酶学及酶工程课2章4节1
有关酶的参考书
有关酶的参考书1．《酶学》作者：郑穗平，郭勇，潘力编著出版社：科学出版社出版时间：2009-9-1 定价：49元目录：前言第一章绪论第一节酶的基本概念第二节酶的分类与命名一、蛋白类酶的分类与命名二、核酸类酶的分类第三节酶的活力测定第四节酶的催化特性一、酶催化作用的专一性二、酶催化作用的效率三、酶催化作用的条件第五节酶的分离纯化一、细胞破碎二、提取三、离心分离四、过滤与膜分离五、沉淀分离六、层析分离七、电泳分离八、萃取分离第二章酶的结构与功能第一节酶的化学组成一、蛋白类酶的基本组成单位一一氨基酸二、核酸类酶的基本组成单位——核苷酸三、酶的辅助因子第二节酶的化学结构一、酶蛋白的化学结构二、酶RNA的化学结构第三节酶的空间结构一、酶蛋白的空间结构二、酶RNA的空间结构第四节酶的活性中心一、酶活性中心上的残基二、接触残基附近的肽链一级结构第五节酶的结构与功能的关系一、酶的一级结构与催化功能的关系二、酶的二、三级结构与催化功能的关系三、酶的四级结构与催化功能的关系第六节酶分子修饰一、酶分子的主链修饰二、酶分子的侧链基团修饰三、酶分子的组成单位置换修饰四、金属离子置换修饰五、酶分子的物理修饰第三章酶的催化作用机制第一节趋近与定向效应第二节构象变化效应一、底物诱导酶分子的构象发生改变二、酶分子诱导底物分子的构象发生改变第三节微环境效应一、胰凝乳蛋白酶催化的微环境效应及其催化机制二、溶菌酶催化的微环境效应及其催化机制第四节酸碱催化机制一、酶蛋白中的酸碱催化基团二、共轭酸与共轭碱的催化通式三、核糖核酸酶的酸碱催化过程第五节共价催化机制一、亲核催化二、亲电催化第六节自我剪接机制一、Ⅰ型内含子剪接酶的剪接机制二、Ⅱ型内含子剪接酶的催化机制第七节自我剪切机制一、锤头形核酸类酶的自我剪切机制二、发夹形核酸类酶的自我剪切机制第八节酶作用机制的研究方法一、X射线衍射法二、中间产物检测法三、酶分子修饰法四、酶反应动力学方法第四章酶反应动力学第一节单底物反应动力学一、引言第五章酶的生物合成及调节机制第六章酶分子的定向进化主要参考文献2.《现代酶学》（第二版）作者：袁勤生主编出版社：华东理工大学出版社出版时间：2007-5-1 定价：58目录：1 酶与应用酶学1.1酶学研究概况1.2从分子水平研究酶的结构与功能1.2.1酶的分子结构1.2.2结构与功能的研究1.3用分子生物学方法改进酶的催化特性及设计新酶1.3.1酶结构与功能关系研究是关键1.3.2基因工程酶1.3.3酶的蛋白质工程构建1.4构建酶---核酶、抗体酶、模拟酶、分子印迹酶1.4.1核酶1.4.2抗体酶1.4.3模拟酶1.4.4分子印迹酶1.5酶工程中的若干应用热点2 酶的分类组成及结构特征3 酶作用动力学和酶的抑制作用4 酶活性的调节和酶的转换5 酶的作用机制6 同工酶7 酶化学修饰的定量处理及不可逆抑制动力学8 氧自由基与酶9 酶与细胞的信号转导10 非水介质中的酶催化反应11 酶的化学修饰12 核酶13 模拟酶14 抗体酶15 分子印迹酶16 组合生物催化17 酶的定向进化18 蛋白酶抑制剂设计与药物19 酶的固化技术20 酶的分离工程21 气体酶学22 酶的生产参考文献3.《酶学及其研究技术》作者：陈清西编著出版社：厦门大学出版社出版时间：2010-8-1 定价：38 目录：第一章概论第一节酶的概念和酶学研究的重要性一、酶是什么二、酶学研究的重要性三、酶学研究历史四、现代酶学概况第二节酶的组成及结构特点一、酶的化学本质二、酶蛋白亚基数的组成特点分类三、酶的组成分类四、酶的辅助因子第三节酶的分类与命名一、习惯命名法二、国际系统命名法三、国际系统分类法第四节酶作为催化剂的特点一、酶与一般催化剂比较的共性二、酶作为催化剂的显著特性第五节酶的专一性一、酶的专一性分类二、几种蛋白酶的专一性第二章酶的分离纯化第一节酶分离纯化的一般原则一、确立酶活力测定方法二、原材料的选择与处理三、酶的纯化方法四、酶的纯度鉴定第二节酶的提取一、生物材料的破碎二、酶的抽提第三节酶的纯化一、沉淀法二、离子交换柱层析技术三、凝胶过滤柱层析法四、亲和层析五、其他分离纯化方法六、酶纯化方法的选择与实验设计第三节酶活力的测定一、酶活力测定的一般原则二、初速度三、酶活力单位四、酶活力测定的主要方法第四节酶制剂的浓缩、干燥及保存一、浓缩的主要方法二、保存第五节酶纯度的鉴定技术一、酶纯度的评价二、电泳法三、其他方法第六节酶的分离纯化应用实例一、青蟹碱性磷酸酶二、南美白对虾N一乙酰J3一D一氨基葡萄糖苷酶第三章酶的理化性质研究第一节酶亚基数及分子量的测定一、酶蛋白亚基数及亚基分子量的测定原理与方法二、酶蛋白总分子量的测定原理与方法第二节酶的等电点测定一、等电点测定的原理二、等电聚焦电泳技术第三节酶的氨基酸组成一、氨基酸组成分析二、特殊氨基酸含量的测定三、酰胺含量的测定第四节糖基酶中糖的组成与连接方式的研究一、糖蛋白的分析二、糖蛋白中糖成分的分析三、糖基连接方式的研究第五节几种海洋动物酶的理化性质的研究实例一、锯缘青蟹碱性磷酸酶的理化性质研究二、南美白对虾N一乙酰一J3一D一氨基葡萄糖苷酶的理化性质研究第四章酶催化的动力学性质研究第一节酶促反应的基本动力学一、Michaelis—Menten方程的建立二、Briggs—Haldane修正的Michaelis—Menten方程三、关于Michaelis一Menten方程的讨论四、米氏常数Km的意义五、米氏常数Km和最大反应速度V m的图解法测定六、米氏方程的积分形式第二节King—Altman方法推导速度方程一、用稳态法推导动力学方程的基本步骤二、King—Altman图像法推导动力学方程三、wang和Hanes结构法则第三节酶浓度对反应速度的影响第四节产物浓度对酶促反应的影响一、产物对酶初速度的影响的动力学二、可逆反应的Haldane关系式第五节高底物浓度对酶活力的影响一、动力学模型建立二、动力学方程的推导第五章酶的抑制剂第一节酶抑制剂的类型一、酶抑制剂两大类型二、区别可逆抑制剂与不可逆抑制剂的实验设计与操作第二节不可逆的抑制剂一、非专一性的不可逆抑制剂二、专一性不可逆抑制剂第三节可逆抑制剂作用的动力学一、竞争性抑制作用的动力学二、非竞争性抑制作用的动力学三、反竞争性抑制作用的动力学四、混合型抑制作用的动力学第六章pH对酶活力的影响第一节pH对酶催化的效应一、酶促反应的最适pH二、酶的pH稳定性第二节pH对酶可逆作用的动力学一、酶活性中心可解离基团的解离常数二、pH影响酶活性中心解离基团的动力学模型的建立三、酶活性中心解离基团的解离常数的测定第三节有机溶剂对酶活性中心解离基团的微扰作用第四节pH对酶效应研究的实例一、pH对青蟹碱性磷酸酶（ALPase）催化pNPP水解反应的效应二、酶活性中心解离基团解离常数的测定第七章温度对酶活力的影响第一节温度对酶催化反应的影响一、酶促反应的最适温度二、酶的热稳定性第二节温度对酶催化反应速度常数的影响一、温度与速度常数二、酶促反应的热力学参数的测定第三节温度对酶催化反应速度常数的影响一、酶活性中心解离基团的标准热焓二、酶促反应的热力学常数测定实例三、酶活性中心解离基团的解离热焓测定实例第四节酶的热失活动力学一、经典的酶热失活研究方法二、酶失活过程中的底物反应动力学方法三、酶的热失活表观速度常数的测定四、酶热失活的微观速度常数的测定第八章酶的多底物动力学第一节术语一、多底物催化反应历程的Cleland表示法二、多底物反应的酶中间物三、多底物反应历程的分类四、多底物反应的动力学参数表示法五、多底物反应机理的图形表示法第二节OrderedBiBi机理一、反应模型的Clleland表示法二、动力学方程的推导（King—Altman推导法）三、反应速度方程用动力学常数表示的基本方法四、作图法求解动力学参数第三节RandomBiBi机理第四节PingPongBiBi机理第五节多底物反应机理的判断第六节产物的抑制作用机理的判断一、有序双双反应（OrderedBiBi）的产物抑制作用的判断二、乒乓双双反应（PingPongBiBi）的产物抑制作用的判断三、Cleland的产物抑制作用的判断规则第九章酶功能基团的化学修饰第一节化学修饰的原理一、影响酶的功能基团反应活性的主要因素二、修饰剂反应性的决定因素第二节采用非特异性试剂对酶功能基团进行修饰一、特殊氨基酸残基的化学修饰二、修饰剂和修饰反应条件的选择第三节亲和标记和差示标记一、亲和标记法的原理二、差示标记法的原理第四节酶活性中心必需基团数的测定一、酶修饰失活动力学二、酶修饰失活速度常数比较法判断必需基团数（Ray—Koshland方法）三、邹氏图解法求必需基团数第十章酶的分子结构基础及催化作用机理第十一章酶抑制剂的设计与应用第十二章酶分子构象的研究技术第十三章多酶体系及调节酶第十四章酶活性调控4．《酶工程原理》作者：由德林主编出版社：科学出版社出版时间：2011-7-1 定价：35目录：丛书序前言前言1 酶与酶工程1.1 酶工程的发展历程1.2 酶作为催化剂的特点1.2.1 酶的高效催化能力1.2.2 酶的专一性1.2.3 酶的作用条件温和1.2.4 酶的活性可调节1.3 酶的命名及分类1.4 酶催化功能的结构基础1.4.1 酶的高级结构是其发挥活性的基础1.4.2 酶的活性中心1.4.3 酶的活性部位模型假说1.5 酶催化反应的本质1.5.1 酶促反应的过渡态1.5.2 邻近效应和定向效应1.5.3 共价催化1.5.4 酸碱催化1.5.5 金属离子催化1.5.6 微环境影响1.6 酶动力学1.6.1 影响酶反应速率的因素1.6.2 单底物反应1.6.3 双底物反应动力学1.6.4 失活（稳定性）动力学1.7 酶的稳定性1.7.1 酶的失活模型1.7.2 酶蛋白不稳定的原因1.7.3 稳定酶的方法1.8 非水酶学1.8.1 非水介质中酶催化反应的特征1.8.2 非水介质中酶的催化基础1.8.3 底物特异性（思考题）（参考文献）2 酶的生产、分离纯化和制剂2.1 原料的选择2.2 产酶微生物发酵技术2.2.1 培养基2.2.2 发酵工艺控制2.3 工程菌的高密度发酵2.3.1 基因工程菌的构建2.3.2 基因工程菌的培养方式2.3.3 高密度发酵工艺2.4 提高酶产量的方法2.4.1 酶合成的调控机理2.4.2 通过条件控制提高酶产量2.4.3 通过基因突变提高酶产量2.4.4 通过体内基因重组提高酶产量2.4.5 通过体外基因重组提高酶产量2.4.6 定向进化提高酶产量2.5 酶分离纯化的原理与方法2.5.1 酶分离纯化的基本原则2.5.2 目标蛋白从生物机体内的释放2.5.3 粗分离2.5.4 根据相对分子质量不同的纯化方法2.5.5 根据分子电荷不同的纯化方法2.5.6 根据分子极性不同的纯化方法2.5.7 根据蛋白质亲和力不同的纯化方法2.6 酶的剂型与保存2.6.1 酶的剂型3 酶的固定化和酶反应器4 酶的分子改造5 酶的模拟6 酶与生物催化7 酶与生物降解8 酶与代谢工程索引5.《酶――在生活与工业中广为使用的超级分子催化剂》作者：（德）伦内贝格著，杨毅，张皖蓉，王健美译出版社：科学出版社出版时间：2009-3-1 定价：35目录：丛书序本册简介原版前言1 酶是具有高度特异性的高效生物催化剂2 溶菌酶：在微小分子水平上最早被了解其结构和功能的酶类3 辅助因子在复合酶类中的作用4 酶类的来源：动物、植物以及微生物5 胞外水解酶将生物高分子聚合物降解为小分子6 用于酿酒、烘焙以及退浆的淀粉酶7 用于增加蔬果汁产量的果胶酶8 生物清洁剂：应用最广泛的水解酶9 软化肉类与皮革的蛋白酶10 固定：酶类的重复使用11 葡萄糖异构酶与果糖糖浆：提高糖的甜度12 固态酶在人类与动物食品生产中的应用13酶膜反应器：辅助因子再生性的应用14固定细胞小测验参考文献与推荐读物相关网络链接6.《酶工程技术》作者：吴士筠，周岿，张凡主编出版社：华中师范大学出版社出版时间：2009-12-1 定价：16目录：第1章绪论1.1 酶工程研究现状1.1.1 国内外酶制剂的生产和应用现状1.1.2 工业酶制剂的来源及特点1.2 酶工程技术应用1.2.1 活性肽的开发研究1.2.2 酶工程在医药方面的应用1.2.3 酶在污染治理中的应用1.2.4 酶在农业中的应用1.2.5 酶在饲料生产方面的应用1.2.6 酶在轻化工领域中的应用1.3 国内外酶工程产业发展趋势第2章乙醇脱氢酶2.1 简介2.1.1 乙醇脱氢酶研究现状2.1.2 乙醇脱氢酶的应用2.1.3 乙醇脱氢酶的分离纯化2.2 乙醇脱氢酶酶学性质研究2.2.1 简介2.2.2 乙醇脱氢酶酶学性质阶段研究2.2.3 乙醇脱氢酶酶学性质研究关键技术2.2.4 乙醇脱氢酶酶学性质研究过程控制2.3 乙醇脱氢酶提取研究2.3.1 简介2.3.2 乙醇脱氢酶提取阶段研究2.3.3 乙醇脱氢酶提取关键技术2.3.4 乙醇脱氢酶提取过程控制2.4 乙醇脱氢酶分离纯化研究2.4.1 简介2.4.2 乙醇脱氢酶分离纯化阶段研究2.4.3 乙醇脱氢酶分离纯化关键技术2.4.4 乙醇脱氢酶分离纯化过程控制2.5 乙醇脱氢酶催化动力学研究2.5.1 简介第3章蛋白酶第4章a－淀粉酶第5章植酸酶第6章纤维素酶参考文献7.《酶工程》作者：陈宁主编出版社：中国轻工业出版社出版时间：2011-6-1 定价：36目录：第一章绪论第一节酶工程的定义第二节酶工程发展历史第三节酶工程的研究概况及发展前景一、新酶的研究与开发二、化学酶工程三、生物酶工程四、酶的优化生产五、酶的高效应用第四节我国酶制剂工业现状及发展对策一、我国酶制剂工业发展现状。
酶工程课后题答案.doc
第一章1.简述酶与一般催化剂的共性以及作为生物催化剂的特点共同点：只能催化热力学所允许的的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点：反应前后酶本身没有质和量的改变：很少量就能发挥较大的催化作用：其作用机理都在于降低了反应的活化能。
酶作为生物催化剂的特点：1.极高的催化率；2.高度专一性；3.酶活的可调节性；酶的不稳定性。
5.酶失活的因素和机理。
酶失活的因素主要包括物理因素，化学因素和生物因素物理因素1热失活：热失活是由于热伸展作用使酶的反应基团和疏水区域暴露，促使蛋白质聚合。
2冷冻和脱水：很多变构酶在温度降低是会产生构象变化。
在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变，很容易引起蛋白质的酸变性。
3.辐射作用：电离辐射和非电离辐射都会导致多肽链的断裂和酶活性丧失。
4.机械力作用：化学因素1.极端pH：极端pH远离蛋白质的等电点，酶蛋白相同电荷间的静电斥力会导致蛋白肽链伸展，埋藏在酶蛋白内部非电离残基发生电离，启动改变。
交联或破坏氨基酸的化学反应，结果引起不可逆失活。
极端pH也容易导致蛋白质水解。
2.氧化作用：酶分子中所含的带芳香族侧链的氨基酸以及Met, Cys等，与活性氧有极高的反应性，极易受到氧化攻击。
3.聚合作用：加热或高浓度电介质课破坏蛋白质胶体溶液的稳定性，促使蛋白质结构发生改变，分子间聚合并沉淀。
4.表面活性剂和变性剂：表面活性剂主要改变酶分子正常的折叠，暴露酶分子疏水内核的疏水基团，使之变性；变性剂与酶分子结合，改变其稳定性，使之发生变性。
生物因素微生物或蛋白水解酶的作用使酶分子被水解。
6.简述酶活力测定方法的原理直接测定法：有些酶促反应进行一段时间后，酶底物或产物的变量可直接检测。
间接测定法：有些酶促反应的底物或产物不易直接检测，一次必须与特定的化学试剂反应，形成稳定的可检测物。
酶偶联测定法：与间接测定法相类似，只是使用一指示酶，使第一酶的产物在指示酶的作用下转变成可测定的新产物。
酶学与酶工程
Lecture1 酶学与酶工程1、酶的概念,命名、酶的活性中心1）酶是由活细胞产生的，具有催化活性和高度转移性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。
酶工程:将酶学理论与化工技术相结合,研究酶的产生和应用的一门新的技术性学科，包括了酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面。
主要：酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和酶生物反应器.化学酶工程:用化学手段修饰、改造、模拟天然酶，使其更适合人们的需要,主要包括天然酶、化学修饰酶、固定化酶以及化学人工合成酶的研究与应用.生物酶工程：用生物学的方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶，主要是抗体酶、杂合酶、进化酶和核酸酶的研究与应用。
2)命名：系统命名法！！催化下列反应酶的命名：ATP+D—葡萄糖→ADP+D—葡萄糖-6—磷酸该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移一个磷酸到葡萄糖分子上的反应。
它的分类数字是：E.C.2.7。
1。
1E.C代表按国际酶学委员会规定的命名第1个数字(2）代表酶的分类名称(转移酶类）第2个数字（7)代表亚类（磷酸转移酶类）第3个数字（1)代表亚亚类(以羟基作为受体的磷酸转移酶类）第4个数字(1)代表该酶在亚—亚类中的排号(D葡萄糖作为磷酸基的受体）3）活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基因酶的活性中心：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。
2、酶的分类、组成、结构特点和作用机制分类:按酶促反应的性质分类（六大类）：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶类、异构酶类、合成酶类全酶=酶蛋白+辅因子辅因子包括：有机辅因子（辅酶非共价结合/辅基非共价结合或共价结合)和金属辅因子（金属酶/金属激活酶)酶蛋白的分类:3、酶作为催化剂的显著特点强大的催化能力：可以加快至1017倍；没有副反应,酶在较温和的条件下催化反应的进行；高度的专一性，各种酶都有专一性但是专一程度的严格性上有所差别；可调节性,包括了抑制剂和激活剂的调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等；易变性，大多数的酶是蛋白质，在极端环境中会受到破坏。
酶学及酶工程课2章3节14
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邻近效应和定向效应
底物之间及底物对活性部位的邻近和定向 增加了有序性，减小了自由度，从而降低 了系统的熵，而增加了系统的自由能。 双分子反应两个底物在结合部位定向结合 并彼此靠近，比溶液中发生反应的可能性 高得多，相当于大大提高了反应物浓度。 所有酶反应底物和酶之间都有反应所需的 相互作用，定向和邻近使反应加快。 底物结合时墒减少所需要的自由能由底物 结合时放能提供。
2. 有机辅基
生物素可共 价结合羧基。 它通过酰胺 键和蛋白质 的赖氨酸侧 链氨基结合， 形成生物素 羧基载体蛋 白。 （BCCP）
乙酰辅酶A羧化酶
因BCCP能和羧基键合，在羧化反应中起重 要作用。如乙酰辅酶A羧化酶。
磷酸泛酰巯基乙胺
泛酰巯基乙胺可通过 磷酸二酯键和蛋白质 的丝氨酸羟基结合， 形成酰基携带蛋白 （ACP）。ACP在脂肪 酸代谢反应中起着重 要作用。 这些辅基通过共价键 和酶结合，实际上已 成为酶的一个组成部 分。
1. 金属辅因子
已知酶中大约有三分之一以上需要金属离子。 含金属辅基的称为金属酶。有些酶和金属离子 结合不紧密，纯化时失去金属离子，但需加入 金属离子才有活性，称为金属激活酶。此时金 属离子应是金属辅酶。 金属离子参与酶的催化作用的方式有多种： 1）接受或提供电子，或做为亲电剂或亲核剂, 或激活亲电剂或亲核剂； 2）通过配位键结合底物，并引起底物形变； 3）保持反应基团的三维取向，稳定酶活性部 位于活性构象。
——R.Pan et al. JBC,2010；
该酶活性部位含有荧光基团。测定表明该酶 与Th或Ch底物结合后内源荧光有较大变化， 但和U底物结合后变化不大。 用低浓度胍扰动该酶活性部位也造成荧光变 化，但结合过Th或Ch底物后再用胍扰动荧光 变化不大了。 用蚯蚓蛋白酶II、枯草杆菌蛋白酶、乳酸脱 氢酶也能得到类似的结果。 表明这些酶活性部位有较大构象变化后会维 持该构象,再作用按锁钥模型,形成先诱导契 合再锁钥的机制。有无普遍性还需证明。
酶工程课件第二章
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES， 则[E]t=[ES]。此时反应速度达到最大Vmax，即
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称 为米氏方程，式中的Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情 况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下式：
第二节 影响酶促反应的因素
酶的活性虽然随着温度的降低而减弱，但低温一般不破坏酶，只是酶 的催化活性很微弱，当温度回升后，酶又恢复其活性。临床上的低温麻醉 就是利用低温能降低酶的活性，以减慢组织细胞的代谢速度，提高机体对 氧和营养物质缺乏的耐受性，有利于手术治疗。低温保存菌种和生物制品 也是基于同一原理。
第一节 酶促反应动力学
一、单底物动力学
k3在单底物酶促反应中，底物（S）首先与酶（E）结合， 生成底物和酶的复合物（ES），然后复合物分解，形成产物 （P）并释放出酶，这个过程可表示如下：
式中酶与底物形成复合物的反应是可逆反应，正反应和逆 反应的速度常数分别为k1、k2，复合物分解为产物与酶的反应 是不可逆反应，速度常数为k3。
值得注意的是酶在试管中反应的最适pH与其所在正常细胞 的生理pH值不一定是相同的。这主要是因为一个细胞中有数百 种酶，不同的酶对细胞内的生理pH值的敏感性不一样，对有些 酶而言可能已达到或者接近其最适pH，而对另一些酶则不是， 这就致使不同的酶表现出不同的活性。这种不同被认为对细胞 内复杂的各种代谢活动有重要意义。
对于一种具体的酶而言，其最适温度并不是一个固定值，而与酶作用 的时间长短有关。酶可以在较短的时间内耐受较高的温度，但是只有当酶 反应时间在被规定的情况下，才有最适温度。也就是说，即使是同一种酶， 如果反应的时间不同，其最适温度也不一样。一般来说，酶在干燥情况下 要比潮湿状态下更耐高温。这一点已被广泛用于指导酶的储藏保存。有些 酶的干粉剂可以在室温下放置一段时间，而其水溶液则必须在冰箱中保存； 制成冰冻干粉的酶制剂能放置数月，而未制成这种干粉的酶溶液在冰箱中 只能保存几天。
酶学与酶工程 (2)优秀课件
（二）国际系统命名法
国际系统命名法原则是以酶的整体反应为基 础的，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物 及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起 反应，应在它们系统名称中包括两个底物的名 称，并以“：”号将它们隔开。若底物之一是水 时，可将水略去不写。
ATP＋D-葡萄糖 ADP＋D-葡萄糖-6-磷酸 国际系统命名为： ATP：D-葡萄糖磷酸转移酶
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2． 酶与底物的结合模型
a． 锁和钥匙模型 b ．诱导锲合模型
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a． 锁和钥匙模型
认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结 构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的 结合如同一把钥匙对一把锁一样
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b ．诱导锲合模型
该学说认为酶表面并没有一种与底物互补 的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成 了互补形状.
专一性
活性部位
必需基团
催化基团 催化性质
维持酶的空间结构
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三．酶的作用机制
1． 酶的作用过程 2． 酶与底物的结合模型 3 ．酶的催化作用
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1． 酶的作用过程
酶的活性部位：
是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个 酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很 远的氨基酸残基形成的三维实体。
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（三）国际系统分类法及酶的编号
国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类型， 把酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解 酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。分别用1、2、 3、4、5、6来表示。再根据底物中被作用的基团或 键的特点将每一大类分为若干个亚类，每一个亚类又 按顺序编成1、2、3、4……等数字。每一个亚类可 再分为亚亚类，仍用1、2、3、4……编号。每一个 酶的分类编号由4个数字组成，数字间由“·”隔开，编 号之前冠以EC（Enzyme Commision)。
酶学及酶工程课2章1节14
3. 离子键
酶分子上的电荷： 正电：来自 Arg, Lys, His, N端. 负电：来自 Asp, Glu, C端. 正负电荷形成的离子键是强作用力，对 形成和维持酶的空间结构，以及酶和底 物的相互作用，都起着重要作用。 F = q1q2 / Dr2 式中D为介电常数, q为电荷量, r为电荷 间距。
4. 氢键
氢键在氢和高电 负性的氧，氮原 子间形成。
键能3－7千卡/摩 尔。供、受体在 一条直线上时强 度最大。
水易形成氢键。 形成氢键的基团：1）作供体：吲哚基，胍基；2）作供体 或受体：酰胺基，醇羟基；氨基，羧基，咪唑基。
5. 疏水作用
疏水作用是由水的作用形 成的，并非疏水基团之间 有吸引力。
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影响晶体生长的因素
a. 蛋白质样品的纯度。形成完整单晶的 关键。用同批原料，新制样品。 b. pH值。不同pH下溶解度不同，并可长 出不同晶型晶体。 c. 温度。溶解度随温度变化。 d. 离子强度。离子强度影响大分子表面 电荷及其相互作用，而影响溶解度，产 生盐溶或盐析作用。 e. 有机分子添加剂。降低溶剂的介电常 数，增加静电相互作用，改变溶解度。
酶学及酶工程
Enzymology and Enzyme Engineering
田维熙 教授
中国科学院大学
第二章 酶的结构与功能
第一节 酶的空间结构及测定
一、原子间的作用力
1. 轨道和能级
轨道能级
生物常见原子电子轨道
2. 共价键——原子间最牢固的结合
σ键：
• • 二个原子轨道上的 电子均未成对； 分子轨道电子成对
PE = A/R12 – B/R6
二、酶的空间结构和肽键
酶学及酶工程课2章4节14
三类SOD的共同作用特点
Mn-SOD与Fe-SOD的金属离子与蛋白质分 子结构均与Cu,Zn-SOD不同，但这三类 酶的共同特点都是涉及活性部位内金属 离子的交替还原和再氧化。
二、溶菌酶的活性部位分析
溶菌酶水解细菌的细胞壁多糖，N-乙酰氨 基葡萄糖（NAG）和N-乙酰粘质酸（NAM） 重复构成的多糖，因而具有溶菌作用。
三、丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶的作用位点
胰蛋白酶的作用位点的Rn-1为Arg、Lys等强碱性侧 链；胰凝乳蛋白酶的Rn-1为Phe，Trp，Tyr等具有 芳香疏水基团的侧链；弹性蛋白酶则要求Rn-1为小 的中性侧链，如Ala，Gly，Ser，Val。这三种酶 形成强有力的消化酶系统。
底物结合部位
催化部位
催化反应中间物
丝氨酸蛋白酶在体外可以水解具有酯键和酰胺键 的小分子化合物。其催化酯水解时可检测到酰化 酶中间物，表明其水解中存在酶的酰化过程，且 明显快于其后的水解脱酰过程。
形成四面体中间物
His在Asp支持下发动碱催 化，使Ser发动亲核攻击
形成四面体中间物，接受 了H＋的His再发动酸催化
溶菌酶含129个氨基 酸，分子量14600，是 第一个用晶体分析得 到精确空间结构的酶。
结构和专一性
该酶分子紧凑，稳定性强，但螺旋等刚 性结构相对较少，有利于构象变化。酶 分子内部疏水，表面亲水，活性部位有 一个谷状口袋，为多糖底物结合部位。 该酶专一性水解NAM C-1和NAG C-4间糖 苷键，不水解NAG C-1和NAM C-4间糖苷 键。这和结合部位空间形状有关。
催化过程
Cu,Zn-SOD的催化作用与活性部位中Cu离子的还原 与氧化密切有关。由于2个O2-.的电荷相同，难于接 近，而通过Cu2+的传送电子，加速O2-.的歧化。
酶学与酶工程第二章学生ppt课件
3. 共价催化(covalent catalysis)
共价催化又称亲核催化（nucleophilic catalysis） 或亲电子催化（electrophilic catalysis） 亲核攻击集团： -OH，-SH，-N（咪唑基） 底物亲电中心：
磷酰基（P=O）酰基（C=O） 糖基（Glu-C-OH）
狭义酸碱催化：H＋和OH－ （specific acid-base catalysis）
广义酸碱催化：质子供体和质子受体 （general acid-base catalysis
21
三、降低反应活化能的因素
Table Functional groups involved in general
天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸
11
二、酶的结构和功能的关系
（一）酶的一级结构与催化功能的关系 酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基
础。
12
胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
13
（二）酶的二级和三级结构与催化功能 的关系
酶的二级、三级结构是所有酶都必须具备的空 间构型。维持酶的活性部位所必须的酶蛋白的 二级和三级结构彻底改变，就会使酶遭受破坏 而丧失其催化功能，这是蛋白质变性的依据。
1．酶的变性和失活 2．活性中心的挠性 3．酶分子的结构域
14
（三）酶的四级结构与催化功能 的关系
具有四级结构的酶，按其功能可分为两类， 一类与催化作用有关，另一类与代谢调节关 系密切。
15
三、酶催化作用的基本理论
（一）酶—底物复合物
1．酶－底物复合物存在的证据 1903年，Henri用蔗糖水解酶水解蔗糖提出的。 E+S= ES= P+ E
工学酶学及酶工程章节PPT课件
• 已糖激酶反应： • 葡萄糖+ATP→葡萄糖—6—磷酸+ADP • 测活可偶联G—6—P脱氢酶反应：
• 葡萄糖—6—磷酸+NAD第2P8→页/共63—3页磷酸葡萄糖酸+NADPH
酶活性计算
酸钠，硫酸铜 。 • 砷钼酸试剂：含钼酸铵，砷酸钠，硫酸。 • 测定方法：将酶和底物混和保温，反应一定时间后加入
Nelson试剂中断酶反应，沸水浴后加入砷钼酸试剂，
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偶联测活法
• 为能使用连续监测法，将无特定光吸收变化的反 应产物做为另一个有特定光吸收变化反应的底物， 偶联反应应进行很快，且和被偶联反应可共存。
第二章 酶的性质及制备
第一节 酶的性质及活性测定
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酶的性质：物化性质
• 1. 溶解性
• 影响溶解性的最主要因素：酶分子表面电荷。
• 调节酶溶解性的方法：
• 1）改变离子强度。盐溶：一定浓度的盐使盐离子吸附 在酶表面，增加表面电荷，促进与溶剂分子作用，提高溶 解度。盐析：进一步增加盐浓度则使水浓度降低，酶表面 水化作用减弱，造成相互聚集而沉淀。这个性质被用于酶 的提取及提纯。
利用 底物 和产 物在 特定 波长 的光 吸收 差别
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分光光度计原理
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荧光分光光度计
• 荧光分光光度计和普通分光光度计的区别在于接收 的不是通过比色杯的透射光，而是在90°位置上接收 比色杯中荧光化合物被激发的荧光。
酶工程基础PPT课件
第 二 节 酶 的 分 类 、 命 名 、 组 成 、 结 构 特 点 和 作 用 机 制
（二）酶的结构特点
(holoenzyme) （apoenzyme）
Hale Waihona Puke 全酶=酶蛋白
有活性
（金属离子、辅酶、辅基） 无活性 无活性
+
(cofactor)
辅因子
无机离子 （金属离子）
有机化合物 （辅酶、辅基）
（1）分类（据结合程度不同） •金属酶：酶蛋白与金属离子结合紧密，主要是 一些过渡金属离子。 •金属激酶：金属离子与酶的结合一般较松散， 在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。主要 是一些碱金属离子或碱土金属离子。 （2）作用 •活性中心的组成成分：如多酚氧化酶中的铜 •在E与S之间起作用：如羧肽酶中的锌 •稳定结构
3、蛋白质合成，一旦错误氨基酸掺入，就 要有专门的酶去识别、切除、再合成。
第 一 节 酶 和 酶 工 程 概 述
（三）酶的研究
1、以酶为工具的研究 2、以酶为研究对象
1、以酶为工具的研究
第 一 节 酶 和 酶 工 程 概 述
（1）用酶来治疗疾病
• 天冬酰胺酶→治疗白血病 • 多酶片(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)→助消化 • 链激酶、尿激酶、纳豆激酶等→清除血凝块
第 二 节 酶 的 分 类 、 命 名 、 组 成 、 结 构 特 点 和 作 用 机 制
（三）酶的编号
酶的编号——用四个数字表示一个酶：
Enzyme Commision EC 1. 1. 1. 1 醇脱氢酶
类 亚类 亚亚类 编号
第1大类; 以CHOH为供体; 以NAD+,NADP+为受体; 1
第 二 节 酶 的 分 类 、 命 名 、 组 成 、 结 构 特 点 和 作 用 机 制
酶学及酶工程PPT课件
活性部位的组成成分
形成活性部位的组成成分包括主链结构，侧 链基团和辅基。
主链形成活性部位的基础形状。
侧链基团完成活性部位的构成，是活性部位 的主要成分。
很多酶还包含金属或有机辅基，它们虽不是 肽链的一部分，但紧密结合在酶分子中，并 实际参与了活性部位的形成，有的是结合部 位的一部分，有的本身是催化基团，还有的 能够传递中间产物。
N
N
N
H
H
2. 共价催化
催化反应中，酶的催化基团和底物形成 临时共价键，使底物被激活为中间态， 进而实现被催化的反应而生成产物，同 时酶恢复游离态：
这种催化机制称为共价催化。 共价催化包括亲核催化和亲电催化。
亲核催化和亲电催化
如酶分子富含可提供公用电子对的亲核基 团，如氨基、巯基、羟基、咪唑基等，其 提供电子对给带部分正电的底物而形成临 时共价键，这种催化作用就是亲核催化。 由于酶的侧链基团大多是亲核的，亲核催 化是共价催化中的主要形式。
底物在活性部位的结合力
底物和结合部位有形状的配合，使底物 的原子与结合部位的原子有尽可能多的 接近到范德华半径内。
除范德华力，稳定底物结合的力还有离 子间引力、氢键和疏水作用，侧链、辅 基和底物之间存在相应的配合。
按锁钥模型假说，酶的活性中心空间结 构是刚性的。
2. 诱导契合模型假说
后来的研究发现自由酶的活性部位和底物间 并不精确地像锁钥匙一般配合，从而提出了 诱导契合模型假说。 该假说认为，酶与底物结合时，结合力促使 酶和底物分别发生一些构象的变化，从而更 有利于催化反应的发生。构象变化使活性部 位和底物达到精确配合，结合更紧密，并使 催化基团处于更有利于催化的位置上。底物 形变造成应力状态会使发生反应的键变弱， 降低反应的活化自由能，使反应速度增加。 形变所需的能量则是由结合能提供的。
第二章 酶学与酶工程 (4-6节)
一 竞争性抑制作用
1.竞争性抑制作用的含义 2. 竞争性抑制作用的机理 3. 竞争性抑制作用举例 4．过渡态的类似物作为竞争性的抑制剂
退出
1.竞争性抑制作用的含义
退出
2. 竞争性抑制作用的机理
竞争性抑制的机理
1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而
Enzyme Engineering 酶工程
退出
第二章 酶学与酶工程
第一节 酶的分类、组成、结构特点和作用机制 第二节 酶作为催化剂的显著特点 第三节 酶抑制作用的概念和分类 第四节 可逆抑制作用 第五节 不可逆抑制作用 第六节 酶抑制剂的应用
退出
第四节 可逆抑制作用
一 竞争性抑制作用 二 反竞争性抑制 三 非竞争性 三 其他可逆抑制
图 1.1 传统化学法生产β－内酰胺抗生素路线
Figure 1.1. An overview of the traditional, chemical synthesis of β-lactam
退出
antibiotics
酶法生产β-内酰胺类抗生素路线图
Fermentation
NH2 COOH
N
H
S
the B chain (blue)。 退出 （Duggleby, H.J. Nature, 1995, (373):264-268）.
青霉素酰化酶的结构
不同来源的青霉素酰化酶都有α，β两个亚基组成，α亚基 的分子量在24k左右，β亚基的分子量在65k左右。
E. coli来源的PGA结构基因全长2538个核苷酸，编码846 个氨基酸组成的前体蛋白，包括26个氨基酸组成的信号 肽，209个氨基酸组成的α亚基，54个氨基酸组成的连接 肽和557个氨基酸组成的β亚基。
酶工程((复习资料)
第一章绪论一.1 酶的变性与失活失活作用：凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
2 酶的回收率与纯化比3 酶的结合效率及酶活力回收率酶的结合效率又称酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率酶的结合效率=（加入的总酶活力-未结合的酶活力）/加入的总酶活力*100%酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率酶活力回收率=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力*100%4 底物抑制及其产生的三个原因（1）、竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。
当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了（2）、非竟争性抑制酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。
（3）、反竞争性抑制作用酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。
二.1 什么是酶工程?酶工程(Enzyme Engineering))又称为酶技术，是指酶的生产与应用的技术过程。
是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合起来利用酶的催化作用进行物质转化的技术它是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学。
就酶工程本身的发展来说，包括下列主要内容：酶的产生、酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、有机介质中的酶反应、酶传感器、酶反应器、抗体酶、人工酶和模拟酶2 什么是酶的最适PH及其影响酶的反应机理在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适pH(optimum pH)。
a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。
b.影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一些基团）c.影响底物分子的解离状态故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行3 简述酶活力的测定方法（要求：快速，两个阶段，四个步骤）要求：快速、简便、准确两个阶段：酶在一定条件下与底物反应一段时间然后再测定反应物中底物或产物的浓度变化量。
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用凝胶过滤除小分子
分离酶蛋白和溶液中的小分子，如抑制剂、 底物、盐、保护剂等，传统技术是透析。但 透析一般用时较多，不适用快速操作。此时 凝胶过滤是较好的替代方法。 加压法：选用规格化产品。 离心柱法：装小塑料柱－平衡－离心－加样 －再离心－收集。 选胶：排阻限度在酶分子量之下，而在小分 子量之上越多越好；粗颗粒，大承压。
萄聚糖凝胶Sephadex
萄聚糖凝胶Sephadex
聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P
Bio-Gel P-2至P-300，型号值约为排阻限度, 性质特点和Sephadex类似, 不溶水和有机溶 剂，耐尿、胍，pH1-10 。
聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P
聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P
琼脂糖凝胶 Bio-Gel A, Sepharose
混合－分离法负吸附举例
用凝胶吸附经硫酸铵分步沉淀后的酶液 中的杂蛋白： 1）提前制备凝胶，冷藏保存。 2）作活性试验：取若干酶液小样，加入 不同量凝胶，温和搅拌后离心，测定上 清液的酶活性。选择保持100％酶活性的 最大凝胶量。 3）按所选择量加凝胶于酶液中，温和搅 拌数分钟，离心除去沉淀。
课外练习（记分）
二、凝胶过滤（分子筛）
原理：
凝胶性质
得水值Wr：胶体内部含水量—1g干凝胶溶 涨吸水克数。 排阻限度：不能渗入胶颗粒内部的最低分 子量。 分离范围：上限通常为排阻限度。 颗粒形状：理想为球形。 颗粒大小：颗粒越小，分辨力越强，流速 也越低，根据具体应用目的选择。
选择性曲线
颗粒大小对分辨率的影响
log S log为0时溶解度，Ks： 盐析常数，I：离子强度， C：离子浓度 （mol/L） Z：离子价数
盐析的影响因素
1）pH：等电点处最易沉淀。 2）温度：浓盐溶液中，温度升高溶解 度下降。 3）盐种类：高价盐效果高。常用硫酸 铵，注意一般需要用氨水调pH 。浓度表示 经常用饱和度（见换算表）。 4）蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难， 过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。
酶学及酶工程
Enzymology and Enzyme Engineering
田维熙 教授
中国科学院研究生院
第二章 酶的性质及制备
第四节 酶的提纯
一、调节溶解度
1. 盐析
原理：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺 水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解 度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不 同，在不同盐浓度下沉淀。浓盐溶液中蛋白 质溶解度遵守Cohn方程：
硫酸铵浓度换算表
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混 合均匀，一般终饱和度不超过40％。 高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加 溶液体积。 温和搅拌中缓慢加盐。加毕继续搅拌10分 钟以上，以充分沉淀。 沉淀后需高速离心。 沉淀再溶解后可能需要除盐。
反抽提法
原理：许多蛋白质从盐溶液中沉淀时特异 性低，溶解时特异性高。 方法：先用高盐沉淀蛋白质，再用递减浓 度硫酸铵抽提沉淀，分离蛋白质。 优点：1）分辨率较高，得率较高； 2）沉淀状态易抵御蛋白酶，因而 活性保持较好。 硫酸铵分步沉淀可除去75％杂蛋白，并可 较大浓缩酶液。
描述一个具体酶的提取、提纯过程，并 按标准记录表格格式记录一次该酶提纯 过程。希望该酶是你将进行论文工作实 验室研究的酶，信息可由你所在的实验 室以及上网查询得来。如实验室尚无具 体研究的酶，也可自选一个酶。
The END
洗脱体积（ml）
流速为240ml/hr
流速对分辨率的影响
洗脱体积（ml）
颗粒大小为50－80目。
常用凝胶
1）交联萄聚糖凝胶Sephadex Sephadex G-10至G-200，型号值/10=得 水值 细度 m ：粗100～300，中50～150， 细20～80，超细10～40 号越高排阻限度及分离范围越高，溶涨 时间越长，最大流力静力压越小，操作压 力超限会破坏多孔结构。 化学稳定，不溶所有溶剂，pH2-12。
聚乙二醇沉淀
原理：1）聚乙二醇可与蛋白质分子形成 复合物，除去水分子外壳，导致沉淀。 2）空间排阻学说：聚乙二醇在溶液中形 成网状结构，与蛋白质分子发生空间排挤 作用，使之沉淀。 遵守公式： log S + fs = x – a C S：蛋白溶解度， fs ：蛋白质之间摩擦系 数，C：聚乙二醇浓度，x, a：常数。
Bio-Gel A-0.5M至150M，型号值为分离上限。性质 特点和Sephadex类似。pH4－9稳定。 Sepharose 2B, 4B, 6B（已溶涨，勿干燥） 。号大颗 粒减小，分离上限减小，最大流体静压力增加。勿 激烈搅拌，勿冷冻，勿臵40℃以上（会溶解）。
琼脂糖凝胶
凝胶选择
琼脂糖凝胶的物理刚性相对较高，能得 到较高的流速，但萄聚糖凝胶的分辨率 较高。 萄聚糖凝胶的稳定范围最宽，特别是碱 性稳定性号（2－12）；聚丙烯酰胺凝胶 的酸性稳定性号（1－10）；琼脂糖凝胶 稳定性范围最小（4－9）。 不必需高流速时，一般多选用萄聚糖凝 胶。
凝胶过滤测分子量
利用在凝胶过滤中按分 子量大小出峰位臵不同， 可测定蛋白的分子量。
三、凝胶吸附
利用各物质 在活性物体 表面吸附亲 和力差异进 行分离的方 法。分离酶 蛋白常用羟 基磷灰石 （HA）。
HA 凝胶吸附
原理： HA表面有钙和磷酸根离子两种带 电基团，在不同的离子强度和pH下，各蛋 白的吸附状态不同。调整离子强度和pH使 特定蛋白吸附或解吸，实现分离。 正吸附：使所需蛋白吸附，洗掉杂蛋白后 再改变条件洗脱。 负吸附：选择条件使目的蛋白不吸附，用 凝胶吸附一些杂蛋白。 操作方法：层析法和混合－分离法。
聚乙二醇沉淀影响因素
1）蛋白质分子量越大越易沉淀，即a值越大，沉 淀所需聚乙二醇浓度越低。 2）蛋白质浓度越大， fs 越大，溶解度越小。但 各蛋白都易沉淀，不能浓度太大，一般不超过 10mg/ml。 3）温度在20℃ 分辨率最高，0－30℃可应用。 4）聚乙二醇聚合度高易使蛋白沉淀，但因粘度 影响操作，多采用聚乙二醇6000。 5）2.5以下离子强度，等电点附近pH为好。