Western Blot 实验详解
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵 ①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 ②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后 震荡。
灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余 空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板 流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气 泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草 纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放 于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
WesternBlot实验详解(--)
Western Blot 实验详解、实验材料Western Blot 相关试剂：甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。
4 C 保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水37 C溶解，定容至100ml 。
4C 避光保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。
分装，-20C 保存。
Western BIot 相关仪器：电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
文档收集自网络，仅用于个人学习2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。
25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。
文档收集自网络，仅用于个人学习10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。
（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。
工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
Westernblot实验技术
Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。
贮存液保存于室温。
3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。
4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。
5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。
6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。
WesternBlot过程步骤详解中英文对照
实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）；Whatman 3MM 纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。
2. 实验试剂⑴ 10x转移缓冲溶液（1L）：30.3g Trizma base(0.25M), 144 g甘氨酸(1.92M),加蒸馏水至1L, 此时pH约为8.3，不必调整。
western blot实验实验步骤
western blot实验实验步骤
Western blot实验步骤如下：
收集蛋白样品：使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
SDS-PAGE凝胶配制：参考一些文献资料进行配制。
样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
上样与电泳：将处理后的蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
Western Blot 实验详细介绍
Western Blot 实验详细介绍(一)主要试剂的配制1. 细胞裂解液：根据目的蛋白所处的位置选择恰当的裂解液：（1）胞浆蛋白很容易提取，裂解液中可以不添加任何去污剂；（2）跨膜蛋白由于膜成分的干扰，就需要添加适当的去污剂，例如选取NP-40裂解液或者RIPA缓冲液；（3）与细胞骨架结合的一些蛋白的提取则需要添加如SDS等强去污剂。
（4）核内蛋白的提取可以选择RIPA缓冲液。
注：Trizol提取的方法在实践中也常常采用，但是会对蛋白质的质量有一定影响，所以此种方法慎用。
2. 30 %(w/v)聚丙烯酰胺：取290g丙烯酰胺，10gBIS（甲叉双丙烯酰胺），加600ml 去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将溶液定容至1L，用0.45μm滤器滤去杂质，于棕色瓶中4℃存放。
消化道、呼吸道、皮肤粘膜等多种接触途径，可导致遗传物质损伤和基因突变，具有神经毒性，可致癌。
3. 10%(w/v)SDS：取10g高纯度的SDS，加80ml去离子水，68℃加热溶解，缓慢加入浓盐酸至PH7.2，加蒸馏水至100mL，室温保存。
SDS属于强去污剂。
4. 1.5mMTris-HCL(pH8.8)：取181.7g Tris-base，加800ml去离子水，充分搅拌溶解缓慢加入浓盐酸至PH8.8，让溶液冷却至室温，加蒸馏水至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
5. 0.5mMTris-HCL(pH6.8)：取60.6g Tris-base，加800ml去离子水，充分搅拌溶解缓慢加入浓盐酸至PH6.8，让溶液冷却至室温，加蒸馏水至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
6. 10%(w/v)AP（过硫酸铵）：提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
取1g过硫酸铵，加10ml去离子水后充分溶解，4℃避光保存。
注：最好临用前配制，4℃保存1周。
超过期限会失去催化作用。
对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性。
7. TEMED（四甲基乙二胺）：催化AP形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
(最新整理)westernblot详解
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
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20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
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具体情况依照说明书
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灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓 慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左 右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。 沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形 。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
制作标准曲线 （插入表格）
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
Western Blot实验流程详细介绍
Western Blot实验流程详细介绍蛋白质印迹法（免疫印迹实验）即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性研究和疾病早期诊断等多个方面。
下面是本人在实验过程中总结的一些经验。
一、基本原理Western Blot采用的是聚丙酰胺凝胶电泳，被检测物质是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二、实验试剂及作用SDS-PAGE：浓缩胶成分去离子水，30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/L Tris（pH6.8），10%SDS，10%APS，TEMED。
分离胶成分主要有去离子水，30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/L Tris（pH8.8），10%SDS，10%APS，TEMED。
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂，过硫酸铵（APS）就是引发剂，而TEMED可以催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。
浓缩胶和分离胶PH值不同，前者主要表现为浓缩效用，后者表现为电荷效用和分子筛效用。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，将较稀的样品加在浓缩胶中，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶的pH6.8，在这个pH条件下，缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离，Gly的等电点为6.0，仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢。
酸性蛋白质在此pH下解离为负离子，三类离子的迁移速率为Cl离子、蛋白质和Gly，电泳开始后，Cl离子泳动快，在其后形成低电导区，而电场强度与电导区成反比，形成了一个强电场强度，使所有的负离子都会加速移动，当移到Cl离子区域时，电。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项西方博(Western blot) 是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质样品经过电泳分离并转移到膜上，再使用特异性抗体检测蛋白质的表达水平。
以下是西方博检测蛋白质表达实验的结论和注意事项。
结论：1. 蛋白质的分子量：西方博通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的精确分子量。
根据蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以使用特定的分子量标准品绘制标准曲线，并在曲线上确定待测蛋白质的分子量。
2. 蛋白质的表达水平：西方博使用特异性抗体来检测特定蛋白质的表达水平。
利用特异性抗体与目标蛋白质的特定区域结合，然后使用辅助抗体标记抗体，并通过光学或化学方法检测抗体标记物的表达水平。
比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平可以确定其相对表达量。
注意事项：1. 样品的提取和准备：蛋白质的准备和提取是西方博实验的首要步骤。
样品应该被充分破碎，并使用适当的提取缓冲液来维持蛋白质的稳定性。
注意，使用不同类型的组织或细胞时，提取条件和方法可能有所不同。
2. 蛋白质的电泳分离：西方博通常使用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来进行蛋白质的分离。
凝胶的浓度和隔离电泳条件应选择适当，以分离不同分子量的蛋白质。
3. 转膜：将电泳分离的蛋白质转移到膜上是西方博的关键步骤之一。
选用合适的膜（如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素膜），并选择适当的电泳缓冲液进行转膜。
确保蛋白质能够均匀地转移到膜上。
4. 抗体的选择和试验条件：特异性抗体的选择和充分优化是确保实验准确性的关键因素。
保证抗体的特异性和亲和性，并验证抗体的工作浓度。
此外，充分优化抗体和探针的试验条件，包括反应温度、时间和抗体浓度等。
5. 成像和分析：西方博实验完成后，使用适当的成像方法（如化学发光或荧光成像）检测抗体标记物的表达水平。
使用适当的成像系统记录图像，确保信号处于线性范围内。
使用图像分析软件进行定量分析，比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平。
westernblot详细图解
Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS—PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验.2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）1。
0 ml；10％SDS 6.0 ml；β—巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3。
转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g；Tris 5。
8 g；SDS 0。
37 g；甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。
4。
0。
01 M PBS(pH7。
4)：NaCl 8。
0 g；KCl 0。
2 g；Na2HPO4 1。
44 g；KH2PO4 0。
24 g；加ddH2O至1000 ml.5。
膜染色液：考马斯亮兰0。
2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5％脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1。
WesternBlot实验方法
WesternBlot实验⽅法⼀、溶液配制1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10 ml称取NaF 41.99mg，超纯⽔8ml溶解后定容⾄10ml2.30%聚丙烯酰胺凝胶液（交联度3%）：100ml丙烯酰胺29 gN,N'-甲叉双丙烯酰胺 1 g加去离⼦⽔⾄100 ml 混匀,棕⾊瓶中避光保存3.0.01mol/L ⼄酸钠NaOAc（pH 5.2）（MW=136.08）25ml136.08×0.01×25×10-3=34 mg，称取34 mg⼄酸钠，加⼊20ml蒸馏⽔，待其溶解后，⼄酸调pH值⾄5.2，再定容⾄25ml。
4.1M DTT 10 mlDTT(⼆硫苏糖醇) 1.545g0.01mol/L ⼄酸钠（pH 5.2）8ml溶解后定容⾄10ml，0.22µm滤膜抽滤。
5.4×SDS-PAGE Loading Buffer 10ml0.2M Tris-HCl(pH=6.8) 1M 4 ml8% SDS 10% 0.8 g0.4% 溴酚蓝40 mg40% Glycerol 4 ml三蒸⽔定容⾄10 ml0.4M DTT 临⽤前1M贮存液按400 µl/ ml⽐例加⼊上述溶液中。
6. 1.5M Tris(pH 8.8) 100 mlTris 18.171 g加⼊三蒸⽔80 ml，溶解后加⼊浓HCl调pH值⾄8.8，定容⾄100ml7.1M Tris(pH 6.8) 100 mlTris 12.114 g加⼊三蒸⽔80 ml，溶解后加⼊浓HCl调pH值⾄6.8，定容⾄100ml8.1×电泳缓冲液：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g0.1% SDS 1g三蒸⽔定容⾄1000 ml9.1×Transfer Buffer：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g三蒸⽔定容⾄900 ml使⽤前加⼊甲醇100ml10.PBS Buffer137 mM NaCl 8g2.7 mM KCl 0.2 g10 mM Na2HPO4 1.44 g2 mM KH2PO4 0.24 g三蒸⽔定容⾄1000 ml调节pH值⾄7.4，⾼压灭菌，4℃保存11.PBST Buffer500 ml PBS中加⼊250 µl Tween-20。
Western blot 实验技术
二抗与底物反应显色•辣根过氧 Nhomakorabea物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法
朱珊丽老师的结果
1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4
Fig 1.SDS-PAGE and Western blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein
达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应
转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜 价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
三、免疫染色 1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2．TBS洗膜1-2次，10min/次。 3. 加一抗孵育，37 ℃或室温孵育1h。 4. TBS洗3次，10min/次。 5．加HRP标记的抗体，室温1h 。 6．TBS洗3次，10min/次。 7．NC膜再转入DAB显色液中，避光反应，待显色反应
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
【器材】
转移电泳仪 ，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀， 手套
【试剂】
1．一抗 2．二抗：HRP标记的IgG 抗体 3．转移buffer：Tris 3.03g，Gly14.4g，甲醇200ml，加
WB-Western Blot实验步骤及讲解
概念
通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品 进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在 所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。 因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。
分类
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
蛋白提取步骤
为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白 酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。
1. 于-20℃冰箱取出蛋白裂解液及PMSF等，常温下溶解；BCA测试盒、5×Buffer置冰 上备用；将已高压消毒的匀浆器及弯镊置冰上冷却备用；开启低温离心机调至4℃ 备用、烤箱调至37℃备用。
2. 组织样本于冰上冻融后，称取适量组织（约30-50mg）放入匀浆器中，准确记录所 夹取组织重量。
蛋白提取步骤
5. 上述裂解液于低温离心机内离心，12000rpm×15min，4℃。 6. 离心完成后，小心取出离心管，可见液体分成3层，上层为白色脂肪层，中层为 澄清蛋白质溶液，下层为组织沉淀，用适当量程的移液枪小心吸取中间层蛋白溶 液于1.5mlEP管中，记录所吸取体积（ul）。 注意：宁可少吸不可多吸！
实验步骤
5、一抗孵育 根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体
进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。
建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书， 了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。
实验步骤
6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15 min或4次×10 min 。
选择二抗抗体取决于一抗抗体的种属来源。 例如，如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体，二抗抗 体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克 隆抗体，二抗抗体必须是抗兔的抗体。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
Western-Blot-实验技术
（三） 凝胶 电泳
4.染色
SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色
（四） 转膜
原理：
蛋白因结合SDS 而带电荷，转膜 即在电场作用下 从胶中转至膜上 的过程。
注：下层滤纸必须用新的。
（四） 转膜
方法 仪器 特点
半干转
半干式转膜速度快，适 合与小分子量蛋白 两种方法的转 膜液不同！！
湿 转
湿式成功率高并特别适合用 于分子量大于 100KD的蛋白
分离胶
pH不连续 特点： 凝胶不连续 缓冲液成分不连续
12
蛋白质在进入分离胶以前，先
被浓缩成一条细线，使每个蛋 白的起跑线相同，提高解析度。
（三）凝胶 电泳
2.上样
1.上样前煮沸 样品 2.每孔上样量 为100-150 μg蛋白；根 据目的蛋白的 表达情况的不 同而有所变化。 3.Marker:68ul
Western Blot
（二） 蛋白含量的测定
步骤： 1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一 圈的孔最好不用） 2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A
液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液
240ul） 3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍）， 每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做 三个重复则需要60ul，一般配80ul
Western Blot
（一）蛋白样品制备
• 4、每瓶细胞加 400 μ l 含 PMSF 的裂解液，于冰 上裂解 30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来 回摇动。 • 5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的 一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液 移至 1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进 行。） • 6、于 4℃下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心 机预冷） • 7、 将离心后的上清液分装转移至离心管中放于－ 20℃保存。
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Western Blot实验详解
一、实验材料
Western Blot相关试剂：
2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0。
5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。
25ml 4×Upper buffer; 4。
25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。
4×Upper buffer：60。
6g Trizma Base(氨基丁三醇); 20ml 20%SDS; Add dH2O to 1000ml; 用盐酸调pH 至6。
8。
10×电泳缓冲液（pH 8。
3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30。
2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS(10g)，定容至1L。
（注：SDS在68℃水浴中溶解）。
工作液：1×电泳缓冲液去离子水稀释室温保存。
1。
5M Tris-HCl(pH8。
8)：Tris 181。
7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8。
8，定容至1L 室温保存。
1M Tris-HCl(pH6。
8)：Tris 121。
1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。
5，定容至1L 室温保存。
10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g，1M Tris-HCl(pH7。
5) 100ml，去离子水定容至1L。
工作液：1×TS 室温保存。
1M Tris-HCl(pH7。
5)：Tris 121。
1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。
5，定容至1L 室温保存。
10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。
用10%HCl 调pH至7。
2，定容至100ml。
1×Transfer Buffer：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3。
03g Trisgrams，14。
43g 甘氨酸，最后加入200ml甲醇。
4℃保存。
30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29。
0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1。
0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。
4℃避光保存。
10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。
分装，-20℃保存。
Western Blot相关仪器：
电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作程序与结果判定
操作程序：
（一）蛋白样制备
1.无双抗DMEM（10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h后换含双抗DMEM
（10%血清），再过22h后处理细胞。
2.吸出培养液，用PBS洗1-2次。
3.每个皿（60mm）加入200-300ul细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。
(最好处理完一个样品
后再处理另外的样品，不要同时处理)
4。
用一次性1ml针筒吸出裂解的细胞液，注入1。
5ml离心管中，用针筒吸打至清亮。
5。
取80ul 2×Sample Buffer混匀，37度30min，沸水10min，1200rpm 10min 取上清，冰浴，上样，剩余样品-20度储存。
（二）SDS-PAGE
1.制备分离胶5ml加入组装好的玻璃板中，立即水封。
（一般配10%分离胶）
2.待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶3ml插入梳子，待凝固。
3.胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。
4.用针筒吹净每个孔。
5.上样，通电电泳：浓缩胶电压90V（约30min）分离胶120V（约90min）。
（三）转膜（湿转）
1.海绵，滤纸在转膜液中浸泡，PVDF膜在甲醇中浸泡2min。
2.在玻璃板上铺海绵，五层滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，玻璃
棒赶走气泡，贴上PVDF膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。
将其整体转移到转膜夹上。
3.12V电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。
注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF膜-五层滤纸-海绵-阳极
（四）封膜
1.配制封膜液，在20ml 1×TBST中加入1g脱脂奶粉（一块膜的用量），充分混匀倒入保
鲜盒中。
2.将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。
3.摇床上摇2h。
（五）一抗
把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇4h。
（六）二抗
1.将一抗回收，放入-20度冰箱中。
2.在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。
3.倒掉冲洗液，加入二抗溶液（8ml），摇床2h。
（六）洗膜，显影，定影
1.将二抗回收，放入-20度冰箱中。
在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。
2.将A、B液按1：1配制，在一试管中各加400ul的A液和B液。
注明：ECL A、B液最好选用Pierce公司的Super Signal West Pico，国产可选用碧云天的。
3.在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴ECL混合液，将洗好的膜放上，在膜上
滴ECL混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。
4.关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（压膜必须带手套，且不能有水，
否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓）。
5.将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。
6.用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。
结果判定
四、注意事项
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。
因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗
原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。
2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度,也
将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。
因此，建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合。
灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口罩防护。
梳子插入浓缩胶时，应确
保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内。
4.加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。
5.为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
6.上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
7.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。
8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。
9.取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应
用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
10.转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。