利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数
SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数
SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37] 贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology andMedi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数
基金项 目：国家转基因重大专项课题 （０ ８ Ｘ ８ １ — ０ ） ２０Ｚ ００２０ １ 作者简介 ：冀志庚（ ９ ４ ） １８ 一 ，男 ，硕士研究生 ，研究方 向为转基因作物检测 。Ｅ ｍ ｉ ｈｎ ｏ０ ＠１３ｃ ｍ — ａ ： ａｂ ０ １ ６ ．０ ｌ 通讯作者：高学军 ，教授 ，博士生导师 ， 研究方向为转基因检测。Ｅ ｍ ｉ ｇｏｊ ９ ＠ ｉ ． ｏ － ａ ：ａｘ ３ ０ ｓ ａｃｎ ｌ ５ ｎ 的影响【 ． Ｊ 土壤， ０４ ３ （ ： ６ ６ ． 】 ２ ０ ， ６１ ５ — ０ ） 彭诚． 土壤施硒 对白菜和堇 叶碎米 荠生理指标 的影 响『 ． Ｊ 湖北 １ 民族学院学报， ０ ７ ２ （ ： ８ ９ ． ２ ０ ， ５１ ８ — ０ ） 院金渴， 王朴， 刘正兴， 土壤 施硒对大蒜生理 特性 、含硒量 等．
周大寨， 唐巧玉， 陈建英， 土壤 施硒对花椰菜硒质 量分数及 等．
ｐ ｓ ｅ ｓ ｓ ｏ ｒ ｔ ｘ ｃ ｔ ｗ ｔ ｏ ｔ ｃ ｍｐ ｏ ｓｎｇ ｔ ｅ ｕ ｄ ｍｅ ｔ ｌ ｏ ｓ ｓ ｅ ｌｗｅ ｏ ｉ ｉ ｙ ｉｈ ｕ ｏ ｒ ｍｉ ｉ ｈ ｆ ｎ ａ ｎ ａ ｅｆ ｃ ｏ ｓ ｌ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ：Ｃｏ ａ ｉｏ ｔ ｓ ｌ ｎ ｍｅ ｈ ｏ ｉ ｅ ｉ ｆ ｔ ｎ ｅｅ ｏ ｎ ｙ ｓ ｅ ｍｐ ｒｓ ｎ ｗｉ ｈ ｅｅ ｏ ｔ ｉｎ ｎ ｎ
第 ４ 卷 第 ｌ 期 ２ ０
２ １ 年 ｌ 月 ０１ ０
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SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数
的影响[J].土壤,2004,36(1):56-60.[31]彭诚.土壤施硒对白菜和堇叶碎米荠生理指标的影响[J].湖北民族学院学报,2007,25(1):88-90.[32]院金渴,王朴,刘正兴,等.土壤施硒对大蒜生理特性、含硒量及产量的影响[J].新疆农业大学学报,2010,33(1):19-22.[33]周大寨,唐巧玉,陈建英,等.土壤施硒对花椰菜硒质量分数及主要营养成分的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):121-123.[34]冶军,单维东,褚贵新.叶面喷施硒肥对大豆产量和质量效应的初步研究[J].新疆农业科学,2009,46(3):506-509.[35]郁飞燕,寇太记,张联合,等.硒对植物生理功能影响的研究进展[J].安徽农业科学,2008,36(26):11202-11204.[36]邵志慧,林匡飞,徐小清,等.硒对小麦和水稻种子萌发的生态毒理效应的比较研究[J].生态学杂志,2005,24(12):1440-1443.[37]贾宏昉,宋家永,王海红,等.硒对作物生理、生长发育及产量、品质的影响研究进展[J].河南农业大学学报,2006,40(4):449-454.[38]苏爱国,陈大清,李亚男.植物硫转运蛋白及其硒盐胁迫响应研究进展[J].长江大学学报,2008,5(1):70-73.[39]王晋民,赵之重,沈增基.叶面施硒对青花菜含硒量及产量与品质的影响[J].西北农林科技大学学报,2006,34(3):127-130.[40]Wang H L,Zhang J S,Yu H Q.Elemental selenium at nano sizepossesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes:Comparison with selenomethionine in mice[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42:1524-1533.[41]Huang B,Zhang J S,Ho J W,et al.Free radical scavengingefficiency of nano-se in vitro [J].Free Radical Biology and Medi-cine,2003,35(7):805-813.[42]周毅峰,吴永尧,唐巧玉.硒对大豆叶片谷肤甘肤过氧化物酶和过氧化氢酶歧化酶活的影响[J].湖北民族学院学报,2005,23(2):127-129.SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数
在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一位点进行多次同源重组，从而插入多个拷贝的外源基因。
而高拷贝的外源基因通常会导致其在毕赤酵母中的高表达［1］。
比较外源基因在毕赤酵母中表达量的差异时，如比较不同启动子的转录活性时，往往需要检测外源基因的拷贝数，筛选单拷贝整合外源基因的毕赤酵母菌株。
目前，在毕赤酵母的研究中，Southern blot 是运用最多的检测外源基因拷贝数的方法［2］。
但该方法需要大量的DNA ，工作量大，操作要求高。
近年来，荧光定量PCR 技术不断成熟，并已开始用于检测外源基因的拷贝数，如在转基因植物研究领域，已利用该项技术检测外源基因的拷贝数［3］。
但相关文献报道较少。
本文以毕赤酵母中的看家基因GAP （Glycer －aldehyde -3-phosphate dehydrogenase ）为内参，绿色荧光蛋白（GFP ）基因为报告基因，采用双标准曲线实时荧光定量PCR 法，建立了一种测定毕赤酵母中外源基因拷贝数的方法，现报道如下。
1.材料与方法1.1菌株及质粒大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115及质粒pPIC3.5K 均购自Invitrogen 公司；含GFP 基因的毕赤酵母GS115-KDR -P 菌株由本室保存；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。
1.2主要试剂及仪器Premix Taq （Ex Taq TM Version ）和连接试剂DNA作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海200237）.通讯作者：周祥山，E -mail ：xszhou@中国图书分类号Q789文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1236-05【实验技术】实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数宣姚吉周祥山张元兴【摘要】目的建立实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。
方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP 基因和绿色荧光蛋白（GFP ）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR 反应，建立标准曲线。
如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)
如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。
第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。
在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。
插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。
因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。
另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。
2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。
鸡马立克氏病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立
９ ６ ， 熔 解 曲线 分 析 显 示 其 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增 具 有 良好 的特 异 性 ， 敏 感 性 和 重 复 性 试 验 证 明该 方 法 具 有 较 高 的 灵敏 度 和 稳 定性 ， 最低 检 测 浓 度 为 １ ０ 拷 贝 ／ Ｌ。 同 时运 用 该 方 法 对 试 验 样 本 进 行 检 测 ， 结 果 显 示 在 ４个 感 染 组 鸡 只 的 肝 ， 脾， 肾， 胸腺 ， 法 氏囊 组 织 中 均检 测 出 Ｍｅ ｑ的拷 贝 ， 并 计 算 出 了待 测 样 品 的 病 毒 拷 贝 数 ， 相反在 未感染 组却 没有检测 出
Ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｒｅ ａ ｌ － ｔ ｉ ｍｅ Ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ Ｑｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ ｆ ｏ ｒ
Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｍａ ｒ ｅ ｋ ＇ ｓ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ Ｂａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ Ｓ ＹＢＲ Ｇｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ
氏病 的 一个 重 要 手 段 。
关 键 词 ：马 立 克 氏病 毒 ； Ｍｅ ｑ基 因 ； Ｓ ＹＢ Ｒ Ｇｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ实 时 荧 光定 量 Ｐ Ｃ Ｒ；检 测 中 图分 类 号 ：￥ ８ ３ １ ． ７ ；￥ ８ ５ ８ ． ３ １ 文 献标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ ０ ２ ６ ５ ０ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ — ０ ４ ２ ７ — ０ ６
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： 【 Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ］Ｔｏ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ａ Ｓ ＹＢ Ｒ Ｇｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ ｒ ｅ ａ ｌ — ｔ ｉ ｍｅ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｍａ ｒ ｅ ｋ Ｓ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ（ ＭＤ Ｖ） ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｌ ｙ ａ ｎ ｄ ａ ｃ ｃ ｕ ｒ ａ ｔ ｅ ｌ ｙ ．【 Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ］Ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ
三种荧光定量PCR检测方法比较
三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：<1> SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链DNA 结合后, 荧光大大增强。
因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。
PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。
这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。
<2> 水解探针模式<taq man探针>TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。
当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
因此Taqman 探针检测的是积累荧光。
PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。
实时定量PCR检测转基因绵羊拷贝数
实时定量PCR检测转基因绵羊拷贝数赵帅;王立民;王聪慧;唐红;张宾;郭延华;张译元;赵兴旺;丁新平【摘要】[目的]利用高通量、快速、灵敏的实时荧光定量PCR法,检测转类胰岛素样生长因子1-红色荧光蛋白基因(insulin-like growth factor 1-red fluorescent protein,IGF1-RFP)绵羊中外源基因的拷贝数.[方法]以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为绵羊的内源参照基因,梯度稀释法.[结果]分别获得RFP和GAPDH基因的Q值与起始模板数的相关性标准曲线,R2分别为0.999和0.999,相关性高.通过比较目的基因RFP和GAPDH起始模板数,得到外源基因在转基因绵羊中的拷贝数.编号0152、0216、0217、0218的转基因绵羊拷贝数分别为3、1、1、1.[结论]以IGF-Ⅰ转基因细毛羊为研究对象,针对外源基因序列和内源参照基因序列设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR法对IGF-Ⅰ转基因细毛羊外源基因的拷贝数进行检测,并且准确检测外源基因的拷贝数.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2015(052)008【总页数】5页(P1517-1521)【关键词】转基因绵羊;实时荧光定量PCR;拷贝数【作者】赵帅;王立民;王聪慧;唐红;张宾;郭延华;张译元;赵兴旺;丁新平【作者单位】石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000;新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000;新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000;新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000;新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000;石河子石总场畜牧兽医服务中心,新疆石河子832011;新疆西部牧业股份有限公司紫泥泉种羊场,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】S852.16【研究意义】转基因动物是通过各种实验方法，将已知的外源性基因导入动物基因组内并使之整合到染色体上，且外源性基因能稳定地遗传给后代的动物。
sybr green荧光定量pcr原理
sybr green荧光定量pcr原理
Sybr Green I的实际名称是二(4-羟基苯基)-6(4-甲氧基苯基)-三甲基吡啶三乙酸铵，是由美国绿色流动技术(Invitrogen)推出的一种新型定量荧光染料。
荧光染料可以与双链DNA或RNA特异性结合，在发光光度受到激活基因上的复制影响时，就可以快速、特异性
地检测到基因表达水平及其变化。
说白了，Sybr Green I荧光染料可以反映出基因特异度复制数、拷贝数及表达量。
由于Sybr Green I的荧光发射集中在500nm附近，因此把它用作qPCR的检测染料是
一个不错的选择。
另外，它的特性还表明它可以作为双链DNA特异性结合的染料，包括基
因检测、筛选特异性cDNA文库等。
Sybr Green I的定量检测原理是：在Sybr Green I染料的体系中，双链DNA和Sybr Green I结合之后，会使染料发出一种特殊的荧光，当基因发生复制时，双链DNA会越来
越多，Sybr Green I染料中结合的双链DNA会越来越多，随之形成新的染料-DNA复合物，同时使荧光发射强度增加。
最终，通过荧光定量仪记录荧光的强度，就可以获得目的基因
的复制状态和相应复制产物的量。
Sybr Green I也具有应用程度高、成本低、容易操作、体系稳定等优点。
Sybr Green I主要是作为定量PCR的检测染料，它能够检测和定量分析特定基因序列，比传统定量
PCR技术更灵敏、更精准，并可以作为SNP和MLPA扩增研究的PCR定量方法。
SYBR Green I核酸染料说明书
SYBR Green I核酸染料说明书货号：SR4110规格：50/100ul保存：-20℃避光保存，有效期至少一年。
产品说明：SYBR Green I染料是一种直接与双链DNA(dsDNA)结合的荧光染料，是荧光定量PCR最常用的DNA 结合染料。
在定量PCR中，SYBR Green I可与双链DNA（dsDNA）非特异性结合后发出荧光，则可以通过检测反应体系中的SYBR Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。
游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，一旦与dsDNA结合，其荧光增加1000倍，一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsDNA 量成比例，且会随扩增产物的增加而增加；所以通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的熔解温度。
使用说明：使用时，配置PCR反应混合液，将10000×SYBR Green I浓缩液加入到PCR反应体系，使终浓度为0.5×（0.2×到1×之间调整）。
以上操作建议在冰上进行。
注：①反应液配制方法和PCR扩增条件请参照DNA聚合酶使用说明。
②Realtime PCR扩增仪的使用方法，请参照各仪器说明书。
注意事项：使用浓度对荧光PCR结果的影响SYBR Green I的使用浓度是保证荧光定量PCR实验成功非常关键的因素。
如果SYBR Green I的浓度过低会使荧光信号的变化降低，这就意味着低拷贝的样品可能无法检出；而在高浓度时，将会抑制PCR反应，降低PCR反应效率。
所以一般在使用SYBR Green I时应根据实际情况优化使用浓度，反应的终浓度为0.2×到1×之间。
镁离子浓度的影响提高镁离子浓度可以降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用。
我们建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时，镁离子浓度比无SYBR Green I的普通PCR反应高出0.5～3mM。
SYBR Green实时定量PCR检测外源基因拷贝数
Ｓ Ｂ ｅ ｎ实 时 定 量 Ｐ Ｒ检 测 外 源 基 因 拷 贝 数 Ｙ Ｒ Ｇｒｅ Ｃ
庄 强， 钱 程 ，刘 立
（ 浙江理 工大学生命科 学院 ， 州 ３ ０ １ ） 杭 １ ０ ８
摘 要 ：以 Ｓ Ｒ Ｇｒｅ ＹＢ ｅｎ为 荧光 染料 ， 过 携 带 双 基 因 ＧＦ 通 Ｐ和 Ｉ－４的 质 粒 标 准 品 绘 制 双 标 准 曲 线 ， 以 绝 对 Ｌ２ 并
量口 ， 该方 法测 定时需 满 足两 大前 提条 件 ： 标 准品 的制作 ， ｊ用 ① 由于标 准 品通常 是通 过 Ｓ ｕｈｒ ｌｔ 来 确 ｏ ｔｅｎｂｏ 法
立的， 因此 这一前 提 条件 已经 在很 大程度 上 限制 了该方 法 的广 泛应 用 ； 基 因组 Ｄ ② ＮＡ 的准确 定 量［５， ４］ 而通 － 过测定 ＤＮＡ 的质量 来确 定基 因组 的总数 总是增 大 了操作 上 的误差 。另一 种 则是 以基 因组 上 已知拷 贝数 的 内源基 因作 为 内参 ， 过相 对 定量法 来 确 定 外源 基 因 的拷 贝数 ］ 通 。即 建 立 内参 基 因 的 Ａ 法 就 能 克 服第 Ｃｔ
０ 引 言
利用 实时荧 光定 量 Ｐ Ｒ 的方法 来检 测外 源基 因 的拷 贝数 是 近 几 年迅 速 发 展起 来 的新 方法 ， 以快速 、 Ｃ 它 安全 、 成本 低等优 点 渐渐取 代 了价格 昂贵 、 时 费力 的 Ｓ ｕｈ ｒ ｌｔ 口 ］ 费 ｏ ｔ ｅｎｂｏ 法 。 。在 实 际应用 中该方 法 主要 体 现 在两种 方式 上 ： 种 是 利 用 已知 外 源 基 因 拷 贝数 的 基 因组 作 为标 准 品 ， 过 建 立 标 准 曲 线 来 进 行 绝 对 定 一 通
第 ２ 卷 ７
sybr green荧光定量pcr原理
sybr green荧光定量pcr原理实时荧光定量聚合酶链反应（Real-TimeFluorescenceQuantitative-PolymeraseChainReaction，简称Real-Time PCR或RT-PCR）是一种新兴的现代技术，可以检测的某个特定的DNA序列存在的量，并可将该序列的样品分类为病毒感染的载体和非感染的载体。
它的特点是其高的灵敏度，快的反应速度以及能够以一个低的浓度进行检测。
SYBR Green，又名SYBR Green I，是一种荧光染料，正是因为它，才使得Real-Time PCR能够实现定量检测，取得了极大的成功。
二、SYBR Green荧光染料的原理SYBR Green是一种荧光染料，可以被用于Real-Time PCR技术，并能反映在PCR过程中特定DNA基序列扩增的变化。
SYBR Green染料是一种可被氨基酸体系吸收的荧光染料，可以在反应基质中吸收发出荧光。
最关键的是，当DNA聚合酶正式介入PCR循环时，它们可以将SYBR Green染料与溶液中的DNA结合，使染料开始发射荧光，从而实现特定DNA片段的检测。
三、SYBR Green荧光定量PCR的应用SYBR Green荧光定量PCR大大简化了实时PCR技术，使其在临床检测中发挥得更强大的作用。
最常见的应用是对细菌、病毒和真菌感染的研究，以及比较样本的分析，是检测细菌、病毒及真菌抗药性的有效方法。
此外，SYBR Green荧光定量PCR还可用于检测某些特殊的基因组和基因片段，例如检测BRCA1和BRCA2基因和HER2/neu基因的突变等。
四、总结从上文可以看出，SYBR Green荧光定量PCR在实时PCR技术中发挥了重要的作用。
SYBR Green荧光染料是这一技术的核心，它通过与DNA结合使荧光染料发出荧光，从而实现特定DNA片段的检测。
它大大简化了实时PCR技术，广泛应用于临床检测，如检测细菌、病毒及真菌感染以及疾病基因突变等。
一种定量PCR检测转基因细胞中外源基因拷贝数的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510218245.6(22)申请日 2015.04.30(71)申请人 嘉和生物药业有限公司地址 201203 上海市浦东新区张衡路1690号3号楼1-4层(72)发明人 薛建华 黄雪怡 徐水清 (74)专利代理机构 上海天翔知识产权代理有限公司 31224代理人 高迷想(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)(54)发明名称一种定量PCR检测转基因细胞中外源基因拷贝数的方法(57)摘要本发明涉及一种转基因动物细胞CHO中抗体分子的轻重链基因拷贝数的定量检测方法，采用SYBR-Green定量PCR方法，实现对抗体分子的轻链基因拷贝数和重链基因拷贝数进行定量、准确、高通量的检测。
本发明的方法检测灵敏度高且线性范围宽、结果可靠，可用于研究抗体细胞株的稳定性，筛选出稳定的高表达的工程化细胞株。
权利要求书2页 说明书10页序列表3页 附图4页CN 106191216 A 2016.12.07C N 106191216A1.一种SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中抗体重链基因拷贝数的方法，其特征在于，所采用的正向引物和反向引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。
2.如权利要求1所述的SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中重链基因拷贝数的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：a)合成针对抗体重链基因的特异性正向引物JHc-1F和特异性反向引物JHc-1R，以完整抗体的重链DNA作为模板进行普通PCR扩增，制备出带有重链片段的质粒DNA，从而制备重链质粒DNA标准品；所述JHc-1F的序列如SEQ ID No.7，所述JHc-1R的序列如SEQ ID No.8所示；b)以SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物、以步骤a)中的带有重链片段的质粒DNA标准品作为模板进行定量PCR反应，计算质粒DNA的拷贝数，建立PCR反应标准曲线；c)提取转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA和未转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA作为模板，采用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的正向引物和反应引物，进行定量PCR反应，同时用无菌超纯水作为空白对照；定量PCR反应结束后获得Ct值，并进行溶解曲线的试验，根据Ct值和步骤b)中的标准曲线计算动物细胞中抗体分子的重链基因拷贝数；上述步骤b)和c)中，在进行定量PCR扩增时，其定量PCR反应的总体积是30μl：SYBR Green PCR Mix 15μl，10μM浓度的正向引物0.5μl，10μM浓度的反向引物0.5μl，DNA 模板10μl，无菌超纯水，4μl；其定量PCR反应条件为：先95℃10min，随后依次95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40个循环。
SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺中抗体基因稳定性
Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ ｏｆ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ ｔｉｍ ｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ
ＣＨＥＮ Ｊｉ－ｊｕｎ，ＡＮ Ｃｈｅｎ，ＱＩＮ Ｈａｉ—ｙａｎ，Ｑｉａｏ Ｙｕ—ｌｉｎｇ，ＮＡＮ Ｊｉａｎ－ｊｕｎ，ＳＯＮＧ Ｌａｎ—ｌａｎ，ＸＩＯＮＧ Ｙｉｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｙｉｎｇ，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｅｔ ｕｐ ａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｉｎ
ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｗｅｒｅ ｃａ￣ｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ｄａｙ ０，７，ｌ４，２１ ａｎｄ ３５ ｆｒｏｍ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ＣＨＯ ｃｅｉｌｓ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ００３一 ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｙ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎ—
中 华 仓 鼠 卵 巢 细 胞 （Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ， ＣＨＯ），以下 简称 ＣＨＯ细 胞 ，是 最 为常用 的哺 乳动 物 重组蛋 白表 达 系 统 ，广 泛 用 于 单 克 隆抗 体 、细胞 因 子 、糖基 化 酶及疫 苗等 的表 达研 究 。ＣＨＯ细 胞 的大 规模 培养 方式 通常 为批 培养 、流加 培养 和灌 注培 养 ， 以批 培养 和流加 培 养为 主 。灌 注培 养需 在培 养过 程
如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)
如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。
第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。
在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。
插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。
因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。
另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。
2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。
SYBGreen染料荧光定量原理
SYBGreen染料荧光定量原理sybgreen是用于QPCR的荧光染料，拟提出的问题实际上就是定量PCR(QPCR)的原理和方法。
可以参考有关书籍很多。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。
C代表Cycle，t代表threshol，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下： 1）TaqMan 荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达
SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达唐洁;申林;李柏青;赵皓;余晾;郑洪波【摘要】目的:观察SYBR Green相对定量逆转录聚合酶链反应(RQ-PCR)方法检测急性髓系白血病(AML)患者外周血单个核细胞(PBMC)中脑和急性白血病细胞胞质(BAALC)基因mRNA的表达水平.方法:分离12例初发AML患者和5名健康成年人PBMC,以白血病细胞株K562为阳性对照,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,SYBR Green相对定量RQ-PCR检测BAALC基因表达水平.结果:健康成年人PBMC中检测不到BAALC mRNA的表达,12例AML患者中,有8例BAALC mRNA高表达,与K562比较,其相对值为K562的0.8～5.6倍.结论:用SYBR Green相对定量RQ-PCR可以检测到AML患者PBMC中BAALC基因的表达,该方法稳定、敏感、可靠.【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2010(035)007【总页数】4页(P656-659)【关键词】基因表达;白血病;细胞胞质基因;逆转录聚合酶链反应【作者】唐洁;申林;李柏青;赵皓;余晾;郑洪波【作者单位】蚌埠医学院,免疫学教研室,感染与免疫安徽省重点实验室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院,中心实验室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院,免疫学教研室,感染与免疫安徽省重点实验室,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院第一附属医院,中心实验室,安徽,蚌埠,233004;蚌埠医学院第一附属医院,中心实验室,安徽,蚌埠,233004;蚌埠医学院第一附属医院,中心实验室,安徽,蚌埠,233004【正文语种】中文【中图分类】Q343.1;R733.71脑和急性白血病细胞胞质基因(brain and acute leukemia,cytoplasmic,BAALC)位于染色体 8q22.3,主要表达在造血前体细胞和神经外胚层组织中,而发育成熟的骨髓和外周血单个核细胞不表达,其所编码的蛋白与任何已知蛋白或功能域均无同源性。
实时定量PCR数据分析
相应版主号召，也贴一下我对定量数据处理的理解但是发现一篇文章写的比我表述的更好就先拿上来贴上以飨各位看客现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2 - △△CT 方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种 2 - △△CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（ 1 － 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量PCR 技术（ 4 ， 5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。
通过实时PCR 进行绝对定量已有多篇报道（ 6 －9 ），包括已发表的两篇研究论文（10 ，11 ）。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说X 基因在经过某种处理后表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。
用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。
2 - △△CT 方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化： 2 - △△CT 公式的推导, 以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介绍。
实时荧光定量PCR操作步骤
v201412Da
目
录
内 容
页 码
● 制品说明 ● 试剂盒原理 ● 制品内容 ● 试剂盒外必备主要试剂和仪器 ● 保 存 ● 使用注意 ● 操作方法 ● 实验条件的选择 ● 附 录 ● 质量标准 ● 关联产品
1 1 2 2 2 3 3 8 9 11 11
● 制品说明
本制品是采用 SYBR® Green I*嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。 制品中含有 Real Time PCR 反应的最适浓度 SYBR® Green I，是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，进行实验时，PCR 反应液的 配制十分方便简单。 本制品中还添加了 Tli RNaseH(耐热性 RNaseH)，以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，可以最大限度抑 制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 本制品 Buffer 经过改良， 使反应特异性比 SYBR® Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) （Code No.RR420A） 更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本 Buffer 和 Hot Start 法用 DNA 聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS 组合使用，可以进行重复性好、可信度高的 Real Time PCR 解析。 特长： 1. 适用于 Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2. 在 2×浓度的 Premix 中，预先混有 SYBR® Green I，PCR 反应液配制时，只需加入模板、引 物、灭菌蒸馏水便可进行 Real Time PCR 反应，操作简单方便。 3. DNA 聚合酶使用了 TaKaRa Ex Taq HS，可以进行 Hot Start 法 PCR 反应，再与 Takara Bio 公司独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 4. 在 2×浓度的 Premix 中， 预先添加了耐热性 RNaseH(Tli RNaseH)， 可以最大限度抑制以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 *：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR® 为 Molecular Probes Inc.的注册商标。
SYBR Green 实时荧光定量聚合酶链反应宽范围检测人GAPDH基因体系的建立
SYBR Green 实时荧光定量聚合酶链反应宽范围检测人GAPDH基因体系的建立李喆;张影;徐颖华;辛晓芳【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2015(000)022【摘要】目的：建立一种快速、灵敏的人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因实时荧光定量-聚合酶链反应（RT-PCR）方法。
方法根据GeneBank数据库中提供的人GAPDH基因（NC＿000012）mRNA序列，在其保守区域设计一对用于RT-PCR引物，通过优化反应体系和反应条件，成功建立了检测人GAPDH 基因的SYBR Green RT-PCR方法。
结果实验结果表明，该检测方法检测人G A PD H基因的最低检测拷贝数可达到15 co pies／μL ，在一个较宽的浓度范围内（1．5×101～1．5×107）具有良好的线性关系（r＝0．992）。
溶解曲线呈现了清晰的单一峰型，Tm值为（84．5±0．2）℃。
结论该研究为人GAPDH基因作为内参基因进行人功能基因与病原基因表达的定量分析提供了一种更为快速、灵敏的方法。
【总页数】3页(P3229-3231)【作者】李喆;张影;徐颖华;辛晓芳【作者单位】中国食品药品检定研究院/计生委生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050;中国食品药品检定研究院/计生委生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050;中国食品药品检定研究院/计生委生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050;中国食品药品检定研究院/计生委生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050【正文语种】中文【相关文献】1.人类Gfi1基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 黄敏;欧东梅;徐金环;张晓梅;张义成2.SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立 [J], 孙秀静;朱圣韬;徐有青;张澍田3.TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 赵克学; 许淑娟; 马瑞仙; 耿金静; 刘杨; 李琼毅; 冯若飞4.牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 [J], 于德斌;曹存;徐晓静;于力;常继涛5.鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 郭慧芳;李宁;王白玉;乔麒龙;黄庆;李永涛;王增;赵军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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作 者 简 介 裘 劫人 （９ ５一 ） 女 ， 江 绍 兴 人 ， 士 研 究 生 。 究 方 向 ： １８ ， 浙 硕 研 植物分子 学， — ａｌｒｉ ｄｏ ａ ＠ ｓ ａ ｃｍ。 通讯 作 者。 Ｅ ｍ ｉ ｅａ ｃｎｎ ｉ ． ０ ： ｎ ｎ
３ 个循环； ０ｍｎ Ｃ ０ ７ ｏ １ ｉ。Ｐ Ｒ产物使用 Ａ Ｐｅ Ｎ ２Ｃ ｘｒ ｐＤ Ａ凝胶回
将得到的纯合转基 因植物种子进行后续试验 。纯合的种
。因 此 ， 鉴定 转 基 因 的拷 贝
子在 １２Ｍ ／ Ｓ培养基（．％琼脂、．％蔗糖，Ｈ５８ 上培养 ０８ １０ ｐ ．）
萌发 。培养皿 放在 光 照 培养 箱 里 ２ ４ ｈ光 照培 养 ， 照强 度 光
７ Ｌ ｏ （ ・ ） 温度 （２ ０±０ ５ 。 。培养 １ ０Ｉ ｌ ｍ ｓ ， ． ／ ｍ ２． ． ）Ｃ ０ｄ后 ， 出 取
究 提供理论依 据 。
１ 材 料 与 方 法
拷 贝数和 位点都 不 固定 。而外 源基 因 的拷 贝数 显 著影 响插 入基 因 的表 达量和遗传稳 定性 。据 统计 分析 ， 源基 因在植 外 物基 因组 中的整 合点 多 为 １ ２ 。 当插入 基 因 的拷 贝数 或 个 为１ ２ 或 个时 ， 通 常会 高水 平 表达 所转 入 的外 源 基 因 。 植物 若插 入的拷 贝数较多 时 （ ４～ 如 ５个 ）则 会导 致 表达 的不 稳 ，
ｔ ｅｆ ｏｅ—ｅｃ ｕ ｎｉ ｔ ｅＰ Ｒ， Ｔ Ｑ Ｐ Ｒ） １９ ｉ ｕｒｓｃｎｅｑ ａｔａ ｖ Ｃ Ｒ Ｆ Ｃ 是 ９ ６年 由 ｍ ｌ ｔｉ 美 国 Ａ ｐｉｄＢｏｙｔｍ 公 司推出 的一种新 定量试验 技术 。 ｐ ｌ ｉｓｓ ｓ ｅ ｅ
１２１ Ｄ Ａ提取 与定量 。用 Ｃ Ａ ．． Ｎ Ｔ Ｂ法 提取基 因组 Ｄ Ａ Ｎ 。基
Ｃ Ａ ＡＣ Ｃ Ｉ ＡＡＧ ＡＡＣ ＡＣ ３ ； ｓ ５－ ＴＡ Ｔ ｌ ＣＣ Ｃ Ｇ一 ， Ｃ Ｔ ＧＣＡ Ｔ ＣＧＣ ＴＣ ＣＣ —
Ｃ 一 。使用 Ｔ ＫＲ ｉ ｅ ｎｌ ｙ的 Ｐ Ｒ反应试 剂 。２ ｌ Ｇ３ ａ ａａＢｏ ｃ ｏ ｇ ｔｈ ｏ Ｃ ５ Ｐ Ｒ体 系 中含有 １ ｌ Ｅ ８ Ｃ Ｒ 质粒模 板 。Ｐ Ｒ程序 ： ｐ Ｃ ９ ４℃预变 性 １ ｉ； ０ｍｎ９ ４℃变性 ３ ， 退火 ３ ， 延伸 ３ ， ０Ｓ５ ｏ ６Ｃ ０Ｓ７ ｏ ２Ｃ ０Ｓ共
收试剂 盒 （ Ｘ Ｇ Ｎ Ｂｏ ｉ ｃｓ 纯 化后 用 于后 续 试 验 。经 Ａ Ｙ Ｅ ｉｃ ｎｅ） ｓｅ 纯化 的探针 与 Ｄ ２０ Ｎ ａ ｅ（ａ ａ ａ ｉｅｈｏ ｇ） Ｌ００Ｄ ＡＭ ｋｒＴＫ Ｒ ｏ ｅｎｌ ｙ 在 ｒ Ｂｔ ｏ
１２ ２ Ｓ ｕ ｅ ｌｔ 法 所用 探 针及 其 扩增 所 用 引物 。探 ． ． ｏｔ ｒ Ｂｏ 方 ｈｎ
针为 Ｔ Ｄ Ａ上一段序列 ， —Ｎ 全长 ４ ４ ｂ ， ６ ｐ 经过 拟南 芥全基 因组
检测荧光 量的变化 ， 获得不 同样 品达 到一定荧光信 号 （ 阀值 ） 时所需 的循环次 数一Ｃ 值 （ ｙｌ Ｔｒｓ ｌ）进 而通过 计算 Ｃｃ ｈｅ ｏ ， ｅ ｈｄ 对 模板进 行准确定 量 。 目 ， 术通 常被用来 检 测 目的 前 该技 基 因 的表 达量 。有 文 献报 道 使用 Ｔｑ ａ 时定 量 Ｐ Ｒ技 ａｍ ｎ实 Ｃ
因组 Ｄ Ａ样 品与 Ｄ ２０ Ｎ ｒｅ（ ａ ａ ａＢｏ ｃ ｎｌ— Ｎ Ｌ ０ ０ Ｄ Ａ Ｍａｋ ｒ Ｔ Ｋ Ｒ ｉｔ ｈ ｏｏ ｅ ｇ ） １０ ｙ 在 ．％琼 脂糖 凝 胶上 电泳 ， 过亮 度 对 比来 确 定 Ｄ Ａ 通 Ｎ
样 品的浓度 。
其基本原 理 是 在 Ｐ Ｒ反 应 体 系 中 加入 非 特 异 性 荧 光 染 料 Ｃ （ Ｓ Ｂ ｒｅ ） 如 Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎ 或特异 性荧光探 针 （ Ｔ ｑ ａ 如 ａ ｍ ｎ探针 ）实 时 ，
Ｅ ｔ ｔ ｇｔｅＣｏ ｙ Ｎｕ ｅ ｆ ａ ｓｅ ｅ ｒ ｎｆｒ ｄＡｒ ｂｄｐ ｉ ｂ ＹＢ Ｇｒｅ ａ－ｍｅＱｕ ｎｉ ｔ ｅＰＣ ｓｉ ｉ ｈ ｐ ｍｂ ｒｏ ｎ ｇ ｎ ｓｉ Ｔ ａ ｓ ｍｅ ａ ｉｏ ｓ ｙ Ｓ Ｒ ｅ ｎＲｅ ｌ ｉ ａ ｔａｉ Ｒ ｍａ ｎ Ｔｒ ｎ ｏ ｓ ｔ ｔ ｖ Ｑｉ Ｊｅｒｎ ｅ ｌ （ ｏｌｇ ｆ ｉ ｃｅｃ ｓ ａ ｊ ｇＵ ｉｅｓｙ ａ ｊ ｇ Ｊａ ｇｕ２ ０ ９ ） Ｕ ｉ－ｅ ｔａ Ｃ ｌ ｅｏ ｆ Ｓ ｉ ｅ ，Ｎ ｎｉ ｎｖ ｒｉ ，Ｎ ｎｉ ， ｉｎｓ １０ ３ ｅ Ｌｅ ｎ ｎ ｔ ｎ Ａｂ ｔａ ｔ 『 ｊｃｉ Ｔ ｘ ｌｒ ｅｆａｉｉｔ ｆｕｉｇＳ Ｒ Ｇ ｅｎｒａ—ｍｅ ｑ ａｔａｉｅＰ Ｒ ｔｃ ｎｑ ｅｔ ｅｔ ｔ ｔｅｔ ｎｇ ｎ ｏｙ ｓ ｃ Ｏｂｅｔ ｅｌ ｏｅ ｐｏｅｔ ｅｓ ｌｙｏ ｓ ＹＢ ｒｅ ｅｌｔ ｕｎｉ ｔ Ｃ ｅｈ ｉｕ ｏ ｓｍａｅ ｈ ｒ ｓｅ ｅｃｐ ｒ ｖ ｈ ｂｉ ｎ ｉ ｔｖ ｉ ａ ｎ ｍｂ ｒｏ ｒｎｇｎｃｐａ ｔ Ｍｅｈ ｄ ｕ ｅ ｆａｔ ｓｅ ｉ ｌｎ．『 ｔｏ ］Ｕｓ ｇＳ Ｂ ｒｅ ｅｌｔ ｕｎｉ ｔ ｅＰ Ｒ ｔｃ ｎｑ ｅ ｅｈ ｖ ｅｅｍｉｅ ｈ ｏｙｎ ｍｂ ｒ ｆ ａ ｉ Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎｒａ—ｍｅｑ ａ ｔａｉ Ｃ ｈ ｉｕ ，ｗ ａｅｄ ｔｒ ｎ ｄｔｅｃｐ ｕ ｅｓｏ ｎ ｉ ｔｖ ｅ
安 徽 农 业 科 学 。ｏｒａ ｏ ｎ ｕ Ａ ｒ．Ｓｉ２ １ ，９（１ ：２ ５ Ｊｕｎｌ ｆ ｈ ｉ ｇｉ ｃ．０ １３ ２ ） １６ ５—１６７ Ａ ２ ５
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利 用 Ｓ Ｂ ｒｅ Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎ实 时定量 Ｐ Ｒ法检 测 转 基 因植 物 外源 基 因的拷 贝 数 Ｃ
裘劫人， 颖， 许 喻富根 （京 学 命 学 院江 南 １９ 南 大 生 科 学 ，苏 京２０ ） ０３
摘要 ［ 目的］ 讨 Ｓ Ｂ ｒ ｎ实时定量 Ｐ Ｒ技 术应 用于检测 转基 因植 物外 源基 因拷 贝数 的可行性 。［ 探 Ｙ ＲＧｅ ｅ Ｃ 方法 ］ 用 Ｓ Ｂ ｒ ｎ实时定 使 Ｙ Ｒ Ｇｅ ｅ 量 Ｐ Ｒ技 术 ， Ｃ 以转 Ｃ Ｃ ３ １ Ｙ Ｄ ； 的拟 南芥 为材料 ， 通过 Ｃ Ｃ ３１ 因与单拷 贝 内参基 因以及 转 基 因株 系 中的 Ｃ Ｃ ３１ 因与 野生 型植株 ＹＤ ； 基 ＹＤ ； 基 的比较 来确定外 源基 因的拷 贝数 。［ 结果 ］ 法计算所得 外 源基 因拷 贝数 与传 统 高准确 性的 Ｓｕ ｅ ｌ 法结果 相符 。［ 该 ｏｔ ｍ ｂ ｔ ｈ ｏ 结论 ］ 用该 使 法检测 外源基 因拷 贝数 简单 易行 ， 可操 作性 强。 关 键词 转基 因拟 南芥 ；Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎ实时定量 Ｐ Ｒ； 因拷 贝数 ＳＢ ｒ ｅ Ｃ 基 中图分类 号 Ｓ ８ ． １８ １ 文 献标 识码 Ａ 文章编 号 ｏ １ — ６ １ ２ １ ） １ ２ ５ ０ ５７ ６ １ （０ １ ２ —１６５— ３
遗传 育种 ， 而且也成 为植物生 理生化 研究 的重要 手段 。利用 由土壤农杆 菌介导 的植 物遗传转化 方法 获得 的转基 因植 物 ， 首 先面临 的就是外 源 基 因拷 贝数 的确 定 。这 是 由于在 这一 植 物遗传转 化方法 中使用 的由 ｒ 质粒 修 改而 成 的转化 载体 ｒ ｉ
ｉ ｉ ｌ ｓ ｓｍｐｅ，ｅｆｃｉｅａ ｄ ｓ ｆ ｏ ｓｉ ｔ ｇ ￣ａ ｇ ｎ ｏ ｙ ｎ ｍｂ ｒ． ｆ ｔ ｎ ａｅ ｆｒｅｔｍａｉ ｅ ｖ ｎ ｎｓｅ ｅ ｃ ｐ ｕ ｅｓ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｔｒｎ ｇ ｎｃＡｒ ｂｄ ｐ ￣； ｙ ｗｏ ｄ ａ ｓ ｅ ｉ ａ ｉｏ ｓ ＳＹＢＲ ｒ ｅ ｅ １ｔｍｅ ｑ ｎｉ ｔ ｅ ＰＣ ； ｎ ｏ ｙｎ ｇ ｅ ｎ ｒ ａ ｉ ｕａ ｔａｉ Ｒ Ｇｅ ｅ ｃ ｐ ｕｍｂ ｒ ｔ ｖ ｅ
通常使 用的鉴 定转 基 因拷 贝数 的方法 是 Ｓｕｈｒ ｌｔ ｏ ｔｅｎＢｏ。 该方 法 的优 点是 准确 性高 ， 一种 被普 遍认 可 的鉴定 方法 ， 是
植物材 料用于 Ｄ Ａ提 取 。 Ｎ １２ 方 法 ．
Байду номын сангаас
但也存在明显的缺点， 如步骤繁琐、 耗时费力 、 需要大量植物
材料 。由于要使用 有一定危 险性 的放 射性 同位 素 ， 因此对 试 验场 地和废物 处理要求甚 高。实时荧光 定量 Ｐ Ｒ技术 （ｅ — Ｃ ｒｌ ａ
基 金 项 目 国 家 自然科 学基 金 项 目（ ０７ ０ ６ 。 ３ ２０ ８ ）
比对 ， 确定探针 的特异 性较 好 。探 针 片段 以 ｐ Ｒ Ｅ ８质粒 为模 板扩增 获得 。引物 （ 由软 件 Ｐ ｍ ｒＰ ｍ ｒ ． 设 计 ） ａ５一 ｒ ｅ ｒ ｅ５０ ｉ ｉ ：，
中， 携带外 源基 因的 ＴＤ Ａ随机插 入植 物 基 因组 内 ， 入 的 —Ｎ 插
需 要 ， 安全 、 且 无放射性 。但 由于 需要合 成和 标记 发光基 团，
因此 Ｔｑ ａ 探针的价格较高 。为此 ， ａｍ ｎ 。 笔者介绍了一种使
用 更加经济 的 Ｓ Ｂ ｒ ｎ实时 定量 Ｐ Ｒ检 测转 基 因 拟南 Ｙ ＲＧ ｅ ｅ Ｃ 芥 中外源基 因拷贝数 的方法 ， 旨在为鉴 定转 基 因拷 贝数 的研
定， 甚至发 生基 因沉 默现 象
数是 至关重要 的一步 。
１ １ 材料 ．
带有细胞周期 蛋 白基 因 Ｃ Ｃ ３ １的 ｐ Ｒ ＹＤ ； Ｅ ８质粒
通过土壤农杆菌导入 Ｃｌ ｂａ ｏ ｍ ｉ生态型野生型拟南芥（ ｒ ｉ ｕ Ａａ — ｂ