白色念珠菌蛋白酶与其毒力关系的研究_王丹敏
白念珠菌毒力因子及致病机制研究进展
㊃综述㊃白念珠菌毒力因子及致病机制研究进展陆一纶1吴岚2唐若愚3姜远英2曹永兵2,4(1.第二军医大学学员旅学员11队,上海200433;2.第二军医大学药学院新药研究中心,上海200433;3.同济大学医学院,上海210110;4.上海市中西医结合医院上海市中西医结合脉管病研究所,上海200082)ʌ摘要ɔ白念珠菌作为条件致病真菌,其感染力受各种毒力因子及不同宿主的影响㊂该文将白念珠菌的毒力因子和宿主细胞作为论述对象,探究其对白念珠菌致病性的影响,并对其致病机制进行综述,为进一步开发㊁利用治疗白念珠菌的药物奠定理论依据㊂ʌ关键词ɔ白念珠菌;毒力因子;宿主细胞;致病机制ʌ中图分类号ɔ R379.4ʌ文献标识码ɔ Bʌ文章编号ɔ1673-3827(2018)13-0101-04白念珠菌为条件致病性真菌,具有酵母-菌丝双相型㊂在正常情况下,白念珠菌作为无害的共生体驻留在大多数人身上㊂当机体的稳态被破坏,白念珠菌可引起从皮肤的浅表感染到危及生命的全身性感染在内的各种真菌病㊂白念珠菌存在于约75%的人体口腔内,常发生口腔内感染,称为 口腔念珠菌病 (o r a l c a n d i d i a s i s,O C)[1-2]㊂约75%妇女一生中至少患有1次外阴阴道念珠菌病(v u l v o-v a g i n a l c a n d i d i a s i s,V V C)[3-4]㊂易感人群,移植患者,低体重新生儿及接受放化疗的患者更容易因为口腔或阴道黏膜感染念珠菌而发展成黏膜和全身等严重感染,如口腔炎,阴道炎,血液感染及深部组织感染[5],其中念珠菌血症最为常见[6]㊂全身性念珠菌病死亡率仍然很高[7]㊂由于白念珠菌在临床上引起的危害,对其致病机制以及宿主抵御能力的研究具有重要意义㊂真菌细胞的内在特性及对一些外界因素的响应能力已被证实对真菌致病性有一定作用,迄今为止,白念珠菌为条件性致病真菌,其致病机制尚不明确,目前认为白念珠菌感染在不同宿主的感染力受到多种毒力因子和宿主的影响,如酵母菌丝转换㊁调解黏附性分子的分泌及对宿主细胞的入侵㊁分泌水解酶类㊁生物膜的形成㊁联系传感和向触性等[8]㊂此外,其他影响因素还包括快速适应环境p H值的波动,代谢调整的灵活性,营养采集系统基金项目:国家自然科学基金(81673478)作者简介:陆一纶,男(汉族),本科在读.E-m a i l:515214098@q q.c o m通信作者:曹永兵,E-m a i l:y b c a o@v i p.s i n a.c o m;姜远英,E-m a i l: j i a n g y y c n@y a h o o.c o m.c n 转换和应激性反应等[9]㊂在过去几年中,随着研究的深入,人们对这些因素和机制在白念珠菌感染中所发挥的作用有了更多的认识[10]㊂故本文对白念珠菌毒力因子的致病机制及毒力研究所涉及的几个方面进行综述㊂1多态性白念珠菌的多态性是其主要毒力因子之一㊂白念珠菌是一种多态真菌,可以在酵母态,假菌丝态和菌丝态三种细胞形态之间相互转换,并可以相互交织存在,形成具有三维立体结构的生物被膜[11]㊂菌丝形式已被证明比酵母形式更具侵略性㊂白念珠菌形态可因受到环境因素影响[12]及群体感应而转换,高细胞密度(>107c e l l/m L)可促进酵母态细胞的生长,而低细胞密度(<107c e l l/m L)则有利于菌丝态细胞的形成㊂酵母与菌丝生长形态的转换学术上被称为同种二形性,与真菌的致病性密切相关,一旦形成菌丝,其相关的毒力因子也会随之大量表达,从而提高其致病性[13]㊂研究表明,菌丝态白念珠菌可以通过释放水解酶来侵袭宿主的上皮细胞和内皮细胞,进而造成系统性真菌感染㊂菌丝除了可以帮助其逃逸被吞噬细胞的吞噬,还可以通过穿透上皮表面而到达更深的组织[14]㊂2黏附素和侵袭素白念珠菌侵袭人体时,菌丝表面黏附素(H w p1p)和侵袭素(A l s3p㊁S s a1p)会与宿主上皮细胞的相应受体结合,促进黏附;同时,菌丝尖端分泌水解酶(S a p2)和溶解素(C a n d i d a l y s i n),侵袭和破坏㊃101㊃中国真菌学杂志2018年4月第13卷第2期 C h i n JM y c o l,A p r i l2018,V o l13,N o.2宿主上皮细胞膜的完整性,使细胞膜通透性增加,减弱宿主细胞的防御能力[15]㊂白念珠菌通过两个不同的机制来侵入宿主细胞:诱导性内吞作用和积极渗透㊂诱导性内吞作用是指真菌表达细胞表面的特殊蛋白-侵袭素,结合到宿主配体,如上皮细胞的E-钙黏素和内皮细胞的N-钙黏素上,从而诱导被吞没的真菌细胞进入宿主细胞[16-17]㊂即使是被灭活的菌丝,其诱导内吞作用仍存在㊂说明这是一个被动的过程,不需要真菌细胞的活动㊂目前,两个侵袭素已确定,即A l s3和S s a1㊂S s a1是一种细胞表面表达的热休克蛋白70(H s p70)家族的成员㊂a l s3Δ/Δ和s s a1Δ/Δ突变体会减少上皮细胞黏附素和侵袭素的表达,可降低小鼠口咽念珠菌病模型中白念珠菌的毒性㊂A l s3和S s a1可结合到宿主的钙黏蛋白,这可能诱导宿主细胞对白念珠菌的内吞作用㊂相比之下,积极渗透是真菌侵染宿主细胞的一个主动反应过程,需要真正的白念珠菌菌丝㊂白念珠菌有一系列特殊蛋白-黏附素,可调节白念珠菌之间及与其他微生物㊁非微生物㊁宿主间的黏附力[18]㊂在生物被膜形成的早期,白念珠菌需要黏附在非生物介质的表面,该过程主要依赖于细胞表面的黏附相关蛋白㊂其中包括凝集素(A l s)家族中的凝集素样序列蛋白A l s3㊁A l s5以及菌丝细胞壁蛋白H w p1㊁分泌天冬氨酸蛋白酶S a p4㊁S a p5㊁S a p6和菌丝相关蛋白E c e1和H y r1等㊂白念珠菌黏附素最好的研究模型是凝集素样序列(a g g l u t i n i n-l i k e s e-q u e n c e,A L S)蛋白,其家族包括A l s1-7及A l s9㊂A L S基因编码糖基磷脂酰肌醇(g l y c o s y l p h o s p h a t i-d y l i n o s i t o l,G P I)样细胞表面糖蛋白,其中A l s3对黏附素尤为重要[19]㊂上述毒力因子相关的编码基因表达与菌丝形成有关,但毒力因子本身不参与菌丝的形成[20]㊂在体外口腔上皮细胞与白念珠菌共孵育,以及体内阴道感染白念珠菌期间,均可观察到白念珠菌A L S3基因表达上调[21]㊂研究表明,念珠菌口腔与上皮细胞混合培养,其菌株中均可检测到A L S2及A L S3m R N A的表达[22]㊂并且A L S在不同的模型中表达有所差异,但表达方式无明显菌株差异[23]㊂另一个重要的白念菌黏附素是H w p1,与菌丝相关G P I样蛋白有关㊂H w p1是哺乳动物转谷氨酰胺酶的底物,可能通过共价链接结合白念珠菌菌丝与宿主细胞,从而引起白念珠菌感染[24]㊂研究发现,H w p1和A l s3也与白念珠菌生物膜的形成有关㊂独立形态蛋白质(i n d e p e n d e n tm o r p h o g e n e t i c p r o-t e i n s)也可以促进细胞黏连,包括G P I连接蛋白E a p1㊁I f f4和E c m33,非共价壁相关蛋白M p65(β-葡聚糖酶)㊁P h r1(β-1,3葡聚糖转移酶),细胞表面相关蛋白酶S a p9㊁S a p10,以及蛋白质I n t1整合蛋白样表面蛋白㊂目前仍不清楚入侵宿主细胞第二线路的调节机制有哪些,但真菌黏附素和物理阻力(p h y s i c a l r e s i s t a n c e)被认为是至关重要的㊂天冬氨酸蛋白酶(S a p s)似乎也与积极渗透相关,但脂肪酶和磷脂酶未被证实有助于这一过程㊂因此,白念珠菌侵袭宿主细胞可能是由互相补充的两种机制引起的:由A l s3和S s a1诱导的内吞作用以及目前机制仍不明确的积极渗透作用㊂3分泌水解酶随着白念珠菌黏附到宿主细胞表面,并生长出菌丝,白念珠菌菌丝便会分泌水解酶,以促进白念珠菌通过内吞作用(类似肠致病性细菌的特许细胞)及积极渗透(类似植物真菌致病原理)完成主动渗透[25]㊂此外,分泌水解酶还可提高细胞外营养获取的效率㊂白念珠菌分泌水解酶分为三种类型:蛋白酶㊁磷脂酶㊁脂酶㊂天冬氨酸分泌蛋白酶家族(S a p s)由十名成员S a p1-10组成㊂S a p1-8分泌和释放到周围介质,而S a p9和S a p10可结合到细胞表面[26]㊂在全身感染小鼠模型中,S a p1-3已被证实可参与损害重组人类上皮[27]㊂最新的研究表明,S a p s在白念珠菌的不同致病阶段都发挥重要作用,包括黏附㊁浸润㊁上皮损伤和免疫逃避等㊂体外实验证实破坏编码S a p s的基因会降低白念珠菌损伤阴道和口腔上皮细胞的能力,从而减少宿主感染[28]㊂磷脂酶家族由A㊁B㊁C㊁D四类磷脂酶构成[29]㊂其中B类磷脂酶第5名成员P L B1-5位于细胞外,其通过破坏宿主细胞膜,可提高其致病性㊂在全身感染小鼠模型中,p l b1Δ/Δ和p l b5Δ/Δ突变已被证明可使白念珠菌毒性减弱[30]㊂脂酶由L I P1-L I P10等10名成员组成㊂l i p8Δ/Δ突变也可降低白念珠菌在全身感染小鼠模型中的毒性,证实了胞外水解酶在白念珠菌致病性中的作用[31]㊂4生物膜形成生物膜形成是一个连续的过程,包括酵母细胞㊃201㊃中国真菌学杂志2018年4月第13卷第2期 C h i n JM y c o l,A p r i l2018,V o l13,N o.2黏附到基底物,酵母细胞增殖,生物膜上菌丝细胞成形㊁细胞外基质材料的积累,以及酵母细胞最终从生物膜播散[32]㊂导管㊁假牙(非生物)和黏膜细胞表面(生物)是最常见的依附底物[33]㊂与浮游细胞比较,成熟的生物膜对抗菌药和宿主免疫系统有更强的抵抗力[34]㊂其影响因素包括结构复杂的生物膜㊁生物膜基质㊁药物外排泵(d r u g e f f l u x p u m p s)的表达增加及代谢可塑性(M e t a b o l i c p l a s t i c i t y)的增强㊂成熟生物膜的酵母细胞播散已被证实有直接毒力作用,播散细胞在感染小鼠模型中的毒力更强[35]㊂H s p90是一种负责各种宿主蛋白稳定性的热休克蛋白,其通过稳定蛋白磷酸酶钙调磷酸酶和MA P K M k c1,在蜉蝣状态下,产生并维持白念珠菌生物膜的耐药性㊂H s p90亦可以通过抑制c AM P-P K A信号来调节与温度相关的白念珠菌的形态变化㊂此外,H s p90亦是生物膜对抗真菌药物产生抗性所必需的㊂转录因子B c r1,T e c1,E f g1可控制生物膜的形成[36]㊂N o b i l e等研究转录网络对生物膜形成的调节以及生物膜生产调节器,其影响因素包括N d t80 R o b1和B r g1㊂已有研究表明,B C R1,T E C1, E F G1,N D T80,R O B1及B r g1中任何一个调节因子的删失,都会导致活鼠感染模型中白念珠菌生物膜形成的缺陷[37]㊂细胞外基质的产生由另外的因素控制㊂锌反应性转录因子Z a p1可负调节生物膜基质的主要成分β-1,3葡聚糖㊂葡萄糖淀粉酶G c a1和G c a2,葡聚糖转移酶B g l2和P h r1,以及外切葡聚糖酶X o g1是β-1,3葡聚糖的正调节器㊂虽然G C A1和G C A2的表达受Z a p1控制,但酶B g l2㊁P h r1和X o g1可不依赖Z a p1起调节作用㊂缺乏B G L2㊁P H R1或X O G1的生物膜在体外和体内均对氟康唑更敏感㊂此外,最近的研究表明,白念珠菌生物膜对中性粒细胞的杀伤具有抵抗性,且不引发活性氧(R O S)产物㊂有实验证据表明,细胞外基质中的β-1,3-葡聚糖可以结合更多的氟康唑,降低其对抗真菌药物的敏感性[38]㊂5传感和向触性低氧㊁缺乏营养及渗透压增高等环境因素对真菌生长具有非常重要影响,接触传感也是一个重要的环境信号㊂真菌通过与物质表面接触了解周围环境情况,并可触发菌丝以及白念珠菌生物膜的形成㊂白念珠菌的传感性同时会导致侵入性菌丝的形成,这些菌丝穿透并在基础材料内生长,其可以是宿主组织或实验室培养基㊂在宿主内,穿透性菌丝可到达血流,成为全身系统性感染的传播基础㊂向触性是指人类致病真菌如白念珠菌重新定位菌丝长轴以适应潜在的表面形貌㊂在某些具有特定拓扑表面的基质上(如脊线),可能会发生定向菌丝的生长㊂B r a n d等人研究发现,白念珠菌菌丝向触性是由细胞外钙吸收的钙通道C c h1㊁M i d1和F i g1调节的[39]㊂其他调节机制还包括R s r1极体/B u d1-G T酶[40]㊂实验室中可以检测白念珠菌的向触性反应,例如在人造物表面或者含有脊结果,白念珠菌附着胞生长可被诱导㊁重新取向㊂M S 通道可被钆剂抑制,经过G d3+处理菌丝生长而被抑制,表明白念珠菌M S通道会影响菌丝的向触性㊂与此观点一致的研究结果是,编码白念珠菌M S通道成分的M I D1基因的缺失,可导致其向触性的降低(在脊处重新定向的能力)㊂6小结理解白念珠菌的致病机制对发展新型抗真菌药物㊁诊断疾病至关重要㊂经典的抑菌及抗真菌药物旨在杀死病原微生物㊂然而,专门针对毒性因素治疗方案已被建议作为一个新的和有前途的抗真菌策略㊂一些毒力因素,如多态性㊁蛋白酶的分泌㊁侵袭素的表达,被认为是有研究价值的目标㊂因此深入研究白念菌致病机制和感染宿主的相关分子机制可为白念珠菌及其他病原微生物发病机制的研究㊁临床诊断和治疗提供依据㊂参考文献[1]K e n n e d y C B,H e n i n g t o n VM,B o r d 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白色念珠菌的毒力研究综述
白色念珠菌的毒力因子研究孙海燕综述，邹敬才审校白念珠菌属于机体微生态群落中的一个正常菌群成员，是一种具有多种形态的真菌。
可以有厚壁孢子、酵母、假菌丝和菌丝等多种形态。
白念珠菌感染常见于免疫受损人群，是深部真菌感染的首要病原菌, 占医院内微生物感染第4位。
白色念珠菌既为正常菌又是条件致病菌，它能够逃逸机体的免疫系统、治疗药物等，在合适的条件下进入机体组织内引起疾病。
因而白色念珠菌的致病性和毒力可能是由一组因子决定，而不是由单一的因素决定的。
白色念珠菌的几种毒力表现为对环境变化的适应性（即表型转换和二态性）、对宿主细胞及组织的黏附性及分泌水解酶等，这些因子构成了念珠菌黏附及入侵黏膜细胞的必要条件。
对白色念珠菌的毒力研究涉及以下几个方面。
1、白色念珠菌体外毒力研究1.1、二相性转换白色念珠菌是一种多形性的生物体，形态学上可以包括：①酵母样出芽细胞；②假菌丝；③菌丝或菌丝体；④厚壁孢子。
白念珠菌形态学的转换尤其是酵母相向菌丝相的转换是致病的重要因素，不能产生菌丝的白念珠菌其毒力减弱或者没有毒力[ 3]酵母样出芽细胞到菌丝转换最初的形成阶段是芽管的形成。
在特殊的宿主环境的刺激下，酵母与菌丝生长之间的转换能力，决定着白色念珠菌的侵袭力。
这两种形态在临床损害中都存在，可能在致病过程中都发挥作用，而菌丝能够更牢固的黏附宿主细胞，可以促进组织渗透[9]。
由于菌丝的向触性和向药性，菌丝能够发现上皮和内皮的破损表面并进行渗透，侵入宿主组织。
在体外模拟实验中发现这种二态性可以由许多环境条件来调节，如温度、pH 及营养状态（血清、N-乙酰氨基葡萄糖、脯氨酸等）。
一般认为芽管可以提高白念珠菌的组织侵袭性和黏附力。
应用新的唑类药物抑制白念珠菌芽管的形成后, 此菌株的黏附内皮细胞的能力明显下降了[ 8] 。
也有人证实白念珠菌的芽管形成阶段可以穿透上皮细胞膜, 在组织病理切片中发现其组织侵袭的部位更深, 推测可能是与菌株芽管表面的水解酶的活性有关[ 9] 。
奶牛乳房炎溶血性病原菌分离培养及药敏试验
ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｉ ｎ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｂ ｌ ｙ ａ ｔｅ ｆ ｒ ｒ ｅ ｐ ａ ｉ ｒ ａ ｎ ｄ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｔ ｓｆ ｏ ｒｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆｒ ￣ａ ｉ ｒ ．
Ｃｅ ｌ ｌ １ ３ ４： ２ ３ １ － ２ ４ ３ ．
３ 讨论 白念珠菌中细胞检验点相关信号转导通路的蛋白磷酸化 在细胞生长发育和茵丝形成中有着重要的作用【 ３ 】 。研究细胞 检验点相关蛋 白的磷酸化和去磷酸化，可 以筛选出抗真菌药 物的靶 点。Ｐ Ｔ Ｃ ２ 蛋白是重要的２ Ｃ 类蛋 白磷酸酶 ，可能在与
２ ０ １ ３ 年第 １ ２ 期 （ 总第 ２ ０ ３
试验研究
奶 牛乳房炎溶血性病 原菌分离培养及药敏试验
顾 冬花 （ 青海省大通县畜牧兽医 站 ８ １ ０ １ ０ ０ ）
摘要 为了掌握大通县某奶牛场引 起奶牛乳房炎的主要致病菌及耐茵药物，无菌采集病牛乳样，进行细菌分离 培养
和细菌药敏试验．结果显示 ，该奶牛 场奶 牛乳房 炎的主要致 病茵为２ 种溶血性链球 菌，即ａ 一 溶血 性链球 菌和 ｐ － 溶血性链球
在 实 际 生产 中缺 乏 专业 的饲 养 管理 人 员 ， 缺 乏预 防 意
识 ，再加 上对疾 病的 了解 、认识及 防治 意识薄 弱 ，在 不 清楚 病 因的情况 下 ，乱用 、滥 用抗 生素 ，结果 造成耐 药
・ 通 讯作 者
●；－ － ● － ● －
锅 、酒精灯 、显微 镜 、平 皿 、锥形瓶 、接种针 、超 净工
白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究进展
ｂｐ的开放阅读框范围内，且定位在５个不同的
万方数据
匿堂堡适垫！Ｑ生生旦箜！垒鲞笠！塑丛型ｉ型垦！坚唑！！坐：叁匹！Ｑ！Ｑ：！巫：！垒：盟！：！
・１１５３・
主要蛋白酶基因是ＳＡＰ２Ｈ Ｊ。而在２５℃时，ＳＡＰ８的蛋 白水平和转录物增加，表明这一基因的表达是受温度 调节的，但ＳＡＰ９～ＳＡＰｌ０似乎为非温度依赖件的【５１。
首先发现以外源性蛋白质作为惟一氮源进行体外培 养的白念珠菌能分泌一种酸性蛋白酶。这种具有水 解活性的蛋白酶曾有很多不同的名称，但目前ＳＡＰ 已被广泛接受。ＳＡＰ是白念珠菌胞外蛋白酶的主要 成分，属于天冬酰内肽酶类，在细胞外起催化水解蛋 白质肽键的作用，目前认为它至少有１０个成员 （ＳＡＰｌ～１０），资料显示，１０个ＳＡＰ长度在１１７３—
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＳＡＰ）是潜在
的毒力因素，在白念珠菌感染过程中具有较强的致 病作用。因此，研究其酶毒力与致病性的关系一直 受到国内外学者的广泛关注。近年来，随着分子免 疫学、分子生物学技术的发展，白念珠菌ＳＡＰ的研究 取得很大进展。 ｌ简介
１．１
白念珠菌ＳＡＰ由来及主要功能１９６５年，Ｓｔａｉｂ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｔｈｒｅａｔ ｓｅｒｉｏｕｌｙ
ｏｆ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ’ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｙｅａｓｔ ｉｓ
ａ
ｍｏｄｅｍ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，
ｉｓ
ｏｎｅ
ｈｕｍａｎ ｓａｆｅｔｙ．Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｓｐａａｙｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｆａｃｔｏｒｓ
ｍｅｍｂｅｒ ｂｒｉｎｇ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ
ｔｏ
ｒｅｓｅ．ａｒｅｈｅｒ
ｆｕｒｔｈｅｒ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ
白念珠菌磷脂酶与其毒力关系的研究_付萍
9:9:= 蛋黄培养基的配制 沙堡葡萄糖琼脂 (BC@ % 含 9 ?2/D7 E’F/$G:GG$ ?2/D7 F’F/=! 高 压 灭 菌 9$ ?4H & 取 新 鲜 鸡 蛋 数 个 ! 以 ;$I 的乙醇浸泡 =G ?4H 消毒 ! 用火烧去鸡蛋 表 面 的 剩 余 乙 醇 ! 取 出 蛋 黄 液 ! 按 每 !GG ?7 培 养 基 加 蛋 黄 液 " ?7 ! 充 分 混 匀 后 !
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组尾静脉注射生理盐水 G:# ?7" 观察小鼠存活 时 间 ! 以 平 均 生 存时间来评价菌株毒力 "
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统计学方法 检测数据采用 B6BB9G:G 软件包进行统计学处理 "
章强强 : 白念珠菌的毒力研究磷脂酶活力的测定 MhN: 中 华 皮 肤 科 杂 志 ! 9;;" ! #K ( $ % * %G"P%G$:
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白念珠菌的毒力研究—分泌性酸性蛋白酶活力的测定
白念珠菌的毒力研究—分泌性酸性蛋白酶活力的测定
王冬云;马慧群;谭升顺;马韵琴;陈庆秀
【期刊名称】《中国皮肤性病学杂志》
【年(卷),期】2001(15)6
【摘要】目的研究白念珠菌的毒力与分泌性酸性蛋白酶活力间的关系。
方法
将分离自血液、鹅口疮、念珠菌性阴道炎及健康带菌者的白念珠菌接种于牛血清白蛋白培养基 (BSA)上 ,经氨基黑染色后 ,测量蛋白分解区。
结果来源于患者的白念珠菌分泌性酸性蛋白酶活力明显高于健康带菌者。
结论白念珠菌的毒力与其分泌性酸性蛋白酶活力呈正相关。
【总页数】2页(P375-376)
【关键词】白念珠菌;毒力;酸性蛋白酶;测定
【作者】王冬云;马慧群;谭升顺;马韵琴;陈庆秀
【作者单位】西安交通大学第二医院皮肤科
【正文语种】中文
【中图分类】R379.4
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1.白念珠菌的毒力研究—磷脂酶活力的测定 [J], 章强强
2.白念珠菌分泌性蛋白酶活力与其对氟康唑耐药性之间关系的研究 [J], 叶夏云;钟建庭;刘丽
3.阴道白念珠菌氟康唑敏感性与分泌性蛋白酶活力的相关性研究 [J], 石春蕊;韩永
智;骆志成;董永霞
4.敏感和耐药白念珠菌磷脂酶活力与其毒力关系的研究 [J], 苏英;李春阳
5.白念珠菌的毒力研究——蛋白酶活力的测定 [J], 温旺荣;王德春;陈红;朱忠勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用分子生物学技术研究白色念珠菌的致病机制
利用分子生物学技术研究白色念珠菌的致病机制一、引言白色念珠菌（Candida albicans）是一种常见的真菌，它可以引起多种疾病，包括超菌感染、口腔念珠菌病、阴道炎和侵袭性念珠菌病等。
这些疾病在世界范围内都非常普遍，特别是在免疫抑制的患者中，发病率更高。
因此，白色念珠菌的致病机制一直是研究的热点之一。
分子生物学技术为我们研究白色念珠菌致病机制提供了有力工具。
本文将重点介绍利用分子生物学技术研究白色念珠菌的致病机制。
二、白色念珠菌的致病机制白色念珠菌有多种致病因素，包括表面结构、分泌蛋白和细胞信号通路等。
这些致病因素相互作用，诱发宿主免疫反应，从而导致炎症、休克和器官功能障碍等症状。
下面，我们将分别介绍其中一些主要的致病因素。
1.表面结构白色念珠菌的表面结构变化是其致病性的关键因素之一，其中主要的结构包括几丁质、β-葡聚糖和α-葡聚糖。
这些结构可以与宿主免疫系统相互作用，诱导炎症反应。
几丁质是白色念珠菌细胞壁的重要组分，它可以激发宿主免疫系统的Toll样受体2（TLR2）和TLR4，从而启动炎症反应。
β-葡聚糖和α-葡聚糖可以通过激活Complement系统和细胞黏附分子（CAMs）与宿主免疫系统产生交互作用，促进炎症反应和细胞黏附。
2.分泌蛋白白色念珠菌可通过分泌多种蛋白质来干扰宿主免疫反应，并促进其自身生存。
其中最研究的蛋白质是蛋白沙漏（SAPs），SAPs是一组分泌性酸性蛋白酶，它们可以降解宿主免疫系统所释放的一系列蛋白质，包括免疫球蛋白、血凝素和补体等，从而干扰宿主对真菌的清除。
此外，白色念珠菌还能分泌其他类别的蛋白质，包括交联素（ALS）、分泌性浆液胞蛋白（EPA）、花生四烯酸特异性磷脂酰肌醇氨化酶（PLB）等，这些蛋白质在致病过程中也发挥了重要的作用。
3.细胞信号通路念珠菌细胞内的信号通路（CIS）也是影响其致病性的重要因素之一。
CIS按照功能可分为三大类，分别是信号转导、转录调控和细胞生理学。
白念珠菌的毒力因子研究新进展
白念珠菌的毒力因子研究新进展
陈冰;廉翠红;刘维达
【期刊名称】《国际皮肤性病学杂志》
【年(卷),期】2006(32)2
【摘要】白念珠菌是一种重要的人类致病真菌,其毒力因素主要包括黏附因子、利于侵入酶的因子、白念珠菌的形态发生及表型转换等.白念珠菌毒力因子检测方法主要包括脲裂解方法,分裂基因法,用系统化处理方法来分析基因功能以及通过差异显示逆转录聚合酶链反应寻找可能的与毒力相关的基因.
【总页数】3页(P102-104)
【作者】陈冰;廉翠红;刘维达
【作者单位】518035,深圳市第二人民医院皮肤科;518035,深圳市第二人民医院皮肤科;中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R75
【相关文献】
1.白念珠菌毒力因子的研究进展 [J], 陈雪蓉;肖敦振
2.甲紫对白念珠菌毒力因子作用的实验研究 [J], 苏英;李春阳
3.白念珠菌毒力因子及致病机制研究进展 [J], 陆一纶;吴岚;唐若愚;姜远英;曹永兵
4.口腔白念珠菌耐药性及毒力因子表达水平相关性研究 [J], 孙康德;张家胜;陈旭;虞中敏;陈福祥
5.白念珠菌侵袭宿主毒力因子研究进展 [J], 邱熙然;陈思敏;侯炜彤;张玉;郭诗雨;姜远英;安毛毛
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白假丝酵母菌分泌型天冬氨酰蛋白酶的研究进展
参
考
文
献
］
［１】秦启贤．临床真菌学［Ｍ］．上海：复旦大学出版社，２００１：５８—
［２］Ｗａｎｇ ＤＭ。Ｌｉｕ ＬＹ，Ｙｅ Ｌ，ｄ ａ／．Ｆｕｒｉｆｉｅａｎｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
ｏｆ
ａｓｐａｒｔｉｅ
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
ｆｒｏｍ
Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ［Ｊ】．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，２９（２）：２７—３０． ［３ ３
５４６
［文章编号］１０００－２２００（２００９）０６－０５４６－０３
・综述・
白假丝酵母菌分泌型天冬氨酰蛋白酶的研究进展
汪春华综述，陈艺林审校
［关键词］白假丝酵母菌；天冬氨酰蛋白酶；综述 ｆ中国图书资料分类法分类号］Ｒ
３７９．４
【文献标识码］Ａ 方法可循。王丹敏等¨１在诱导Ｓａｐ时，先取一环ＹＰＤ（葡萄 糖２．０％、蛋白胨２．Ｏ％、酵母粉１．Ｏ％或琼脂１．５％，ｐＨ值 ６．５）斜面上的活化菌接入１０
［收稿只期］２００８－０１－０３ ［作者单位］蚌埠医学院病原生物学教研室．安徽蚌埠２３３０３０ ［作者简介］汪春华（１９７６一），女，硕士研究生．
口腔黏膜感染者中，ＳＡＰ２和ＳＡＰ５表达最多，在阴道黏膜感 染者，ＳＡＰ２、ＳＡＰ４、ＳＡＰ５表达最多；在小鼠的系统性感染模型 中，ＳＡＰ４～ＳＡＰ６持续高水平表达，ＳＡＦ７不表达一Ｊ。单个
ｏｆ
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Ｃａｎｄｉｄａ耐６咖ｃａｕｓｅｓ
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ＳＡＰ４．ＳＡＰ５．ａｎｄ
ＳＡＰ６
ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ【ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ
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白色念珠菌生物膜对消毒剂抵抗性的研究
１ １ 菌株 白色念 珠 菌 Ｃ ４ ． ａ０为 本 室 保存 的 临床
作者简介 ： 张 薇 ， ，９ ８年 出生 。本 科 学 历 ， 管 技 师 ， 要 从 事 女 １７ 主 主
微生物检验工作 。
作 者 单 位 ：．１０ ３ 北 京 ， 警 总 医 院 检 验 科 ；．３ ０ ６ 天 滓 ， １ ００９ 武 ２ ０ １２ 武 警 医 学 院 微 生物 学 教 研 室
表 １ 培养２ｄ 念珠菌生物膜和游离菌对不同消毒剂的抵抗性测定结果
３ 讨
论
丝组成 的致 密 网状 系 统 ， 一 个 有 机 的 三 维 结 构 。 呈 本研究 用 高分子 除 菌 滤 膜来 制 备 生 物 膜 ， 沙 氏平 在 板 培养 ２ｄ后 可见膜 片 表面形 成 一层 致 密 的灰 白色 菌膜 ， 不能用 无 菌生理 盐水 冲洗 掉 。 生物膜 中菌 的生 物学特性与 浮游 菌显著 不 同 ， 环 境适 应能力增 强 ， 可抵 抗 吞 噬细 胞 的吞 噬作 用 ， 可逃 避宿 主免疫系统 的清 除作用 ， 界环境 存在 的抗菌 对外 药物 、 消毒剂 等杀菌物质 有很强 的抵抗力 。生 物膜 中
１ ６ 消毒 剂对 生物 膜 的作 用 取 培养 ２ｄ ５ｄ的 ． 、
武警匡堂
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１ ５
膜片 ， 用无 菌生 理 盐水 冲洗 表 面 游 离 菌 ， 膜 片 浸 将 泡入 ７ ％ 乙醇 、％ “ ４ 消 毒 液 、 ％ 苯 扎 溴铵 消 毒 ５ ５ ８” ３ 液 、％ 戊 二 醛 和安 尔 碘 中。消 毒 剂 分 别 作 用 ｌ 、 ２ ５ ３ 、０ ９ 、２ ｉ ０ ６ 、０ １０ｍ ｎ后取 出膜 片 ， 冲洗 掉残余 消毒 液 ， 置 于 ５ｍ 相应 中和剂 中 ， ｌ 中和作用 １ ｉ ０ｍ ｎ后用匀 浆 器将膜 片研磨 粉碎 ， 以稀释涂 布法进 行菌 落计数 ， 每 个时 间组测试 ３次 ， 量 取 平均 值 。 同时按 常规 方 菌 法培养 游离念珠 菌 ， 照 与生 物膜 相 近 的 菌量 将 游 按 离念珠 菌菌液滴 加在 高 分 子 滤膜 上 ， 泡入 上 述 消 浸 毒剂分别 作用 １ 、０ｍ ｎ后取 出膜片 作为对 照 。 ５ ３ ｉ
探讨白带中白色念珠菌蛋白酶的测定及药敏结果分析
探讨白带中白色念珠菌蛋白酶的测定及药敏结果分析摘要：目的研究分析白带中白色念珠菌的致病性和指导抗真菌药物的合理使用。
方法此次研究的对象是选择2013年1月至2015年12月白带标本中分离的300株白色念珠菌进行蛋白酶测定，同时测定氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑的最低抑菌浓度（MIC）。
结果 300株白色念珠菌全部检出蛋白酶，其中蛋白酶活力高、中、低检出率分别为83．7%（251株）、12．7%（37株）、4．0%（12株）。
4种抗真菌药物的耐药率分别是17．3%、11．3%、63．3%和44．6%。
结论白带中白色念珠菌具有致病性，临床应密切关注。
关键词：白色念珠菌；白带；蛋白酶；耐药性Abstract：Objective To study the pathogenicity of Candida albicans and guide the rational use of antifungal drugs.The object of this research method is to select from January 2013 to December 2015 from vaginal specimens in 300 strains of Candida albicans by protease determination of minimum inhibitory concentration determination of flucytosine，amphotericin B，fluconazole，itraconazole（MIC）.Results all of the 300 strains of Candida albicans were detected protease，the protease activity of high，medium and low detection rate was 83.7%（251 strains），12.7%（37 strains），and 4%（12 strains）.The resistance rates of 4 antifungal drugs were 17.3%，11.3%，63.3% and 44.6%，respectively.Conclusion Candida albicans in the leucorrhea is pathogenic and should be paid close attention to.Candida albicans；leucorrhea；protease；drug resistance In白色念珠菌是人体正常菌群之一，主要寄生于人体的体表及口腔咽喉等部位，是引起女性生殖道感染的常见菌。
白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶的诱导研究
白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶的诱导研究王丹敏;董小青;龚海英;刘丽英【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2002(013)006【摘要】目的了解诱导白色念珠菌分泌酸性蛋白酶(SAP)的条件。
方法分别用含不同氮源及不同起始pH的培养基摇瓶培养白色念珠菌WD 27菌株，定时取样用分光光度法检测胞外SAP活性和菌体生长量。
结果蛋白质、多肽类大分子氮源可诱导白色念珠菌分泌SAP，氨基酸、尿素、铵盐等小分子、易代谢氮源可阻遏SAP分泌。
当两大类氮源同时存在时酶分泌抑制程度取决于阻遏物的浓度。
培养基起始pH为3.0～6.0时白色念珠菌才可被诱导分泌SAP。
结论白色念珠菌SAP 诱导分泌主要受环境中氮源分子大小及pH的影响。
【总页数】3页(P341-343)【作者】王丹敏;董小青;龚海英;刘丽英【作者单位】武警医学院微生物教研室,天津,300162;武警医学院微生物教研室,天津,300162;武警医学院微生物教研室,天津,300162;武警医学院微生物教研室,天津,300162【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.分泌型磷脂酶 A2诱导神经细胞凋亡机制的研究进展 [J], 李威;刘斌;贺华;宾文凯2.白色念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系 [J], 曹岩;张巨;沙春蕊;郑永晨;刘永红3.白色念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的纯化与性质 [J], 王丹敏;刘丽英;叶路;高磊4.白色念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶在口腔扁平苔藓患者唾液中的表达 [J], 张英;闻妍;康媛媛;钟鸣5.β连环蛋白信号通路和Wnt诱导的分泌型蛋白1在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用机制研究 [J], 王丽;方天富;郭宝亮;薛陆静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
白色念珠菌的生长曲线和世代时间测定
以后的菌液取 10- 4 ~ 10- 11 稀释度 各 100 Ll 用 灭菌三 角涂 棒
很少 可忽落不计, 而在稳 定尤 其是衰 退期, 有 大量 细菌 死 亡, 活菌数逐渐减少而 总菌 数基 本稳定 这就 造成了 两种 实 验方法绘制的生长 曲线反 映的 稳定 期、衰退 期时间 阶段 不
同。因此, 我们在 进行 细菌的 生长 曲线 的绘制 及计 算世 代 时间时, 应以活菌计数法为准。
40
31 01
42
21 96
46
21 91
50
21 85
54
21 57
01 4786 01 4713 01 4639 01 4548 01 4099
图 2 白色念珠菌生长曲线 ( 活菌计数法) 表 2 白色念珠菌的活菌浓度及 ln 值
时间 ( h) 8 16 20 24 28 36 48 54 72
127. 470- 4711
( 责任编辑: 段姚尧)
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两种测定方法之所以出现如此的不同是因为比浊法od值反映的是总菌浓度而在对数生长期细菌的数量呈指数增加死亡菌数很少可忽落不计而在稳定尤其是衰退期有大量细菌死亡活菌数逐渐减少而总菌数基本稳定这就造成了两种实验方法绘制的生长曲线反映的稳定期衰退期时间阶段不同
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武警医学院学报 Acta Academiae M edicinae CPAF
主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较
主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较王丹敏;蒋书勤;叶路【期刊名称】《中国微生态学杂志》【年(卷),期】2001(13)6【摘要】目的 :了解不同病原念珠菌蛋白酶分泌情况 ,探讨蛋白酶活性与菌种致病力的关系。
方法 :采用牛血清白蛋白 (BSA)琼脂平板检测 7种 (共 2 86株 )念珠菌酸性蛋白酶的分泌 ;将菌株分别经摇瓶液体培养测定胞外蛋白水解活力。
结果 :7种念珠菌蛋白酶分泌水平的高低关系为 :白色念珠菌 >热带念珠菌 >近平滑念珠菌 >季也蒙念珠菌 >其他 3种念珠菌 ,与菌种致病力强弱关系基本一致 ;白色念珠菌、热带念珠菌菌株平均产酶能力是光滑念珠菌、乳淋念珠菌的 17.4～ 36 .3倍。
各种念珠菌产生的蛋白酶均属天冬氨酸蛋白酶类。
结论 :蛋白酶与念珠菌致病性关系密切。
【总页数】2页(P349-349)【关键词】念珠菌;蛋白酶;分泌水平;致病性【作者】王丹敏;蒋书勤;叶路【作者单位】武警医学院微生物教研室;武警医学院附属医院【正文语种】中文【中图分类】R379.4【相关文献】1.阴道白念珠菌致病株与携带株分泌性蛋白酶活力的比较 [J], 韩永智;骆志成;何容霞;武三卯;周晓黎2.白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶基因在急性念珠菌性外阴阴道炎中的表达 [J], 冯静;涂亚庭;林能兴;冯爱平3.念珠菌性外阴阴道炎患者阴道分泌物中白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶表达 [J], 廉翠红;刘维达;赵敬军4.两种提取油对胃溃疡小鼠的胃酸分泌水平及胃蛋白酶活性的影响比较 [J], 周志林;梅勇;戴军;杨旭辉;赵志辉5.念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究进展 [J], 宋悦;冯文莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究进展
白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究进展
汪薇
【期刊名称】《医学综述》
【年(卷),期】2010(016)008
【摘要】白念珠菌为现代医学最重要的机会性致病酵母菌,严重威胁着患者的生命.分泌型天冬氨酸蛋白酶是白念珠菌分泌的一种酸性蛋白酶家族,与白念珠菌毒力密切相关,由于它至少含有10个成员,各成员之间多方面的差异和错综复杂的关系给科研工作者明确白念珠菌蛋白酶的致病机制带来了困难.近年来,大量研究证实了分泌型天冬氨酸蛋白酶各成员对温度、pH值等培养方面有不同的要求,基因突变技术的发展,进一步明确了基因表达调控与机体感染部位、感染状态之间的关系及转录活化因子在蛋白酶各成员表达中的作用.
【总页数】4页(P1152-1155)
【作者】汪薇
【作者单位】昆明医学院第二附属医院皮肤科,昆明,650101
【正文语种】中文
【中图分类】R379.4
【相关文献】
1.白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶研究进展 [J], 王凯丽;张宏
2.分泌型天冬氨酸蛋白酶-2的研究进展 [J], 林艳
3.白假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶与菌株毒力的研究 [J], 臧琳琳
4.白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究近况 [J], 赵敬军
5.白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究进展 [J], 秦振宇
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白带中白色念珠菌蛋白酶的检测及耐药性分析
白带中白色念珠菌蛋白酶的检测及耐药性分析
廖璞;王东生
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2005(020)003
【摘要】目的评价白带中白色念珠菌的致病性和指导抗真菌药物的合理使用.方法对我院2003年1月～2004年12月白带标本中分离的300株白色念珠菌进行蛋白酶测定,同时测定氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑的最低抑菌浓度(MIC).结果 300株白色念珠菌全部检出蛋白酶,其中蛋白酶活力高、中、低检出率分别为83.7%(251株)、12.7%(37株)、4.0%(12株).4种抗真菌药物的耐药率分别是17.3%、11.3%、63.3%和44.6%.结论白带中白色念珠菌具有致病性,临床应密切关注.
【总页数】2页(P279-280)
【作者】廖璞;王东生
【作者单位】重庆市第三人民医院检验科,重庆,400014;重庆市第三人民医院检验科,重庆,400014
【正文语种】中文
【中图分类】R379.4
【相关文献】
1.含光滑念珠菌与白色念珠菌白带的比较分析 [J], 彭俊;顾敏;盛桂芳;周家玉
2.白带标本中白色念珠菌带菌状态与致病状态形态差别的探讨 [J], 何德奎
3.白带中白色念珠菌蛋白酶的测定及药敏结果分析 [J], 于洪波
4.自愿婚检者白带中白色念珠菌蛋白酶的检测 [J], 方从举
5.白带中白色念珠菌致病性的研究 [J], 黄长武;李兴禄;邱君凤
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文章编号:1005-376X(2000)08-0215-02【论 著】白色念珠菌蛋白酶与其毒力关系的研究王丹敏,韩景田,董小青,屈 野(武警医学院微生物与寄生虫教研室,天津300162) 摘要: 目的 探讨白色念珠菌蛋白酶活动与其毒力的关系。
方法 采用牛奶平板法检测54株白色念珠菌蛋白酶的分泌能力,然后选择6株菌分别经摇瓶培养测定其蛋白酶活力,并以静脉内注射方式感染小鼠进行毒力试验,以小鼠平均生存时间来评价菌株毒力。
结果 54株白色念珠菌全部能分泌蛋白酶,检出率为100%。
动物试验表明蛋白酶活力愈高的菌株,相应小鼠平均生存时间愈短;蛋白酶活力与菌株毒力直接正相关(r=0.934,P〈0.01)。
结论 蛋白酶是白色念珠菌重要的毒力因子,蛋白酶活力可作为反映其毒力的直接指标。
关键词:念珠菌;蛋白酶;毒力.中图分类号:R379.4 文献标识码:ASTUDY ON THE RELATIONSHIP BETWEEN CAND ID A ALBICANS PROTEINASE AC-TIVITY AND VIRULEN C E IN MICEW AN G Dan-min,HAN J ing-tian,DON G Xiao-qing,et al.(Department of Microbiology and Panasitology,Med ical College of CP AF A,Tianjin300162)Abstract Objective to study th e relationship betw een Can did a Albicans proteinas e activity and virulence in mice.Methods proteinase s ecretion of th e54C.albicans strains w as detected on milk-agar plate.Six s trains w ere selected andth eir proteolytic activity w as determin ed after incubation on ash ak er.The virulence w as es pres sed as th e m ean sruvivaltim e of mice.Results All of54strains t e s ted secreted prot e inase i ndicati ng tha t the det ection ra te was100%.Ani mal ex peri mentshowed tha t the higher proteinase activi ty was asso c ia ted with the sho rt er av era ge surv i v al tim e of mice.There wa s a directly positiv e co rre-latio n be tween prot e inase activit y and virulence(r=0.934,P〈0.01).Conlusions T hese r esults indica te tha t ex t racelluarpro teinase is a putativ e v irule nce factor fo r C.Albicans.Pr oteina se activity ca n be used as the direct pa ram-eter fo r vir ulence of C.Albicans.Keywords:candida;pro teinase;vir ulence. 白色念珠菌(简称白念菌)是人体正常菌群的成员之一,也是重要的条件致病性真菌,其致病性与粘附、芽管生成、疏水性和胞外酶等有关。
近年来,白念菌分泌的胞外蛋白酶逐渐受到研究者的关注。
此酶又称为白念菌酸性蛋白酶(Ca ndida albicans acid pro teinsae,C AP),在以外源蛋白质为唯一氮源的限制性培养条件下才能诱导白念菌产生C AP。
有报道表明,胞外蛋白酶在白念珠菌病发病中起重要作用[1.2]。
本文对白念菌蛋白酶活力与其对小鼠毒力的关系作一探讨。
1 材料与方法1.1 菌株 共54株(菌号WD01—W D54),从念珠菌病患者标本中分离来,均经假菌丝、厚膜孢子、T TC还原及芽管生成等试验系统鉴定,确定为白念菌。
菌株于无菌蒸馏水中-20℃下保存备用。
1.2 培养基1.2.1 YEPD培养基(%) 葡萄糖 2.0g,蛋白胨2.0g,酵母粉1.0g(p H7.5)。
1.2.2 YGM-牛奶培养基(%) 葡萄糖2.0g,酵母粉0.02g,KH2PO40.1g,琼脂 2.0g(p H5.0);经灭菌后冷却至50℃加入无菌脱脂牛奶3%(V/V)。
1.2.3 产酶培养基(%) 葡萄糖2.0g,酵母粉0. 05g,KH2PO40.1g(p H5.5);灭菌后加入经过滤除菌的牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为0.2%。
1.3 牛奶平板法检测白酶的分泌 将各菌株点种于YGM-牛奶平板上,37℃培养48h后,倒入适量10%三氯乙酸(TCA)进行固定后,用磷酸盐缓冲液充分洗涤。
测量菌落及其周围透明圈的直径,根据两者比值的大小将所试验菌株分为高活力(A)、中等活力(B)、低活力(C)三组。
1.4 粗酶液的的制备 分别从A、B、C三组中随机挑选2株,将此6株菌接种于10mlYEPD肉汤中, 37℃振荡(150r/min)培养液于4000r/min离心10min,收集上清液即得粗酶液。
1.5 蛋白酶活力的测定[1] 在1.2m l0.5%牛血红蛋白溶液(用0.2M,p H3.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)中加入0.3ml粗酶液,37℃水浴振荡反应1h后,加入 1.5m l20%TCA终止反应;4000r/min 离心10min后,取上清液用751分光光度计测275nm吸收值。
蛋白酶与底物反应所得产物的1个单位的A275定义为1个酶活力单位(U)。
1.6 动物试验 昆明种纯系雌性小鼠(天津市试验收稿日期:2000-03-27作者简介:王丹敏(1970-),女,讲师。
215中国微生态学杂志 2000年8月第12卷第4期 Chinese J ou rnal of Microecology,Aug ust2000,Vol12No4动物研究中心提供)共70只,体重18～20g ,随机分为7组,分别编号为对照、A 、B 、C 、D 、E 、F ,每组10只。
将前面挑选的6株菌分别经YEPD 肉汤常规培养后,经4000离心收集菌体并洗涤两次后,用生理盐水配制浓度为 2.5×107/ml 的菌悬液。
每株菌接种一组小鼠,分别经尾静脉给每只小鼠注射菌悬液0.2m l ;对照组给每只小鼠静脉内注射生理盐水0.2ml 。
每日观察小鼠存活情况,共计30d ,以小鼠平均生存时间来评价菌株的毒力。
2 结 果2.1 白念菌分泌蛋白酶情况 将各菌株点种于V GM -牛奶平板上,培养后所有菌株的菌落周围均出现清晰的透明圈,蛋白酶阳性的菌株检出率为100%。
根据透明圈和菌落直径两者比值的大小,可将54株白念菌初步分为高活力(A)、中等活力(B)、低活力(C )三组,每组出现率分别为42.6%、35.2%、22.2%。
2.2 白念菌蛋白酶活力与其毒力的关系结果表1。
表1 六株白念菌蛋白酶活力及其小鼠毒力试验结果组别接种菌株酶活力(U /ml)死亡率(%)平均存活时间(d)死亡时间范围(d)对照A B C D E F无W D 27W D 18W D51W D15W D04W D 39无3.382.542.051.901.810.89010010010010010090>303.95.49.711.416.520.5未知*(2～8)(2～10)(4～18)(5～20)(10～26)(9～29)注:因该组小鼠在30d 内无一只死亡,故未能测短其死亡时间范围由表1可知,W D 27、W D 18、W D 51、三菌株为高毒株,小鼠平均存活不到10d ;W D 15、WD 042菌株为中等毒株,小鼠均在接种后4～20d 内死亡;W D39则为低毒株。
并且菌株分泌的蛋白酶活性愈高,其对小鼠的毒力也愈强。
以小鼠平均存活时间的倒数表示毒力,将所测得的主要数据进行曲线拟合和相关分析,结果见图1。
由图1可以看出白念菌的蛋白酶活力与其对小鼠的毒力呈线性正相关(r =0.934,P <0.01)。
3 讨 论近几年来发现越来越多的念珠菌能分泌酸性蛋白酶。
Yamamo to 等[3]采用平板法检测数种念珠菌的产酶情况,发现产蛋白酶菌株的检出率由高到低依次为白念菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌,与它们的致病力强弱顺序一致。
白念菌分泌酸性蛋白酶的平板检测依据酶作用底物有BSA 平板法、酪蛋白平板法及牛奶平板法等[4]。
前两方法均要经氨基黑等蛋白质类染料染色后才能观察到蛋白分解圈,其灵敏度要受染液浓度、染色时间及脱色程度等多方面因素影响。
相比较,牛奶平板法具有不需染色、敏感性高、不易受干扰等优点。
本试验采用此方法,发现54株被检菌株均能向胞外分泌蛋白酶,阳性率为100%,且高活力菌株接近占半数,此结果与不少国外研究一致[2.3]。
但也有报道,只有部分白念菌菌株能产生胞外蛋白酶,有的检出率仅为16%[1,5]。
检出率的差异可能与采用不同的平板检测方法存在的灵敏度差异有关,并且也与接种方法、接种量大小有关。
图1 六株菌蛋白酶活力与其毒力的关系许多体外实验证实,白念菌的致病性与蛋白酶的分泌有关,但由于多数只停留在定性研究,故常不能确定此两者的相关程度。
本研究通过定量测定毒力和酶活力,并将结果进行统计分析发现白念菌蛋白酶活力与菌株毒力呈线性正相关(r =0.934),同时由于白念菌菌株普遍能产生蛋白酶,可见胞外蛋白酶是白念菌重要的毒力因子,其在该菌致病过程中起关键的作用。
因而,在某种意义上可用蛋白酶活力来作为反映菌株毒力的直接指标,可避免通常用动物试验测定毒力存在的费时、烦琐、易受干扰等缺点。
有研究表明[6,7],蛋白酶能分解角蛋白和胶原蛋白,使得白念菌能利用此两种氮源从而在皮肤及深部组织中定居、生长,此酶还可协助白念菌粘附于宿主并且对中性粒细胞、淋巴细胞具有趋化活性。
参考文献:[1]S HIM IZU K,KON DO H Y,T AN AK A K.Proteinase p roductionand path egenicity of Candid a albican s .I .Invasion into chorioal-lantoic membrane by C .Albicans s trains of different proteinase activity.[J ]Microbiol Imm unol,1987,31:1045-1060.(下转第220页)进入机体,干扰了体内正常生理功能有关。