扩增目的片段时，在第几个循环后才出现目的片段长度的双链DNA分子（C）A．第一个循环B．第二个循环C．第三个循环D．第四个循环10．原核生物中，后随链的引物是被（ C ）清除的A．3’至5’外切核酸酶B．DNA连接酶C．DNA聚合酶ID．DNA聚合酶III11．.原核生物启动序列－10区的共有序列称（ C ）A．TATA盒B．CAAT盒C．Pribnow盒D．GC盒12．由146bp DNA片段，组蛋白八聚体构成的复合体称为（B）A．核小体B．核小体核心C．核糖体D．螺线管13．人体中的脱辅基脂蛋白B在肝细胞中产生一个512kDa的载脂蛋白B100，而在肠细胞中，由于脱辅基脂蛋白B前mRNA 第6666位的一个碱基C变换为U，结果产生一个终止密码子，因此在肠细胞中，脱辅基脂蛋白B只产生一个241kDa的截短的载脂蛋白B48，产生这种现象是因为（ B ）的结果A．RNA可变剪接B．RNA编辑C．RNA翻译后加工D．偶然突变14．某限制性内切酶酶切割5 ’ …GG↓AATTCC…3 ’序列后产生（ A ）A．5 ’突出末端B．3 ’突出末端C．5 ’ 及3 ’突出末端D．平末端15．原核生物的起始氨基酸是（ A ）A．甲酰甲硫氨酸B．甲硫氨酸C．组氨酸D．色氨酸16．下面哪个结构域是DNA结合结构域（ A ）A．螺旋-转角-螺旋结构域B．螺旋-环-螺旋结构域C．亮氨酸拉链D．酸性激活结构域17．DNA光复活修复中哪种酶起关键作用（ A ）A．DNA光解酶B．烷基转移酶C．DNA糖基化酶D．AP内切核酸酶18．转化是（ A ）A．细菌吸收一个质粒B．细菌表达一个基因C．细菌吸收一个噬菌体D．从细菌中分离一个质粒19．一种细菌mRNA 由360个核苷酸组成，它所编码的蛋白质长度是（ D ）A．约360个氨基酸B．约1080个氨基酸C．120个氨基酸D．少于120个氨基酸20．SV40基因组是（ B ）A．双链线状DNAB．双链环状DNAC．单链线状DNAD．单链环状DNA三．问答题1.请简述遗传密码的特性答:(1)、密码子的连续性（无标点、无重叠）(2)、密码子的简并性(3)、密码子的摆动性（变偶性）(4)、密码子的通用性（近于完全通用）2.请简要说明cDNA文库构建的步骤答:cDNA文库的构建的步骤分为六个阶段。
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。
果蝇在遗传学中的应用
果蝇在遗传中的应用及最新进展摘要：随着遗传学的发展，果蝇也经历了由发现、利用，到重视，再到发展前景的演变过程。
在这一演变过程中，果蝇与遗传学相互融合、共同发展、共同进步，果蝇在不断被利用、遗传学的研究也不断更新。
果蝇对于遗传学的发展来说付出了不可磨灭的贡献。
关键词：果蝇;遗传学;研究果蝇是果蝇科果蝇属昆虫。
约1,000种。
广泛用作遗传和生物演化的研究材料。
关于果蝇的遗传资料收集得比任何动物都多。
用果蝇的染色体，尤其是成熟幼虫唾腺中最大的染色体，研究遗传特性和基因作用的基础。
对果蝇在自然界的生物学了解得还不够。
有些种生活以腐烂水果上。
有些种则在真菌或肉质的花中生活。
黑腹果蝇在1830年首次被描述。
而它第一次被用作试验研究对象则要到1901年，试验者是动物学家和遗传学家威廉·恩斯特·卡斯特。
他通过对果蝇的种系研究，设法了解多代近亲繁殖的结果和取自其中某一代进行杂交所出现的现象。
1910年，汤玛斯·亨特·摩尔根开始在实验室内培育果蝇并对它进行系统的研究。
之后，很多遗传学家就开始用果蝇作研究，并且取得了很多遗传学方面的知识，包括这种蝇类基因组里的基因在染色体上的分布。
随着遗传学的发展，果蝇也经历了由发现、利用，到重视，再到发展前景的演变过程。
在这一演变过程中，果蝇与遗传学相互融合、共同发展、共同进步，果蝇在不断被利用、遗传学的研究也不断更新。
果蝇对于遗传学的发展来说付出了不可磨灭的贡献。
一、果蝇的基本信息1、外观特征：体型较小，身长3～4mm。
近似种鉴定困难，主要特征是具有硕大的红色复眼。
雌性体长2.5毫米, 雄性较之还要小。
雄性有深色后肢，可以此来与雌性作区别。
2、分布范围：果蝇类昆虫与人类一样分布于全世界，并且在人类的居室内过冬。
由于体型小，很容易穿过砂窗，因此居家环境内也很常见。
3、生活环境：有些种生活以腐烂水果上。
有些种则在真菌或肉质的花中生活。
在垃圾筒边或久置的水果上，只要发现许多红眼的小蝇，即是果蝇；果蝇类幼虫习惯孳生于垃圾堆或腐果上。
生物技术的原理与应用例题和知识点总结
生物技术的原理与应用例题和知识点总结生物技术是一门涉及生命科学、工程学和计算机科学等多学科交叉的领域，它旨在利用生物体或生物过程来解决实际问题和创造价值。
本文将介绍生物技术的基本原理，并通过一些具体的例题来展示其在不同领域的应用，同时对相关知识点进行总结。
一、生物技术的原理生物技术的核心原理包括基因工程、细胞工程、发酵工程和蛋白质工程等。
基因工程是指按照人们的意愿，通过对 DNA 分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，从而定向地改变生物的遗传性状。
例如，科学家们通过基因工程技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌中，使其能够大量生产胰岛素，为糖尿病患者带来了福音。
细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
植物组织培养和动物细胞融合是细胞工程中的重要技术。
通过植物组织培养，我们可以快速繁殖优良品种，拯救濒危植物；动物细胞融合技术则为单克隆抗体的制备提供了基础。
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术手段生产有用物质或直接将微生物应用于工业生产的一种技术。
发酵工程广泛应用于食品、医药、化工等领域，如生产酒类、抗生素、酶制剂等。
蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。
二、生物技术的应用例题（一）基因工程的应用例题 1：假设某种农作物容易受到病虫害的侵袭，导致产量大幅下降。
科学家通过基因工程技术，将一种能够产生抗虫蛋白的基因导入该农作物的基因组中。
经过培育和筛选，获得了具有抗虫特性的新品种。
请问这种基因工程操作的关键步骤是什么？答案：关键步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞以及目的基因的检测与鉴定。
北京市海淀区2023-2024学年高三上学期期中考试 生物含解析
海淀区2023—2024学年第一学期期中练习高三生物学（答案在最后）2023.11本试卷共10页，100分。
考试时长90分钟。
考生务必将答案答在答题纸上，在试卷上作答无效。
考试结束后，将本试卷和答题纸一并交回。
第一部分本部分共15题，每题2分，共30分。
在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。
1.孟德尔通过豌豆杂交实验研究遗传规律运用了假说-演绎法，下列叙述不属于假说的是（）A.体细胞中遗传因子成对存在B.成对的遗传因子在形成配子时彼此分离C.受精时，雌雄配子随机结合D.杂合子F₁自交后代出现3：1的性状分离比2.鸡的性别决定方式为ZW型，其胫色浅、深为一对相对性状，由I/i基因控制。
研究人员将纯种藏鸡与纯种白来航鸡进行了杂交实验，统计结果如下表所示。
下列分析，不正确的是（）亲本F₁性状表现和数目杂交组合父本母本深色雄深色雌浅色雄浅色雌I藏鸡白来航鸡01421560Ⅱ白来航鸡藏鸡004235A.亲本白来航鸡的胫色为隐性性状B.Ⅰ和Ⅱ为正反交实验，控制胫色基因位于Z染色体上C.I中父本和母本的基因型分别为Z i Z i和Z I WD.Ⅱ中F₁雌雄交配所得F₂理论上为深色雌∶浅色雄∶浅色雌=1∶2∶13.下列关于遗传学史上重要探究活动的叙述，错误的是（）A.摩尔根等通过果蝇眼色杂交实验证明基因在染色体上B.赫尔希和蔡斯通过肺炎链球菌转化实验证明DNA是遗传物质C.梅塞尔森和斯塔尔运用同位素标记技术证实DNA半保留复制方式D.沃森和克里克通过建构物理模型的方法研究DNA的结构4.下列关于真核细胞中DNA复制的叙述，正确的是（）A.仅发生在有丝分裂间期B.先解旋后复制C.DNA聚合酶解开DNA双链D.子链延伸时游离的脱氧核苷酸添加到3′端5.人类胚胎干细胞分化存在下图所示的调控机制：H基因甲基化抑制其表达，从而促进胚胎干细胞分化。
H基因转录产物为H-RNA，H-RNA上甲基化的腺嘌呤可与Y蛋白结合，使Y蛋白能够结合H基因的启动子，并招募去除DNA甲基化的T酶。
双荧光素酶报告实验原理
双荧光素酶报告实验原理一、实验背景双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统是一种常用的基因表达分析方法，它利用荧光素酶和反向转录酶的活性来定量测定转录因子对基因表达的影响。
该系统可以同时测定内部对照和实验组样品，从而减少误差和提高可靠性。
二、实验原理1. 基本原理该系统包含两种不同的荧光素酶：火萤酶（Luciferase）和海藻酸酯酶（Renilla）。
这两种荧光素酶都需要ATP作为底物，但它们分别与不同的底物反应而产生不同颜色的荧光。
在实验中，首先将感兴趣的DNA片段插入到一个启动子区域上，并将其与另一个含有Renilla基因的质粒共转染给细胞。
然后使用两种不同颜色的底物来检测这两种荧光素酶活性，从而得到相应的数据。
2. 实验步骤（1）细胞培养：将感兴趣的细胞株培养至合适密度。
（2）质粒构建：将感兴趣的DNA片段插入到一个启动子区域上，并将其与另一个含有Renilla基因的质粒共转染给细胞。
（3）荧光素酶检测：使用两种不同颜色的底物来检测这两种荧光素酶活性，从而得到相应的数据。
（4）数据分析：计算出目标基因表达量与Renilla表达量之比，从而得到相应的数据。
三、实验注意事项1. 在实验中应严格控制各步骤的时间和温度，避免对实验结果产生影响。
2. 应选择适当的细胞株和质粒，以确保实验结果准确可靠。
3. 应在实验前进行相关预处理工作，如对细胞进行转染等。
四、实验优缺点1. 优点：（1）该系统可以同时测定内部对照和实验组样品，从而减少误差和提高可靠性。
（2）该系统具有高灵敏度和高特异性，能够检测非常低水平的基因表达变化。
（3）该系统操作简单、快速、方便。
2. 缺点：（1）该系统需要使用专门的仪器来检测荧光素酶活性，成本较高。
（2）该系统的灵敏度受到许多因素的影响，如细胞株、质粒等，需要进行优化。
五、实验应用领域双荧光素酶报告系统广泛应用于基因表达分析、转录因子筛选和药物筛选等领域。
它可以帮助研究人员了解基因调控机制，并为新药研发提供有力支持。
靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR
靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR20世纪80年代初，科学家用显微注射的方法将外源DNA片段导入小鼠受精卵的原核中，构建出了世界上第一个转基因小鼠，然而该方法只能将外源DNA片段导入动物基因组中，无法对体内基因组的特定序列进行特定的修饰。
80年代后期，基于小鼠胚胎干细胞(ES细胞)及同源重组技术的发展而催生的基因打靶技术使得科学家可以对小鼠的任何基因序列进行随意的修饰。
基因打靶技术的发展使生命科学的研究发生了革命性的改变，但用此技术制备基因工程动物模型过程较长和花费较大，且由于基因的修饰是在ES细胞中进行，目前的基因打靶技术还只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。
前些年，科学家发现，两种人工改造过的核酸酶，锌指核酸酶(Zinc-finger Nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN)能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后，细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
ZFN和TALEN技术结合了原核注射的制备周期短和基因打靶技术的定点修饰的特点，可以应用到除小鼠和大鼠之外的其他生物。
但其脱靶效应(off target)，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
近年来，一种新型基因组修饰的技术——规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)受到人们的高度重视。
CRISPR是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。
科学家利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞(包括iPS)的特定的基因组位点上进行切割和修饰。
与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作、效率更高和更易得到纯合子突变体，且可在不同的位点同时引入多个突变。
7 三点测交法测定果蝇基因重组率
表4基因重组率χ2分析
重组基因
m-sn不重组
m-sn重组
w-sn不重组
w-sn重组
w-m不重组
w-m重组
O
212
40
215
37
181
71
E
214
38
203
49
172
80
(O-E)2
4
4
144
144
81
81
(O-E)2/E
0.0176
0.0989
0.710
2.93
0.470
1.015
Σ
0.117
3.64
2.3.亲本杂交：
把三隐性的母本雌蝇和野生型的父本雄蝇放入同一培养瓶中，仔细检查确认无误之后，粘贴标签，填写实验名称，亲本性状，杂交日期，实验者姓名。每个培养瓶内放入1~2对亲本果蝇为宜。培养瓶放在24℃恒温箱中饲养。
2.4.去除亲本：
果蝇杂交7～8天以后，培养瓶中开始陆续有幼虫和蛹出现，这时就要把亲本去掉。
1.19%
√
√
w
m
+
2
+
建立利用萤光素酶快速检测细胞活性的方法
建立利用萤光素酶快速检测细胞活性的方法祝静静;鲍秋颖;王宇萌;夏钢【期刊名称】《华东师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(000)005【摘要】运用PCR的方法,从萤火虫萤光素酶基因载体pGL4.26扩增萤火虫萤光素酶基因片段,将其插入连接于原核表达载体pET24a中,构建重组表达载体pET24a-Luc.经酶切鉴定及序列分析后,将重组载体转化到表达菌株大肠杆菌BL21( DE3)中,获得阳性重组菌BL21/pET24a-Luc.IPTG诱导蛋白高效表达并通过镍柱亲和层析纯化萤火虫萤光素酶.该目的蛋白活性用Bright-GloTM试剂进行验证并用于建立一种基于测量ATP含量的检测细胞生物活性的方法.与传统的细胞生物活性检测试剂盒MTT,CCK-8以及Alamar Blue比较,该方法具有反应迅速、活力高、灵敏度好、生产方便的优点,具有实际应用的潜力.%The firefly luciferase gene was PCR-amplified from plasmid pGL4. 26 and subcloned into a bacterial overexpression vector pET24a. Expressed luciferase fusion protein was purified using Ni-NTA affinity chromatograph and its activity was confirmed using Bright-Glokit. Based on the ATP-dependency of luciferase reaction, we developed a cell viability assay, which is faster, more convenient, and more sensitive in detect cell viability than generally used MTT, CCK-8 and Alamar Blue methods.【总页数】10页(P45-53,84)【作者】祝静静;鲍秋颖;王宇萌;夏钢【作者单位】华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室、上海市脑功能基因组学重点实验室,上海200062;华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室、上海市脑功能基因组学重点实验室,上海200062;华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室、上海市脑功能基因组学重点实验室,上海200062;华东师范大学脑功能基因组学教育部重点实验室、上海市脑功能基因组学重点实验室,上海200062【正文语种】中文【中图分类】Q814.9【相关文献】1.利用NF-κB转录活性萤光素酶报告系统检测白细胞介素1及白细胞介素1受体拮抗剂的生物活性 [J], 张颖妹;王应;徐茜梅;吕冰峰;马大龙2.利用MTT比色法建立快速检测化疗后骨肉瘤细胞活性的方法 [J], 陈强;张进华;陈建庭;史占军;邓永健3.利用Gaussia萤光素酶建立乳腺癌实时定量检测动物模型 [J], 张秀娟;黄海;谢佩雯;王学军;王升启4.表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立 [J], 张昕;安小平;陈斌;张宝中;王盛;刘大斌;童贻刚5.利用萤光素酶标记的肿瘤细胞建立肝癌原位移植模型及其活体成像 [J], 孙萍;王怡;孙志东;彭剑淳;周勇;詹林盛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组酶聚合酶扩增技术在植物病原快速检测中的应用
重组酶聚合酶扩增技术在植物病原快速检测中的应用作者：马文娣田逸英焦志远周涛范在丰来源：《植物保护》2021年第03期摘要：植物病原的快速检测对于植物病害防控具有重要意义。
重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年建立的等温核酸扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、适用于现场快速检测等特点，已在多个领域广泛应用。
本文对重组酶聚合酶扩增技术的原理、特性、检测方法及其在植物病原体检测领域的应用进展加以综述。
关键词：重组酶聚合酶扩增; 植物病原; 检测中图分类号：S 474文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2020038Recombinase polymerase amplification and its applications inquick detection of plant pathogensMA Wendi， TIAN Yiying， JIAO Zhiyuan， ZHOU Tao， FAN Zaifeng*（Department of Plant Pathology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）AbstractThe rapid diagnosis of plant pathogens is essential for efficient prevention and control of plant diseases. Recombinase polymerase amplification （RPA） is an isothermal nucleic acid amplification technology developed in recent years， which has been widely applied in many fields. It is suitable for on-site rapid detection with high sensitivity and strong specificity. In this paper， we review the principles， characteristics， detection methods of RPA and its applications in the detection of plant pathogens.Key wordsrecombinase polymerase amplification; plant pathogen; detection病原物的準确检测和鉴定是植物病害防控策略中的关键环节。
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果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定(一)
摘要]目的：构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。
方法：用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段，经酶切亚克隆至pGL3Basic的真核表达载体中，转染果蝇S2细胞，通过测定荧光素酶和β半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。
结果：构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3Control中增加了2.7万倍。
结论：成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3pac。
关键词]果蝇S2细胞；荧光素酶；启动子；报告基因；转染
在研究基因功能的过程中，不可避免地要研究基因的调控机制，而基因的表达产物复杂且难以对其定量和定性，要在细胞生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。
但报告基因分析系统的发现给基因调控与表达的研究带来了新的希望。
近年来，报告基因系统的研究取得了快速的发展。
报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控，因此，对真核基因调控的了解可以不通过直接测定调控元件调节转录速率的能力，而是把顺式调控元件与报告基因的序列连接起来，在基因转录的过程中测定报告基因转录产物的表达量，从而判断相应的顺式作用元件的调控能力。
作为报告基因必须具备以下特点：（1）由原核基因编码的基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）细胞内其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高、重复性好。
该技术的主要优点是灵敏度高、可信性大及检测方便且适合大规模检测，目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件13]。
荧光素酶（LUC）报告基因来源于北美萤火虫，能催化萤火虫的氧化性羧化作用，同时发射出光子，可被光度计捕获定量。
LUC的分析具有快速、方便、线性较好等优点，正成为最广泛使用的报告基因。
pGL3系列的质粒就是带有LUC报告基因的质粒载体，我们可以利用这一系列的工具载体研究果蝇中基因的表达调控方式，其中pGL3Control带有SV40的启动子和增强子。
SV40是一种猴病毒，它的增强子/启动子区域可使其在大多数细胞株中有高度的组成性表达，因而广泛用于构建真核基因的表达载体，因此pGL3Control可作为检测体系中的阳性对照。
但由于SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达，所以我们将果蝇actin5C蛋白的启动子（pac）4]构建到质粒pGL3Basic 中，得到了高表达LUC的重组载体pGL3pac。
这一质粒的构建可为研究果蝇中基因的调控方式奠定基础，同时也可为研究其他报告基因在不同细胞中的表达提供借鉴作用。
1材料和方法
1.1菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α（作者所在实验室保存），质粒pGL3Basic(Promega公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ及T4连接酶、DNA 聚合酶(TaKaRa公司)，小量胶回收试剂盒(TaKaRa公司)，中量质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)，LUC检测试剂盒(Promega公司)，S2细胞Schneider培养基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。
12方法
1.2.1pac启动子的获得以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板进行PCR扩增。
上游引物5＇GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3＇,下游引物5＇GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3＇（划线部分分别为XhoⅠ和HindⅢ酶切位点）。
PCR 反应参数为：95℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃延伸10min。
1.2.2重组质粒的构建鉴定与中量抽提纯化PCR产物分别经XhoⅠ、HindⅢ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切片段，与同样经酶切、割胶回收的pGL3Basic质粒于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含氨苄青霉素（终质量浓度为50mg・L-1）的固体培养基上，37℃过夜培养。
挑阳性克隆提取质粒，酶切和测序鉴定，鉴定正确的质粒经中量质粒抽提试剂盒提取纯化。
1.2.3S2细胞培养及瞬时转染S2细胞由本实验室冻存，使用Schneider培养基，补以10%胎牛血清。
S2细胞培养在28℃无CO2培养箱中，根据其生长状态，按一定比例每3d传代1次。
待细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。
转染时在12孔板中接种1×106个细胞，加入1ml含10%胎牛血清的Schneider培养基，置28℃无CO2培养箱中培养6～16h细胞生长至对数生长期达（2～4）×106ml-1]，在1.5mlEppendorf管中准备以下试剂：溶液A,12μl2mol ・L-1CaCl2，5μg重组质粒,1μgpAcLacZ质粒，加入双蒸水至总体积为100μl，混匀待用；溶液B,100μl2×HBS。
将A溶液缓慢加入B溶液中，轻轻混匀，室温放置30min，以形成Ca3PO4DNA 复合物。
将Ca3PO4DNA复合物逐滴加至细胞上，混匀后置28℃无CO2培养箱中继续培养，24h后用含10%胎牛血清的Schneider培养基给细胞换液。
细胞转染48h后裂解细胞，先吸去培养液，用PBS洗2遍，在每个培养孔中加入200μlReporterlysisbuffer，保证充分覆盖细胞，冻融1次以确保细胞裂解，将细胞裂解液移至1.5mlEppendorf管中，振荡10～15s，离心（12000×g，2min，4℃），转移上清于新管。
制备好的细胞裂解液可用于测定或贮存于-70℃备用。
1.2.4LUC和β半乳糖苷酶(βgal)活性测定取制备好的细胞裂解液进行LUC和βgal活性的测定。
LUC活性测定前取20μl平衡至室温的细胞裂解液，加入80μlLUC底物，迅速混匀，置光度计中，记录读数。
βgal活性测定根据分子克隆的方法，在每个用于测定转染细胞裂解物的Eppendorf管中加入100×Mg2+3μl、1×ONPG66μl、细胞裂解物30μl、0.1mol・L-1Na3PO4201μl,混匀。
置37℃保温30min，以500μl1mol・L-1Na2CO3终止显色反应。
置酶标仪上，在波长420nm处读光吸收值来表示βgal的活性，以共转化的βgal活性作为内源对照，以/βgal活性的值为系数，比较各组在转化效率相同时LUC活性的相互关系。
以没有任何插入片段时pGL3Basic的LUC活性为1，比较加上插入片段pac启动子后的LUC活性增加的倍数，即LUC 的相对活性，以反映LUC基因表达的相对水平。