优选第二章基因工程基本技术原理序列分析

DNA
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克服缺点的一种途径—DNA分子克隆
将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载 体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为 载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA 中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。
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A
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酶、原料比例
dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多 于 200个以上的核苷酸顺序。 降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配 合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到 能判读出300个左右的核苷酸顺序。
2.5.1.2 Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法 引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷
独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略，并于1971 年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；
➢1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定
DNA序列的末端中止法；
➢K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；
➢M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都
基因工程
第二章 基因工程基本技术原理-DNA序列测定
优选第二章基因工程基本技术原理序列分析
西北师范大学 精品课程 武国凡
2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 ■ 2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法■ 2.5.3 序列分析自动化■ 2.5.4 杂交测序■ 2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题■ 2.5.6 思考问题■
M13载体克隆DNA片段
将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中 重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白 色的噬菌斑; 非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。 从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链 DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。
DNA
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变性胶电泳分离反应混 合物。
放射自显影术，检测单 链 DNA 片 段 的 放 射 性 带 。
结果判读，从放射性X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
考考你
ddATP ddTTPddGTP ddCTP
ddCTP ddATP ddGTP ddTTP
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2.5.1 Sanger双脱氧链终止法 DNA核酸序列分析历程
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和 研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实
第一，如何分离寡核苷酸片段； 另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。
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引物—延伸测序策略
➢1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu）
➢待测DNA与pBR322பைடு நூலகம்pUC分子
重组；
➢转 化 ： 转 化 反 应 物 涂 布 在 补 加
有Xgal-IPTG选择性培养基平板上， 经37℃过夜培养；
➢挑选白色菌落，制备质粒NA。 ➢碱变性处理，与引物一起退火，
然后按双脱氧法作序列分析。 优 点 ： 无 需 将 DNA 克 隆 到 M13 载 体上，更为简单快速，现已被许 多研究工作者采用。
高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制 片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳 分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。
为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排” 起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对 同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
费时、费力、费钱、DNA损伤严重
2.5.2.1 Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理
化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的 DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA 片段的核苷酸顺序。
出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端 带有放射性标记的DNA片段 (双链或单链）
关键：4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割 仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去 以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要内容。
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使用M13载体系列的优点
所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样， 就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。 应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种 最普遍采用的快速的DNA序列分析法。
2.5.1.3 Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法
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2.5.2 Maxam－Gilbert化学修饰法
是 1 9 7 7 年 由 美 国 哈 佛 大 学 的 A ． M ． Maxam 和 W． Gilbert 发明的，所以又叫做Maxam－Gilbert DNA序列分析法
虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言， 化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度 也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中 仍被采用。
获得了诺贝尔奖。
2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理
利用DNA聚合酶的两种酶 催反应特性：1、利用单链 DNA模板，合成DNA互补 链；2、利用2’，3’双脱 氧核苷三磷酸作底物，参 入到寡核酸链的末端，从 而终止DNA链的生长。
也称引物合成法，或酶催 引物合成法。
反应：同时加入引物和 模板、DNA聚合酶1、一 种 ddNTP 、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。
将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形 的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。 这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA 序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列， 所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列 分析法。
Sanger 双脱氧—pUC体系 DNA序列分析法基本步骤