纯合体鉴定的原理及方法_

1.T-DNA插入突变体的鉴定

T-DNA插入突变体从拟南芥资源中心（Ohio State University，Columbus）索要。

种子被播种在含有卡那霉素（Kan＋）的MS筛选培养基上，待萌发后10天左右，把生长正常的幼苗移置营养土中。然后取10天后的叶片提取DNA，PCR进一步鉴定。其原理如下图所示（图5-1）：

LP，RP分别为基因的左边界和右边界，LB为T-DNA上的序列。用三条引物进行PCR扩增，结果如右图所示。用LP和RP扩不出条带，而用RP和LB能扩出条带的为突变体纯合株。

图5-1 突变体鉴定原理图

纯合体鉴定的原理及方法

图1：T-DNA插入的位置

图2：纯合体鉴定所示条带

By using the three primers (LBb1.3+LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion)

should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from LBb1.3 to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of LBb1.3. However, the protocol requires the same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.

纯合体鉴定共需两次才能判定是否是真正的纯合体。

1.以LP+RP为引物：结果显示WT＆HZ（杂合体）能扩出如上图2示900BP的带

2.以LBa1+RP/LBb1+RP为引物：结果显示HZ（杂合体）＆HM（纯合体）能扩出如上图2

示410+N的带

3.对比两次结果，以LP+RP为引物无条带而以LBa1+RP/LBb1+RP为引物能扩出条带的植株

为纯合体。也可以先以LP+RP为引物选出那些无条带所对应的植株再以LBa1+RP/LBb1+RP为引物检测看能否扩出带，能扩出的表示为纯合体。