DREB1A转录因子的克隆及植物表达载体构建

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一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术

一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。

以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。

质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。

2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。

这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。

3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。

4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。

5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。

6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。

7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。

8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。

需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。

转录因子DREB1A和DREB2A调控机制的比较分析

个Ａ２ＥＥＰ类转录因子，划分为５个亚族：ＰＰ／ＲＢ并Ａ２亚
启动下游基因转录。然ＤＥ１虽ＲＢＡ和ＤＥ２ＲＢＡ都含有酸性激活结构域，是它们的转基因植株表现不同的但
表型变化。
逆相关基因的调控区域发现了ＤＥ顺式作用元件，Ｒ
３１ＤＥ１和ＤＥ２调控下游基因表达的分子．ＲＢＡＲＢＡ机制ＤＥＡ和ＤＥ２在细胞外均与ＤＥ结合．ＲＢ１ＲＢＡＲ
如拟南芥的ｒＪ．ｄ７ｎ．ｏ６６ｅｒ５ｄＯｒＪ，１ｃｔ．．ｏｌａ以及ｒ２Ａｄ９等。Ｓｋｍａ等人分析拟南芥基因组全序列发现，１５ａｕ有４
摘要
ＤＲＢ转录因子即干旱应答元件结合蛋白质，能特异结合启动子中含有ＤＲＣＲＴ顺式Ｅ它Ｅ／
元件，活许多逆境诱导基因的表达，强植物对逆境的忍耐力。ＤＲＥ１和ＤＲＥ２转录因子结激增从ＢＡＢＡ
ｄｎ）因ＤＥＩ和ＤＥ２ＤＥｉｇ基ＲＢＡＲＢＡ。ＲＢ类转录因子基因属于Ａ２ＥＥ类基因家族，够与抗逆基因启动Ｐ／Ｒ能子区域中的ＤＥ顺式作用元件结合．与干旱、盐Ｒ参高
维普资讯
２０年第４０７３卷第１期
生
物
学

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接，将融合基因构建到表达载体ｐＡＩ３１，获得了具有ＣＭＢＡ１０上
ＤＲ１ＥＢＣ和Ｇ基因的重组表达载体ｐＤＲ１ＧＰ酶切和测序结果表明，融合基因与设计相符。一Ｆ，该
关键词绿色荧光蛋白基因（，ＥＣ转录因子，ＯＣ，ＧＤＲＢ１ＳＥＰＲ载体构建
ＣｏｔｕｔｏｆＰｌｎｐｅｓｏＶｅｔｒＣｏｔｉｉｇＤＲＥＢ１ｎｓｒｃｉｎｏａｔＥｘｒｓｉｎｃｏｎａｎｎｎＧＰＣａｄＦ
ＦｓｏｅｅｕｉｎＧｎ
ＷａｇＹｏｘｉＬｉｎｎｎｇｎＣｏｇ
新思路、新技术、方法新
Ｎｏｅｉｋｉｇ＆ＴｅｈｏｏｙｖｌＴｈｎｎｃｎｌｇ
Ｄ船Ｊ．融合基因植物表达载体的构建７ＧＣ
王涌鑫李聪
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草遗传育种研究室，京，００４北１０９通讯作者，ｉｎＯ２＠ｓａｏｌｏｇ５０ｉ．ｒｃｎｃｎ
ｅｐｅｓｏｅｔｘｒｓｉｎｖｃｏｒｐＣＡＭＢＩ３ｏｇｔｔｅｒｃｍｂｉｎｘｒｓｉｎｖｅｔｒｐＡ１０１ｔｅｈｅｏｎａｔｅｐｅｓｏｃ ห้องสมุดไป่ตู้ ＤＲ１— — ＧＦＰｂｙｒｓｒｃｉｎｅｚｍｅｄ — ｅｔｔｏｎｙｉｉ
Ｌｂｆｏａｅ’ ｎｔｓｎｒｅｉｇＩｓｔｔｏＡｎｍａｃｅｃ，Ａ，ｉｎ，００４ａＦｒｇｓＧｅｅｉｄＢｅｄｎ，ｔｕｅｆｉｌｉｅＣＡＳＢｅｉｇ１０９ｏｃａｎｉＳｎｊＣｒｅｐｎｉｇｕｈｒｌｏｇ５０ｉａｏｏｒｓｏｄｎｔｏ，ｉｎＯ２＠ｓ．ｒａｃｎｃｎＡｂｔａｔＩｒｅｏｉｎｉｙｔａｓｅｉａｔｔｍｏｅｕａｅｅｏｅｅｔｙｈｒｎｃｉｔｏａｔｒｅｓｒｃｎｏｄｒｔｄｅｔｆｒｎｇｎｃｐｌｎｓａｌｃｌｒｌｖｌｃｎｖｎｉｎｌ，ｔｅｔａｓｒｐｉｎｆｃｏｓｇｎｅ

DREB1A基因植物表达载体的构建_李杰

第34卷第2期东　北　农　业　大　学　学　报34(2):199～204 2003年6月J ou rnal of North east Ag ricultural Univ ersity June2003文章编号　1005-9369(2003)02-0199-06DREB1A基因植物表达载体的构建李　杰,李　晶,朱延明*,张　晶,代翠红,纪　巍,才　华(东北农业大学生命科学学院　黑龙江　哈尔滨　150030)摘要:以pBch质粒为基础,构建了分别由35s启动子、rd29A启动子调控的DREB1A基因双子叶植物表达载体pBD35s、pBD29A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(N P TⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。

以p CU 质粒为基础,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DR EB1A基因单子叶植物表达载体pCDE12、pCD29A,其植物选择标记为乙酰Co A转移酶基因(bar),适用于单子叶植物的遗传转化。

并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌L BA4404中,为通过农杆菌介导法将DR EB1A基因导入植物奠定基础。

关　键　词:DREB1A基因;rd29A启动子;植物表达载体中图分类号:Q37;Q782 文献标识码A 植物在生长发育过程中经常受到恶劣环境的胁迫,如干旱、盐渍和低温等都对植物体内水分状况产生影响,因此,渗透胁迫(水分胁迫)是植物面临的主要环境问题。

在长期进化过程中,植物通过一系列的生理或发育的变化对环境的渗透胁迫作出各种反应,来维持本身的水分状况,以避免或减轻缺水对细胞的危害。

目前这方面的研究重点集中在植物缺水引起的分子反应和信号传递。

研究表明,DREB转录因子和DRE元件在干旱、高盐及低温胁迫信号传递中起重要作用。

DREB转录因子可以调控多个与干旱、高盐及低温耐性有关功能的基因表达,因此利用DREB转录因子来改良植物抗逆性能获得较为理想的综合效果〔1,2〕。

植物表达载体构建

共同特点
启动子的活化受到物理或化学信号的诱导；启动子的分子结构都具有增强子、沉默子或类
似功能的序列结构；感受特异性诱导的序列都有明显的专一性；一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表
达的特点；该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导
表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达启动子和共生细菌诱导表达基因启动子。
在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质。初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色。注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色程度不能准确反映Gus活性，
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子
目的片段
（标记基因）选择标记
载体
表达载体(expressing vector)
特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列
Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activity
GUS酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红 4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物

转录因子在植物发育和生长中的作用探究

转录因子在植物发育和生长中的作用探究植物发育和生长是一个复杂的过程，其中涉及到许多基因的调控。

转录因子作为基因表达的主要调控因子，在植物发育和生长中也扮演着重要的角色。

本文将从转录因子的定义、分类和作用机制等方面，探究转录因子在植物发育和生长中的作用。

一、转录因子的定义和分类转录因子是一种可以调节基因转录的蛋白质。

它可以通过与DNA结合，参与到转录的启动、增强或抑制等过程中，从而调节基因的表达。

根据转录因子与DNA结合的方式不同，可将转录因子分为两类：一类是直接与DNA结合，称为DNA结合因子；另一类是与其他蛋白质形成复合体后再与DNA结合，称为调控因子。

根据调控因子与DNA结合的位置和方式，又可以分为促进因子和抑制因子等多种类型。

二、转录因子在植物发育和生长中的作用转录因子在植物发育和生长中的作用非常广泛，包括植物的营养吸收、激素信号传导、花期调节等方面。

以下就具体探究一些重要的作用机制。

1. 促进植物生长植物生长是植物发育的重要组成部分，而转录因子在促进植物生长方面扮演着重要的角色。

通过调控生长素、吲哚乙酸等植物生长素的合成和信号传导，转录因子可以促进植物细胞的分裂和扩张，从而促进植物生长。

研究表明，在细胞周期调控中，调控因子E2F可以直接或间接调控生长素合成和信号途径，从而促进植物生长。

2. 节制植物开花时间植物开花时间的节制对于植物的繁衍和适应环境有着非常重要的意义。

而转录因子在植物开花时间的调控中也扮演着重要的角色。

例如，FT和SOC1这两种调控因子能够在植物响应低温和长日照时间后，促进植物的开花。

此外，AP1这种DNA结合因子也参与到了植物开花时间的调控中。

3. 调节植物光合作用和耐旱性光合作用是植物生长和生存的核心过程。

而与之相关的转录因子也显得非常重要。

在光合作用中，转录因子可以调控叶绿素合成、光反应和碳循环等多个方面。

同时，转录因子还能调节植物对环境的适应能力，例如，DREB1A转录因子能够促进植物对干旱环境的适应。

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。

由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。

目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。

在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。

然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。

为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。

已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。

例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。

这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。

例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。

在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。

对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。

例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。

吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究
逆境是影响植物生长和产量的一个重要因素。

为了提高作物对逆境的适应能力，已经对一些逆境诱导转录因子进行了研究，其中DREB1A是其中一个非常重要的因子，可以增强植物的
耐旱、耐寒和耐盐能力。

而基因枪法是一种常用的转基因方法，它可以用来将外源基因导入植物细胞中。

因此，本文以转基因小麦为研究对象，采用基因枪法来获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦。

首先，需要构建DREB1A基因表达载体。

将DREB1A基因进
行PCR扩增后，酶切后与表达载体连接，形成DREB1A表达
载体。

接下来，利用基因枪将DREB1A表达载体导入小麦愈伤组织
细胞中。

为了提高转化效率，应将该组织预处理，促使其处于最佳的转录活性中。

转基因小麦的筛选需要进行两步，第一步为抗性筛选，将含有抗性基因的感受器小麦筛选出来。

第二步则是检测目标基因的表达情况，以确保目标基因已成功导入转基因小麦中。

通过PCR扩增和Northern印迹等方法，都可以检测目标基因在转
基因小麦中的表达情况。

本研究采用基因枪法获得了DREB1A转基因小麦，然后对其
进行了相关的性状测定。

结果表明，转基因小麦的耐盐、耐寒和耐旱能力都得到了显著提高。

因此，基因枪法获得DREB1A转基因小麦是一种可行的方法，可以促进小麦的逆境适应能力，并提高其产量和质量。

这为生产上的应用提供了新的选择。

几种植物转基因表达载体的构建方法

关键词 :载体 ;构建 ;Gateway 技术 ;三段 T -DNA ;一步克隆法中图分类号 :Q943 .2 文献标识码 :A 文章编号 :1004-311X(2008)05 -0084 -04
Approaches of Constructing Expressional Vectors Utilized in
Plant Genetic Transformation
LIN Chun -jing1 ,WEI Zheng -yi1 , CAI Qin -an1 , HOU Jing -yao1 , 2 , XING Shao -chen1 ＊
(1 .Biotechnology Research Center, Jilin Academy of Agricultural S ciences , Changchun 130033 , China; 2 .Institute of Genent ics and Cytology, Northeast Normal University , Changchun 130024 , China)
2008 年 18(5) 生物技术 85
随着植物基因工程技术的发展 , 适合于不同研究目的各种载体系统应运而生 , 其中在转基因植物中最常用的是质粒
载体。在为某种特定的植物构建表达载体时 , 为了使外源基因高效、安全表达 , 或由于特定的要求 , 需要构建新载体或改造已有载体 , 而选择一种合适的载体构建方法 , 从而达到方便、快捷的目的就显得十分重要。鉴于目前还没有关于对载体构建技术方面的总结 , 在收集整理前人工作的基础上 , 本文选择介绍了其中几种具有代表性的策略 , 对其适用的情况作了阐述 , 进而指出它们的应用潜力和主要应用领域 , 期望对实际操作起到借鉴作用。

chi、rip、dreb1a基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化

３结果与分析３．１植物表达载体构建３．１．１中间表达载体ｐＵＣＤ构建质粒ｐＵＤ２９Ａ的构建过程弛图３．１ａ。

对质粒ｐｕＣｌ８进行ＨｉｎｄｌｌＩ和ＥｃｏＲｌ双酶切，酶切产物约为一条２．７Ｋｂ的载体片段（图３．Ｉｂ中第Ｊ泳道），电泳回收２．７Ｋｂ的载体片段。

对质＃ｔｐＣＤ２９Ａ同样进行ＨｉｎｄｌｌＩ和ＥｅｏＲＩ权酶切，酶切产物为２．２Ｋｂ的ＤＲＥＢＩＡ片段（包括启动ｆ、终』七子）和约１１２Ｋｂ的载体片段（图３．１ｂ中第２泳道），电泳回收２．２Ｋｂ的片段。

将两个同收产物进行连接、转化人肠杆菌ＤＨ５ａ、筛选，挑取转化子，对重组质粒进行ＨｉｎｄＩｌｌ、ＥｃｏＲＩ烈酶切鉴定（剧３．１ｂ中第３泳道）。

由图３．１ｂ中第３泳道可以看出重组质粒经Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＥｃｏＲｌ双酶切厉产生２．２Ｋｂ和２．７Ｋｂ的电泳条带，表明连接正确。

将重组质粒命名为ｐＵＣＤ。

图３．１ａｐＵＤ２９Ａ构建示意图Ｆｉｇ·３·ｌａＳｃｈｅｍｅｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｖｅｃｔｏｒｐＵＤ２９Ａ。

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一Ｈ：ＭａｒｋｅｒＤＬｌ５０００１；ｐＵＣｌ８／ＨｌｎｄＩＩＩ＋霉ｃｏＲＩ２：ｐＣｌ）２９ｉ／Ｈｉｎ４ＩＩＩ－‘ＥｃｏｌｌＩ３：ｐＵＤ２９Ａ／ＨｔｎｄＩｌｌ＋鼬嘏Ｉ图３．１ｂ质粒ｐＵＤ２９Ａ酶切鉴定结果Ｆｉｇ．３．１ｂＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐＵＤ２９Ａｗｉｔｈｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ３．１．２中间表达载体ｐＢＣＲ构建质粒ｐＢＣＲ的构建过程见图３．２ａ。

对质粒ｐＢＣＥｌ２进行ＥｃｏＲｌ单酶切，酶切产物约为一条ｌ３．４Ｋｂ的载体片段（图３．２ｂ中第１泳道），电泳回收１３．４Ｋｂ的载体片段。

对质粒ｐＡＲＩＰ尉样进行ＥｃｏＲＩ单酶切，酶切产物为２．５Ｋｂ的ｎｐ片段（包括启动子、终止子）藕哟２．７Ｋｂ的片段（幽３．２ｂ中第２泳道），电泳回收２．５Ｋｂ的片段。

植物逆境胁迫下的生理生化响应研究

植物逆境胁迫下的生理生化响应研究植物生长发育受到许多环境因素的影响，其中逆境胁迫是指外界环境因素对植物生长发育的不利影响，如干旱、高温、低温、盐碱、重金属污染等。

这些逆境因素一旦出现，植物的生长发育、物质代谢、生理反应等都会遭到不同程度的损害。

为了适应和应对逆境环境，植物进化出了一套完备的逆境胁迫响应机制，以保证自身生存和繁衍。

本文将围绕植物逆境胁迫下的生理生化响应研究，分别从逆境胁迫的信号识别与传递、抗逆调节物质的合成与调控、逆境诱导基因组学及蛋白质组学等几个方面展开论述。

逆境胁迫的信号识别与传递在植物逆境胁迫情况下，植物酶类和植物激素等信号分子会发生变化，从而诱导出许多生理生化响应。

如干旱环境下，植物会通过根系和叶片的水分状态来感知干旱，从而逐渐开启整个植物的干旱应答途径，通过逆境胁迫信号识别和传递，激活一系列胁迫反应途径。

其中，胁迫信号的识别与传递是逆境胁迫响应的起始阶段。

欧洲黑杨（Populus tremula）与奶油杨（Populus euphratica）是地球上广泛分布的极端条件下生长的阔叶树种，因其对盐碱、低温等逆境条件具有高度适应性而备受关注。

研究表明，这两种杨树在逆境胁迫下的生理生化响应有很大的区别，其中逆境信号的感知、传递及下游调控机制可能起到重要的作用。

Salinity-Induced Protein Phosphorylation Changes in the Halophyte Populus euphratica and the Related Glycophyte Populus tremula，该研究结果显示，盐碱胁迫下欧洲黑杨的蛋白质磷酸化水平增加并与逆境信号识别与传递相关蛋白出现不同程度的调控，而奶油杨则显示出不同的信号转导途径，特别是腺苷酸调节蛋白家族的调控可能在干旱逆境中发挥了重要的作用。

抗逆调节物质的合成与调控为了应对逆境环境，植物通常合成出一系列抗逆调节物质。

植物逆境应答的基因调控机制

植物逆境应答的基因调控机制植物作为一类能够自主进行光合作用的生物，其细胞内外界环境的变化都会对其正常的生长和发育产生影响，尤其是当面临各种逆境时，如温度变化、干旱、盐渍、重金属等，会导致植物生理代谢过程出现异常，影响其正常生长及产量增加。

同时，这些逆境作用还会诱导植物自身产生一系列的顺应性反应，促使其自我调节和适应环境，这种反应就是逆境应答。

逆境应答可以改变细胞内基因表达，增加逆境适应性的基因表达量，以期保护细胞不受逆境的伤害。

因此，植物的逆境应答是基因调控机制的体现，该机制对于植物逆境适应性的提高起着重要的作用。

植物逆境应答的基因调控机制包括转录因子的破坏和产生以及包括miRNA和siRNA对mRNA降解和翻译的调节。

1. 转录因子的调节转录因子是对细胞信使和外界物质等刺激进行反应的主要分子，它们通过与特定DNA序列结合来调节基因表达。

在植物逆境应答中，大多数转录因子参与到模式识别和信号转导通路中，它们决定了是否将逆境信号转化为一个特定的适应性反应。

一些已知的复合物，如HAF1、ISR、DELLA、ireg2、LOC101251411和WRKY33等转录因子，都参与了植物对不同胁迫的逆境应答。

2. miRNA和siRNA的调节miRNA和siRNA是两种重要的RNA分子，可以通过对mRNA的废除或翻译抑制的方式调节基因表达。

它们可与mRNA特定序列结合并调控RNA合成，依此产生转录水平或翻译水平上调或下调的效果。

这两类分子在植物逆境应答过程中起着重要的调节作用 - 高氯发生时，miR398降解与铜离子相关的蛋白，导致铜离子蓄积并在线粒体偶氮内氧化，从而增强从维生素B6到生物体系的过渡。

同时，siRNA也能够通过降解mRNA和打断转录起到调节植物生命的作用。

3. 磷酸化修饰的调节磷酸化修饰是一种常见但重要的蛋白质调节方式（普遍存在于细胞内），它可通过磷酸化特定的氨基酸残基来影响蛋白质的构象和功能。

一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术

一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术植物质体表达载体是一种用于将外源基因转化至植物质体中进行表达的工具，具有许多应用于农业、医药和工业领域的潜力。

本文将介绍一种常用的植物质体表达载体构建方法以及其在相关领域的应用和流程技术。

植物质体是细胞中的一种特殊器官，其中包含了丰富的DNA、RNA 和蛋白质。

通过将外源基因导入质体中进行表达，可以使植物细胞产生特定的蛋白质，从而实现对目标基因功能的研究和生产特定蛋白质的目的。

一种常用的植物质体表达载体构建方法是利用嵌合质粒。

嵌合质粒是由质体和细菌染色体DNA片段组合而成的具有双重起源和选择标记的质粒。

该方法的具体步骤如下：步骤一：选择合适的细菌质粒作为载体。

常用的载体包括Agrobacterium、E. coli等。

首先根据需要选择合适的细菌质粒，该质粒需要能够稳定复制并在植物中高效表达外源基因。

步骤二：选择合适的启动子和终止子。

启动子是控制基因转录起始的区域，终止子是控制转录终止的区域。

通过选择适合的启动子和终止子，可以调控外源基因在植物细胞中的表达水平。

步骤三：克隆外源基因。

将目标基因克隆到载体上，通常使用限制酶切和DNA连接技术。

可以选择不同的限制酶来线性化质粒和选择目标基因以适应不同的表达需求。

步骤四：转化植物细胞。

通过植物转基因技术将构建好的载体导入植物细胞中。

常用的方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。

步骤五：筛选转化成功的植物。

使用适当的选择标记基因，如抗生素抗性基因，来标记成功转化的植物细胞。

通过诱导植物细胞分化和培养，最终得到转化植株。

植物质体表达载体在农业、医药和工业领域有广泛的应用。

在农业领域，该技术可以用于改良作物，使其具备抗病虫害、耐逆性、提高产量等特点。

在医药领域，植物质体表达载体可以用于生产重要的药物和疫苗，如疫苗蛋白、抗体等。

在工业领域，该技术可以用于生产生物材料和生物燃料等高附加值产品。

总结起来，植物质体表达载体构建方法主要包括选择合适的载体、启动子和终止子，克隆外源基因，转化植物细胞，筛选转化成功的植物等步骤。

山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建摘要利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因，ORF全长756 bp，编码252个氨基酸；其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREB DNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列（PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR）；与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对，结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%；与梅树CBF相似性为67%；进一步构建了植物表达载体，为利用CBF 基因提高植物抗逆性奠定基础。

Abstract The CBF transcription factors were cloned by RT-PCR technique from the plants of Malus baccata.The full-length of open reading frame（ORF）was 756 bp，encoding 252 amino acids；The amino acids sequence owned the characteristics of CBF protein，which contained an AP2/EREB DNA binding domain and two special short amino acids sequences；The amino acids sequences of MbCBF had highly homologous with CBF genes of other plants included in Genebank，reached 98% with Malus domestica，and 67% with Prunus mume respectively；Then we connected the gene into the plant expression vector PBI121，which laid the foundation for the utilization of CBF genes to improve plant stress tolerance.Key words Malus baccata；CBF transcription factor；clone；sequence analysis；plant expression vector低温在很大程度上限制了植物生长、发育及其地理分布，例如许多重要作物和水果（水稻、玉米、番茄、香蕉等），在低温非冰冻条件下（0～12 ℃）就会受到损害，产量下降，严重的甚至绝收[1]。

杨树EBP1基因的克隆与表达载体构建

杨树EBP1基因的克隆与表达载体构建收稿日期：2014-05-25 基金项目：天津市高等学校科技发展基金（编号：20120619）; 天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCQNJC1500）0 。

通信作者：阎国荣，博士，教授，主要从事植物资源学研究。

E-mail ：yanguorongeyou 。

自然界中植物种类繁多、形态各异，其中器官大小是造成植物形态多样性的主要因素之一。

不同植物间器官大小可能存在显著差异，但就同一物种内相同基因型的不同植物个体而言，在相同的生长环境下它们的器官大小基本一致，表明植物各器官最终大小的形成受到严格的遗传调控[1] 。

因此，近年来从不同植物中挖掘参与器官大小发育调控的基因或转录因子并揭示其调控机制的研究备受关注，并已在拟南芥和一些农作物如水稻、玉米、油菜、番茄、马铃薯等中取得了长足的研究进展[1-2] 。

有研究发现，在外界生长条件一致的情况下，植物各器官的最终大小在细胞水平上受细胞数量和大小的协同控制[3] 。

因此，分离、克隆参与调控植物细胞数量和大小的基因并阐释其功能是揭示植物器官大小发育控制机制的关键。

目前，在拟南芥等草本植物中已有多个相关基因和转录调控因子被成功分离和克隆。

有研究表明，AINTEGUMEN （TAANT）[4] 、ANGUSTIFOLIA（3 AN3）[5] 、GROWTH-REGULATING FACT（OARtG5 RF5）[5] 、GRF-INTERACTING FACTO（R GIF）[6-7] 、JAGGE（DJAG）[8] 、STRUWWELPE（TESRWP）[9] 、SWELLMAP（1SMP1）[10] 、KLUH（KLU）[11] 、EBP1[12] 及Auxin-Regulated Geneinvolved in Organ Size（ARGO）S[13-14]等主要通过正向调控细胞增殖能力控制器官内细胞数量，进而影响器官大小。

根癌农杆菌介导的DREB1C基因转化苜蓿的研究的开题报告

根癌农杆菌介导的DREB1C基因转化苜蓿的研究的开题报告一、研究背景和意义苜蓿（Medicago sativa L.）是重要的四季饲料作物之一，在家畜养殖业中具有广泛的应用前景。

然而，苜蓿在干旱、高温等逆境条件下生长发育困难，导致其产量和品质受到影响，这也限制了苜蓿的种植和利用。

因此，提高苜蓿的抗逆性是苜蓿品种选育和利用的重要问题。

DREB1C基因是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中一个关键的抗逆基因，可以显著提高拟南芥在干旱和低温逆境下的耐受性。

近年来，已经有多个研究证实，DREB1C 基因在多种植物中也具有相似的抗逆效果。

因此，利用分子生物学手段将DREB1C基因导入苜蓿中，将有望提高苜蓿的抗逆性和品质。

农杆菌介导的基因转化技术是目前广泛应用的植物基因编辑技术，其短时间、高效率和无需特殊设备的优势被越来越多地应用于各种农作物中。

此外，基因导入后可以通过筛选和检测，选择出具有特定表达水平和性状的转基因植物。

因此，本研究旨在通过农杆菌介导的DREB1C基因转化技术，将DREB1C基因转化到苜蓿中，寻找抗逆性和提高品质的苜蓿转基因材料。

二、研究方法和流程1. 提取DREB1C基因：从拟南芥中提取DREB1C基因，并进行PCR扩增。

2. 构建转化载体：将DREB1C基因克隆到载体pCAMBIA1390中，形成转化载体pCAMBIA1390-DREB1C。

3. 构建植物转化体系：采用农杆菌介导的遗传转化技术，将构建好的转化载体pCAMBIA1390-DREB1C导入到苜蓿中，以获得转基因苜蓿植株。

4. 田间验证：选取具有DREB1C基因的转基因苜蓿植株，在田间验证其表现和品质等性状。

5. 结果分析：通过一系列检测和观察，对转基因苜蓿植株的生长、发育、抗逆性和品质进行评价，分析DREB1C基因在苜蓿中的作用效果。

三、研究预期结果1. 成功实现苜蓿的转基因：通过农杆菌介导的基因转化技术，成功将DREB1C 基因转化到苜蓿中，获得具有DREB1C基因的转基因苜蓿。

双Bt基因克隆与植物表达载体的构建的开题报告

双Bt基因克隆与植物表达载体的构建的开题报告题目：双Bt基因克隆与植物表达载体的构建一、研究背景与意义：随着人口的不断增长和农业出现的新问题，化学农药的使用已经无法满足对作物病虫防治的需求，从而推动了生物农药的发展。

Bt（Bacillus thuringiensis）是一种广泛应用于农业生产中的生物农药，其毒杀作用对杀害多种害虫的能力被广泛认可（Baum et al.，2007）。

另一方面，由于害虫抗药性的快速发展，传统的单一Bt毒蛋白抗虫策略已经开始失去效果。

因此，越来越多的研究显示将多个Bt毒蛋白进行组合或融合，可增强毒力和抗虫谱广度。

例如，双Bt基因Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）已被证明具有更广泛的抗虫效果（Jiang et al.，2017）。

因此，将Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）基因克隆并构建适合于植物表达的载体，有助于生产出更安全、高效、普及的生物农药产品。

二、研究内容和目标：1.使用PCR方法从Bt菌株中克隆双Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）基因；2.将双Bt基因插入适量的表达载体，并完成该载体的转化和鉴定；3.在植物中表达重组蛋白Bt（Cry1Ac-Cry2Ab），并评估其抗虫效果；4.分析植物中Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）蛋白的含量和分布情况。

三、研究方法：1.使用PCR方法从Bt菌株中扩增双Bt基因；2.将扩增产物进行凝胶电泳纯化后，与表达载体进行重组；3.利用化学转化或生物转化方法将表达载体转化入细胞，筛选出阳性的单倍体细胞株；4.使用聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测阳性株系中Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）蛋白的表达；5.在毒蛋白表达的阳性株系中进行抗虫评估，评估方法包括拟南芥、玉米和棉花等常见作物的叶片喂食实验及昆虫的生物测定试验。

四、预期结果：1.成功克隆双Bt基因并构建表达载体，2.表达载体可以成功转化到植物细胞，植物中可表达出双Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）蛋白；3.双Bt（Cry1Ac-Cry2Ab）蛋白在提高抗虫效果方面表现出良好的潜力。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。