组织病理学常用技术基本理论
组织病理学技术
组织病理学技术组织病理学技术一. 实验综述组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。
是一门新兴的学科。
在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。
主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。
同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。
为由基础走向临床打下坚实的基础。
二. 实验目的1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项二.实验材料1. 实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签2. 实验试剂：福尔马林、酒精（50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶四.实验步骤（一）取材从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。
1. 取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。
为此要选取病变显著的区域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。
较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。
2. 取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。
为此，切取组织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。
3. 组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以 1.5 X1X 0.4cm为宜，必要时可增大到2X 1.5 x 0.5cm,以便于固定液迅速浸透。
病理学技术考点总结
酶组织细胞化学技术酶组织化学技术的基本原理及方法1、金属沉淀反应，如硫代胆碱铜法，可证明胆碱酯酶和酯酶；2、藕联偶氮色素法3、色素形成与染色法一碱性磷酸酶（AKP）AKP最适宜PH值为9.2-9.4，可被金属阳离子或某些氨基酸激活，多见于活跃的部位，如小动脉、肾小管上皮等。
⏹AKP染色方法:1、Gomri钙钴法：AKP为黑色注意事项：此法对含铁血黄素和钙盐也可形成棕黑色沉淀，必要时应予以鉴别。
并且用于透明的二甲苯为AR级别。
2、Gossrau偶氮吲哚酚法：酶活性部位呈暗褐色（坚牢蓝VB）、浅红色（坚牢蓝BB）、蓝色（坚牢紫B）二酸性磷酸酶（ACP）ACP前列腺活性最强，在肝脏内毛细胆管旁活性最强。
⏹ACP染色方法:1、Berry硝酸铅法：ACP为棕黑色，特异性抑制酶是氟化钠。
2、Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法：ACP为红色。
三三磷酸腺苷酶（ATP）ATP分为三类：膜性ATP、肌球蛋白ATP、线粒体ATP，以上三种酶不可用甲醛固定，用冷冻法。
⏹ATP染色方法：1、Wachstein-Meisel镁激活酶法：ATP为棕黑色。
2、Dubowitz-Brooke钙激活酶法：A TP为棕黑色。
注意事项：镁激活的ATP正常肝定位于毛细胆管；钙激活ATP区分于红肌纤维和白肌纤维有意义，对于区分神经性肌萎缩和肌源性肌萎缩有价值。
四胆碱酯酶（CHE）广义胆碱酯酶分为胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶，胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸，主要分布于血浆、胰腺和唾液腺；乙酰胆碱酯酶主要分布于神经肌肉接头等处。
CHE染色法1、Snell-Garrett胆碱铜法：CHE呈黄色或棕黄色。
2、Karnovsky-Roots铁氰化铜法：CHE呈红棕色或深棕色。
核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
病理学实验技术重点
1.什么是病理学技术？病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。
2.组织制片的目的。
生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡，其结构就会失去正常状态,必须对组织采取固定、切片和染色措施！3.何谓组织制片技术？组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。
4.组织制片种类及其各类方法的分类。
（一）组织非切片制作方法：组织分离标本组织活体标本组织涂片标本磨片标本整体封存（压片）标本组织铺片标本组织印片标本等（二）组织切片法：1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法4.超薄切片法（电镜技术） 5.树脂切片 6.碳蜡切片5.组织制片的主要程序。
取材、固定----脱水-----透明、浸渍-----包埋、切片----贴片、染色---浸洗----脱水----透明----封固6.实验动物处死常用方法及优缺点。
1）挥发性麻醉剂（吸入麻醉）包括：乙醚、氯仿等。
优点：乙醚吸入麻醉适用于各种动物，安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握。
缺点：是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多、肺部充血，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而致动物死亡。
2）非挥发性麻醉剂（注射麻醉）这类麻醉剂种类较多，包括10%苯巴比妥钠、4%戊巴比妥、5%硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，20%氨基甲酸乙脂（乌拉坦）和1%水合氯醛、氯胺酮等，可通过肌肉注射、静脉注射、腹腔注射。
优点：这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。
3）断髓（脱臼）法动物处死过程中动作要迅速，尽量避免其长时间处于痛苦或濒于死亡状态，以免机体内组织或细胞结构发生改变引起人工假象。
常用病理学技术操作规范总则
常用病理学技术操作规范总则引言病理学技术操作是病理学研究中的重要环节，其规范与科学性直接影响着病理学诊断的准确性和质量。
本文档旨在总结常用病理学技术操作的规范和要点，以指导病理学工作者正确进行病理学技术操作，并提高工作效率和结果可靠性。
一、标本采集与处理1.标本采集前应仔细了解病史及临床资料，选择合适的标本采集方式和部位。
2.采集标本时，应使用合适的采集工具，避免污染和破坏标本。
3.采集的组织标本应立即固定，避免标本变质和损伤。
4.标本固定时，应选择合适的固定液和固定时间，保证标本质量。
二、常用病理学技术操作规范1. 组织切片制备1.切片时要避免空气和切片机械对组织的伤害，保证组织完整性。
2.切片时应调节切片机的切片速度和切片角度，以得到理想的切片厚度和形状。
3.切片后应及时将切片转移到水中，避免干燥和切片断裂。
4.切片后的组织应分别置于不同的玻片上，避免混淆或丢失。
2. 染色技术操作1.组织切片上染色前，应对切片进行脱蜡处理，以去除蜡质。
2.将切片置于染色剂中时，应根据染色方法和要求，确定适当的染色时间。
3.染色后应将切片洗净，以去除多余的染色剂和降低背景染色。
4.染色后的切片应控制晾干时间，以确保切片上没有水分。
3. 免疫组化技术操作1.免疫组化前，应对切片进行抗原修复处理，以增强抗原的特异性。
2.选用适当的抗体和染色方法，确保准确的免疫反应结果。
3.免疫反应后，应对切片进行显色处理，并确定合适的显色时间。
4.洗净切片后，应进行脱水和封片操作，以保护切片和固定免疫结果。
4. 电镜技术操作1.电镜前，应对切片进行适当的去蜡和再固定处理，以保持细胞超微结构的完整性。
2.选择合适的电镜片和工作距离，以获得清晰的电镜图像。
3.对电镜图像进行拍摄时，应注意曝光时间和对焦准确度。
4.完成电镜操作后，应对切片进行处理，以使其适宜保存和观察。
三、实验室安全操作要点1.进入实验室前，进行个人防护装备的佩戴，并了解相关实验室安全规定。
组织病理技术名解
病理学：病理学是研究疾病发生发展规律的学科，主要的研究范围是疾病发生发展过程中组织、细胞代谢、功能及结构的变化。
取材：组织标本的选择即取材，取材的目的是正确的获取所需要的标本或标本的某一部位。
组织的固定：将各种组织浸入某些化学试剂内，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态的形态结构和位置，叫做固定。
Carnoy液：固定胞浆和胞核,对染色体固定佳,显示DNA和RNA效果好.也常用于糖原和尼氏体的固定.不能保存脂质有防止酒精的硬化收缩作用,穿透力强,适用于外膜致密的组织脱水：某些溶剂置换组织内水分的过程，能够使组织脱水的化学物质称为脱水剂。
透明：组织经酒精脱水后，还必须经过一个媒剂透明过程浸蜡：经过透明的组织块，进一步移入熔化的石蜡内浸渍，称为浸蜡。
用其他浸透剂（火棉胶，碳蜡，明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入包埋：使用包埋剂将处理过的组织包于其中，使组织达到一定韧度和硬度，有利于切片。
组织芯片：又称组织微列阵，是将数十个、数百个、乃至上千个小的组织片整齐的排列在某一载体上（通常是载波片）而成的微缩组织切片。
石蜡切片：组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。
HE染色（常规染色）：使用苏木精hematoxlin和伊红eosin染色，主要用以显示各种组织、细胞的一般形态结构以及疾病过程中病变的发生、发展及修复的过程。
封固剂：使染色后的组织封固于载玻片与盖玻片之间而不与空气直接接触，避免氧化褪色；折光率与玻片的折光率相似。
抗原修复：组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术：是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透，与表位结合。
病理学研究中常用的分子生物学基本技术与其应用
• 概念
• 固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳
• 酸颗粒、磁珠和微孔板等
• 基本方法： 在此以膜相为例
• (1) DNA 变性：使DNA由双链解链成为单链。
•
是成功的关键
• (2)变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定
• (3)预杂交
• (4)杂交
• (5)洗膜
• (6)结果显示
• A.放射性测定 放射自显影法
• 斑点杂交应用于
• DNA斑点杂交
• RNA斑点杂交
• 对于培养细胞，不必提取和纯化RNA，只需简 单处理(0.5%Nonidet P40 低渗缓冲液)
• 完整细胞斑点杂交 NaOH 处理，使DNA
•
暴露
•
可用于筛选大量标本，但它不适用于
非放射性 标记探针 (DNA纯度不够)
• 斑点杂交的特点
病理学研究中常用的分子生物学基 本技术与其应用
• 分子病理学基本概念 • 现代分子生物学 vs 传统病理学 • 疾病发生过程中 • 分子事件及其与疾病发生的关系 • 揭示 根本机制
• 复习有关的分子生物学概念
• (1)核酸的结构与功能
• 核酸 ---多核苷酸。
• 核酸由核苷酸组成
• 核苷酸由碱基、核糖/ 脱氧核糖和磷酸构成
•
NBT（四氮唑蓝）显色等
• 有两种方法:
• 直接法 直接标记探针
• 间接法 抗原标记探针, 杂交后,再用特异性
•
标记的抗体反应, 在呈色
• 双重原位杂交方法
• 通常有两种方法
• A . 用相邻的连续切片（3 μ），用两 种不同的探针进行原位杂交
• 适用于较大细胞的研究
• 优点 二者杂交过程和结果互不干扰
临床病理知识及病理学常用新技术
一.大纲要求掌握临床病理检查的种类及目的；掌握临床病理检查的的流程及注意事项；.熟悉病理学常用新技术的原理及应用二.基本内容（一）.基本概念1. 活体组织检查（biopsy）：简称“活检”，从活体身上的病变或可疑病变处采取小块组织作病理检查，以明确病变的性质。
2. 冰冻切片快速诊断(frozen sextion) ：用不经固定的新鲜标本，快速冷冻至-18度以下，进行切片、HE染色，一般在20～30min内完成定性诊断。
3. 细胞学检查（cytology）：通过对患者病变部位脱落、刮取和穿刺抽取的细胞进行病理形态学的观察，并作出定性诊断。
目前主要用于肿瘤的诊断，判断有无肿瘤细胞，是良性或恶性。
也用于某些内部器官炎症性疾病的诊断和激素水平的判定等。
4. 苏木素－伊红染色（HE染色）：被称为常规染色方法，能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学。
而且HE切片可较长时间保存，因而是生物学和医学领域中最基本也是应用最广泛的染色方法。
染色结果：细胞核呈蓝色，胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。
钙盐和微生物也可染成蓝色或蓝紫色5. 组织化学技术（histochemistry technique）：又称特殊染色，其基本原理是利用病变组织内某些物质的化学特性，用特殊染料将它们显示出来，从而协助鉴别HE染片内不易区别的病变或物质。
6. 免疫组织化学(immunohistochemistry)：根据抗原抗体特异性结合的免疫学原理，将预先制备的特异性抗体加在组织切片上，使之与相应的抗原结合。
特异性抗体通过某种方式连结辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。
显色剂在酶的作用下氧化沉淀，将抗体所检测的抗原在组织切片上显示出来。
7. 生物芯片技术(biochip technique)：是将大量具有生物识别功能的分子或生物样品有序的点阵排列在支持物上并与标记的检测分子同时反应或杂交，通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的新技术。
《组织病理技术》课件
采用适当的固定液和保存方法，优化 染色流程，使用防脱片胶，提高制片 质量。
新技术的应用与展望
新技术
数字化病理技术、人工智能辅助诊断、 组织芯片技术。
VS
展望
数字化病理技术将使病理诊断更加便捷和 准确；人工智能辅助诊断能够提高诊断效 率和准确性；组织芯片技术可用于药物筛 选和疾病模型研究。
组织病理技术的伦理与法规问题
组织病理技术的发展历程
19世纪初
随着显微镜的发明和应用 ，人们开始对组织结构和 细胞形态进行研究。
20世纪初
石蜡切片技术的出现，使 得组织病理技术更加标准 化和规范化。
20世纪末至今
随着科技的不断进步和应 用，组织病理技术不断发 展和完善，应用领域也更 加广泛。
02
组织病理技术的基本原理
组织样本的获取与处理
。
恶性程度评估
组织病理技术可以评估肿瘤的恶性 程度，判断肿瘤的侵袭性和转移风 险，为制定治疗方案提供依据。
预后判断
通过组织病理技术对肿瘤的病理特 征进行分析，可以预测患者的预后 情况，帮助医生制定后续治疗方案 。
移植组织鉴定
组织匹配
在器官移植中，组织病理技术用 于检测供体和受体之间的组织匹 配程度，确保移植组织的兼容性
根据处理方法的不同，组织病理 技术可以分为石蜡切片技术和冷 冻切片技术等。
组织病理技术的应用领域
01
02
03
临床病理诊断
通过组织病理技术对病变 组织进行观察和分析，为 临床医生提供准确的病理 诊断。
药物筛选
利用组织病理技术观察药 物对病变组织的影响，为 新药研发提供实验依据。
毒理学研究
通过组织病理技术观察化 学物质对组织结构和细胞 形态的影响，评估其毒性 和安全性。
17 病理学常用技术的原理及应用
免疫组织化学(免疫组化)和免疫细胞化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一种技术，由免疫学和传统的组织化学相结合而形成。免疫组化染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，同时具有将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上原位确定某些蛋白质或多肽类物质的存在的特点，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析技术或激光扫描共聚焦显微技术等，可对被检测物质进行定量分析。
电镜技术在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的观察和研究，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点(图17—2、图17—3)；在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断；疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定。如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断。随着电镜技术的，不断发展以及与其他方法的综合使用，还出现了免疫电镜技术、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微技术等。但电镜技术也有其局限性，如设备昂贵、样本制作较复杂；样本取材少。观察范围有限，有时还可能会遗漏信息：当用于辅助肿瘤的病理诊断时，只能判定肿瘤的组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性。
(三)细胞病理学观察
通过采集病变处的细胞，涂片染色后进行观察、诊断。细胞的来源可以是运用各种采集器在口腔、食管、鼻咽部、女性生殖道等病变部位直接采集的脱落细胞，也可以是自然分泌物(如痰、乳腺溢液、前列腺液)、体液(胸腹腔积液、心包积液和脑积液)及排泄物(如尿)中的细胞，以及通过内镜采集的细胞或用细针直接穿刺病变部位(如乳腺、甲状腺、前列腺、淋巴结、胰腺、肝、肾等)，即细针穿刺(fine neecUe aspiI-ation，FNlA)所吸取的细胞。细胞学检查除了用于病人外，还用于肿瘤的普查。该方法设备简单，操作简便，病人痛苦少易于接受，但最后确定是否为恶性病变尚需进一步经活检证实。此外，细胞学检查还可用于对激素水平的测定(如阴道脱落细胞涂片)及为细胞培养和DNA提取’等提供标本。
常规组织病理技术
递增酒精浓度可避 免组织过度收缩
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自动脱水 机
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(四) 脱水的注意事项 组织脱水必须掌握由低浓度向高浓度逐步过
渡的原则 脱水时间要适度 组织脱水要彻底干净 酒精的浓度 适时更换 降级使用
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二、 透明
组织经酒精脱水后，还必须经过一个媒剂透 明过程
既与酒精混合 又溶解于石蜡
酒精
媒剂
石蜡
使组织透明
11
常规组织病理技术
内容—— formalin固定 石蜡切片制作 HE染色等 基本——研究形态学必不可少的重要方法 基础——常规组织病理技术是现代新技术基础 优点——简单易操作，基本满足日常工作需要
（常规技术、常规染色）
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常规技术的完成是制作出染色良好的HE切片
常规技术基本流程
取材
固定
脱水、透明、 浸蜡、包埋
85
4、 弱碱性水溶液
(1)碳酸锂水溶液：碳酸锂1.25g溶于蒸馏水 100ml。PH值为8.0左右。
(2)氢氧化铵水溶液：将氢氧化铵（氨水）逐滴 加入蒸馏水中，经搅拌后，用pH试纸检验 溶液，pH值调至7.5～8.0之间即可。
三. 固定注意事项
（1）固定的组织越新鲜越好 （2）固定液的量：约1：10
固定容器：足够大 , 开口不宜太小
（3）固定的温度：室温(25℃)
（4）特殊类型染色对固定要求严格，组织的大小、 固定的时间、温度的适当都应注意。
40
有专家说：若你能取到新鲜的组
织，能切到厚2~4mm的切块和记得固 定液是十倍于组织块的总体积，你的诊 断的正确性已得到了80﹪的保证。
从人体（活检、手术、尸检）或 动物体上获取器官、组织
↓ 进一步将其切取为制片所需组织块
02 病理学常用技术
免疫组化染色步骤
1. 脱蜡 – 组织经过处理后充满石蜡 – 传统方法是把切片浸泡在一系列的有机溶剂中清洗（二甲苯、柠檬 油精/取代物）
2. 再水化 – 去除有机溶剂，准备染色 – 在梯度酒精中再水化 • 2－3×100％酒精 • 95％酒精 • 70％酒精 –水
免疫组化染色步骤
3. 复染 – 蓝染 • 碱性溶液使组织的pH值增高，把色调由红色/蓝色变成紫色
一抗 病人组织
酶 显色剂
间接酶免疫组化
• 多步孵育 • 酶标记物连接到二抗上 • 加入适当显色剂和底物后即可显色
二抗
一抗 病人组织
酶 显色剂
免疫组化的显色 – 间接
H2O2
二抗
Primary antibody Patient tissue
DAB
酶
生物素 亲和素
酶和显色剂
• 辣根过氧化物酶 – Diaminobenzidine (DAB) – 产生栗棕色 – Aminoethylcarbazole (AEC) – 产生砖红色
• 碱性磷酸酶（AP） – Fast Red – 产生紫红色 – NBT – 产生深蓝色 – 一般用于原位杂交ISH (in situ hybridization)
怎样才是质量好的免疫组化染色？
• 高质量的免疫组化染色切片
– 足够强的染色信号，可以很好的区分 – 高灵敏度，高特异性，低背景 – 能显示形态学的特征 – 增强病理专家诊断的信心 – 病理专家阅片时不会感到疲劳和吃力 – 稳定性好
• 由于抗体分子不能直接被观察到，因此抗体结合位点也无法被观测到 • 为了使免疫反应可视化，需要为其连接上一个带有可见信号的小分子 • 这些分子能够通过直接或间接的方法连接到一抗上 • 常用的两种小分子为荧光素和酶
组织病理学讲义
组织病理学讲义正确的取材、合适的固定和良好的染色是优质病理工作的基础。
病理工作最基本、最重要的技术是常规组织病理技术。
为适应新技术的开展，要求所需材料：1．组织细胞的形态完整保存；2. 最大限度保存组织或细胞成分的抗原性；3. 抗原不弥散，以保证其准确定位。
一、组织取材（一）一般原则1、厚度0.2～0.3cm；面积1 ～1.5cm2。
2、皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条，如过长可将其缠绕成同心圆状。
3、骨组织需先经脱钙处理。
4、若需保存新鲜组织，应将所取织用锡箔纸包好，入液氮速冻，然后置-70 C冰箱中。
（二）、取材注意事项1、刀剪应锋利、避免前后拉动和挤压。
2、应避开坏死组织和血凝块，去掉异物。
3、应取病变主体、病变与正常交界和正常组织各一块。
二、细胞取材及制片1、印片法：操作简单、细胞抗原保存完好。
2、穿刺法：直接涂片或离心后涂片。
3、沉淀法：先离心后涂片。
4、活细胞标本制备：将细胞直接培养在盖玻片上（细胞爬片），或培养于培养瓶或培养板内，制成细胞悬液，再涂片。
第二节固定及常用固定剂一、概念：将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称。
二、固定的作用1、保持组织、细胞与生活时相似的结构和形态，防止离体组织自溶和细菌繁殖导致的组织腐败。
2、保持定位细胞内特殊的成分，如细胞内的一些蛋白质经过固定，可沉淀或凝固定位在细胞的原有部位。
3、固定可使组织细胞中各种成分沉淀、凝固并易着色，便于区别不同的组织成分。
4、固定剂兼有组织硬化的作用，有利于切片。
5、有利于保存抗原及DNA、RNA，为免疫组化染色和核酸原位杂交做准备。
三、组织固定的注意事项1、取材后要及时固定，尤其是温度高的季节。
2、容器：最好选择广口的容器，一是避免组织受挤压变形，二是方便取材时易于取出。
3、固定液要足量，至少应为组织块总体的5倍以上。
4、根据不同研究目的选择不同的固定液。
5、固定时间：视组织块大小、固定温度、固定液种类而定。
临床病理基本知识及病理技术
（四）固定液的量 大于标本的4倍体积，或固定液水平面 高于标本
（五）哪些标本不必固定？ 术中冰冻检查标本； 肾穿刺标本； 免疫荧光、某些免疫组化检查标本； 肌病标本
四、病理标本的长期保存 根据不同目的用不同方法 液体保存 石蜡包埋 塑料包埋 液氮保存
五、病理检查的基本过程 第一天 肉眼检查、取材，固定、
• 固定液：10%福尔马林
• 固定时间：24-48小时为佳
2、抗体效价
3、实验操作技术
• 临床医生要了解、关心、支持病理科工作， 使病理科更好为临床服务。
汇报完毕！谢谢！
教学资料整理
• 仅供参考，
诊断有赖于对病变器官或组织的病理 检查，这种检查称为活体组织检查 (biopsy)。病理学关于这方面的实践 和理论范畴称诊断病理学或外科病理
一、病理诊断的重要性与局限性
（一）重要性
1．建立在全面系统病理检查基础上的 病理诊断是疾病诊断的“金标准”；
2．有计划的定期活检有助于了解疾病 的动
态变化和疗效判断；
（二）肿物或器官切除标本送检 无论术前有无病理诊断，手术标
本都应送检。术前活检的病理诊断往 往有局限性甚至有误，最后诊断应根 据肿物或器官的全面检查作出。
肿物或器官切开的方法： 肿块 沿最长径线切第一刀，以后切面与第
一刀平行。 乳腺 沿肿块中央与乳头连线切第一刀。 肺叶 沿肺门作冠状切开。 食管 沿病灶对侧纵行切开。
三、标本的固定 （一）固定的意义 使各种酶灭活，防止组织自溶。保 存细胞亚结构，促进各种化学成分
在 原位凝固沉淀。 （二）固定的时机
1．10%福尔马林 1份体积市售福尔马林加9份体积缓冲液 （PH7.4）一适用于手术及活检标本固定；
病理学技术士专业知识
七、组织的包埋
组织浸透和包埋介质有：石蜡、碳蜡（聚二乙醇）、明 胶、火棉胶、环氧树脂等。 常规病理制片，采用石蜡，故组织浸透称为组织浸蜡， 组织包埋称为石蜡包埋。 火棉胶浸透和包埋多用于制作眼球和肺脏等有空洞的组 织。 电镜标本组织切片，采用环氧树脂浸透和包埋。
高频考题
超薄切片技术中，目前常用的包埋剂是 :（ ） A.环氧树脂 B.石蜡 C.火棉胶 D.碳蜡 E.明胶 【答案】A
七、组织的包埋
【熟练掌握】 包埋的作用：意义、目的 包埋，是把组织包埋于具有一定硬度的介质内才可借切 片机切成菲薄的切片，然后才能进行染色、观察。 组织在脱水、透明后，继续把组织浸透在一种介质内， 这种介质必须是在常温下具有一定硬度的固体物质，当介 质填充进组织内的空隙后，最后借一种工具把组织包埋起 来，使之成为内外硬度一样的组织块。
六、组织的透明和透明剂
【熟练掌握】（4）香柏油 • 折光率为1.51，能溶于酒精，是酒精脱水后的良好透明 剂 • 对组织的收缩和硬化程度小，对组织的损害最小； • 透明时间长，多用于染色后的透明，一般不用于组织块 的透明； • 对致密纤维或硬组织（如皮肤、子宫、肌肉和肌腱）的 透明效果较好； • 香柏油的精制品常用作显微镜镜油。
六、组织的透明和透明剂
【熟练掌握】（1）透明和透明剂 组织脱水后，因为脱水剂无水乙醇不能与熔化的石蜡相 互混溶，石蜡不能把组织内的脱水剂置换出来，而熔化的 石蜡也不可能渗入组织，因此，必须要用一种过渡的溶剂 ，即既能与脱水剂无水乙醇相混溶而置换组织内的脱水剂 ，又能与熔化的石蜡相混溶，最后又被熔化的石蜡取代， 这种过渡溶剂即透明剂。
六、组织的透明和透明剂
【掌握】（5）松油醇 • 紫丁香合成油的混合异构体，折光率1.48； • 不易使组织收缩及硬化，与酒精可混融； • 松油醇浸入2~12h后，更换新松油醇放置过夜。用苯漂 洗30min洗去松油醇，而后进行浸蜡； • 用负压浸蜡法，让挥发的气泡升起，再浸蜡到预定时 间即、组织的透明和透明剂
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商品石蜡的处理： 反复溶化、过滤以增加石蜡
的硬度和密度，并除去杂质。
浸蜡 ：
温度最好不超过该石蜡溶点 的2℃以上；1~2h 。
包埋：通常使用包 埋盒。
包埋通常使用组织包埋机、包埋盒及配套使用的
不锈钢模具。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝
头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地
置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加
粘膜
粘膜 下层
胃 壁 结 构 模 式 图
肌层
浆膜
（三）标本的固定
1．固定的目的 使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源 性和内源性酶活性，防止组织自溶；使组织 成份转变为不溶性物质从而有利于保存。这 就是固定的基本意义。
2．固定的注意事项
(1) 组织块不宜太大，一般以厚度为 2 毫米，长 度不超过0.5厘米*0.5厘米。
显微镜下观察的骨、牙磨片标本。
5．分离标本：将极小组织块用化学药物的水
溶液浸泡后，溶去其细胞间质，采用机械分 离方法（如振荡、针拨等方式）使之分离成 单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片 上进行镜检。
6．压片标本：组织经化学药物软化及染色 后，用盖片压封于载玻片上进行镜检的标 本。如运动终板的制作。
动亦可按此方法进行观察。
9 ．血管注射标本： 一种是将树脂类铸形剂经
血管灌注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织 而制成的血管铸形标本，可瓶装供肉眼观察或 进一步处理后作扫描电镜观察。另一种是将染
料加明胶配制成染色液注入血管内，然后取材、 固定、包埋、切片和封固所制成的组织切片标 本。这类标本主要用于了解血管的走行及其与
所支配组织或器官的相互关系。
第三节
组织切片的常规制作 （一） 概述
组织切片的制作方法有：石蜡切片、冰
冻切片、火棉胶切片、明胶切片、振动切片、
塑料切片（半薄切片）、超薄切片（电镜标
本）、碳蜡切片等。石蜡切片是最常用的方法，
本节将较详细讲授其制作步骤。
组织切片制作方法的基本程序：
取材→固定→脱水→透明→包埋→切片
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4） （4）Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液75份，甲
醛25份，冰醋酸5份配制而成。
4．固定方法
（1）灌注法（Irrigation method）自左 心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后， 注入固定液，30min后取材，置同一固定剂 后固定。 （2）浸入法（Immersion method） 。
间可以延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1． 目的：由于生物体的组织有各种硬度不同 的成份，必须加石蜡等作支持物质渗入组织块 内部，并将组织块包埋起来，然后用切片机以 制作极薄的切片。 2． 种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外， 还有火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、
OTC(冰冻切片包埋剂）等。
石蜡包埋法：
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载 玻片上，经固定、染色、封固而制成的
标本。
3．涂片标本：主要是将液态组织如血液、骨 髓、痰液、腹水、精液等液体涂抹于载玻片 上，经固定、染色制成的组织标本，以供观 察细胞的形态与其微细结构。
4．磨片标本：不经脱钙及切片手续，而直 接用手工在磨石上磨制成薄片，以便在
7．整装标本：一种是将很小的动物或早期胚 胎经固定、染色后，封固于载玻片上。另 一种是将小动物、胚胎或病变器官经固定 后，保存于固定液中瓶装供肉眼观察用。 可了解胚体的表面立体形态特征及病变部 位与周围组织的毗邻关系。
8．活体标本：如将蛙的口腔粘膜取下放于 载玻片上，迅速滴加生理盐水或 Ringer 氏液以观察其纤毛运动。其它如精子运
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学制片的基本程序；
2、熟悉HE染色的步骤；
3、掌握HE染色结果的观察。
第二节 组织学常用的几种标本类型
见视频“组织学制片方法”
第二节 组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻 切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固 而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常 用的标本。
必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水剂。
另外脱水必须进行得很彻底。
2、常用脱水剂： （1）酒精： （2）丙酮：
3、透明的意义和作用：
透明剂能够同时溶解于脱水剂及包埋剂当中， 它能逐渐渗入组织，最终将脱水剂完全排出。 4、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。 二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织 收缩和变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。 氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时
则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。
3．固定剂
用以固定组织的药剂，称为固定液。
常用的固定液有： （1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%—40%甲醛 水溶液）配成固定液其浓度为3.6%—4%，也就是习 惯上称为10%的福尔马林液。 （2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml，
0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。
5．固定后处理
材料固定后，药剂继续留在组织中，易使
组织破坏，必须用水或酒精洗去。 三种方式进行处理： （1）流水冲洗； （2）酒精充分洗涤； （3）直接入脱水剂。
（四）脱水与透明
1、脱水的意义和目的 ：固定后组织其硬度不 能达到切薄片的要求，须进行除固定以外的其
他处理．脱水就是继固定后的重要步骤．脱水
→染色→封固。
（二）动物的致死与取材
1、动物致死法：
（ 1） （ 2） （ 3） 断头法： 麻醉法： 空气栓塞法：
2、组织取材时应注意：
(1) 所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必须锋利 ； (3) 取材时必须考虑切面的方向 ； (4) 组织块应力求小而薄 ； (5) 收缩较大的新鲜组织 ； (6) 注意清洁 ； (7) 用作免疫组化的组织取材 ； (8) 病理取材 。
(2)固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜，
最好在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布 以使固定液能从上下左右前后各方都能渗入组 织块。 (3)固定的时间，一般以24小时为宜。
(4)后固定：柔软组织在新鲜时不易切成小块，
往往采用重新固定法处理。 （ 5 ）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流
固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺