胃癌中多基因甲基化状态及其表达的研究_胡世莲

胃癌组织和癌旁正常组织中甲基化阳性率见表 1 , 胃癌组织中 5 种基因的甲基化阳性率均高于相应的 癌旁正常组织 , 且 Runx3 基因甲基化率在癌组织和 癌旁 正 常 组 织 之 间 的 差 异 有 统 计 学 意 义 ( P < 0 . 05) 。 75 % 的胃癌组织中至少有一种基因发生异 常甲基化 , 显著高于相应的癌旁正常组织 25 % (P < 0 . 05) 。而正常对照的胃黏膜组 织中, 没有 发现任 何一种基因启动子区域存在甲基化改变。本实验采 用 M 和 U 引物扩增甲基化酶 SssI 修饰 ( 甲基化阳性 对照 )和未修饰 ( 非甲基化阳性对照 )的健康人外周 血 DNA 时, 分别只有 M 引物和 U 引物得到预期大小 的扩增片段, 而阴性对照未得到任何产物 (图 1) , 提 示实验技术及所用引物和试剂正确 , 实验结果可信。
证医学中心 )
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(1 . 安徽医科大学附属省立医院、 安徽省立医院 , a 老年医学科 , b 肿瘤内科 合肥 230001; 2. 安徽省委 机关医院 ; 3 . 安徽省 循
[ 摘要 ]
目的
了解胃癌 中 p16、 E cadherin、 R unx3、 DA PK 和 CHFR 基 因启动 子 CpG 岛的甲 基化 状态 , 采用 甲基化 特异 性 PCR ( M SP ) 技术 检测 12
期研究多集中在孤立的单一基因上, 随着更多基因 异常甲基化不断被报道 , 提示胃癌中存在多种基因 甲 基 化 现 象。 因 此, 我 们 同 时 对 基 因 p16 、 E cadherin 、 Runx3 、 DAPK 和 CH FR 在胃癌中的甲基 化状态进行研究 , 以探讨多基因异常甲基化在胃癌 发病机制中的作用。同时采用 RT PCR 方法检测了 上述基因在胃癌中的表达状况 , 以期了解基因甲基 化与其 mRNA 表达的关系。 1 材料与方法 1 . 1 标本来源 收集安徽省立医院普外科、 干部病 房外科手术切除的 12 例经病理确诊的胃癌患者的 肿瘤组织、 相应的癌旁正常组织, 同时收集 12 例胃 镜活检的正常胃组织作为对照组。 12 例胃癌患者 术前均未经放疗和化疗 , 所有组织标本离体后立即 放于液氮罐速冻 , 然后存放于 - 80 冰箱内保存备 用。每例取材包括癌组织和相应的癌旁正常组织各 2 份 , 分别用于 MSP 和 RT PCR 研究。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 基因组 DNA 提取 取 - 80 低温保存的冷 冻组织标本 , 参照美国 OM EGA 公司的 E. Z. N. ATM T issue DNA K it说明书进行组织 DNA 的提取 , 提取 的基因组 DNA 由琼脂糖凝胶电泳鉴定 , 紫外分光光 度计定量后 , 放于 - 20 暂存。 1 . 2 . 2 基因组 DNA 修饰 取 1 g 上述所得 DNA, 按照 DNA 修饰试剂盒说明进行甲基化修饰, 主要步 [ 5] 骤按照 H em an 等 提出的方法, 并加以改进。修饰 后的 DNA 模板放于 - 40 冰箱保存或直接做 PCR。 冰上配制 PCR 1 . 2 . 3 甲基化特异性 PCR( M SP )
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一 , 与其他 恶性肿瘤一样, 其发生发展与多种肿瘤抑癌基因和
基金项目 : 国家自然基金项目 ( 30672383) 作者 简 介 : 胡 世 莲 , 主 任 医 师 , 教 授 , 博 士 生 导 师 , E m ai:l hush ilian@ 126 . co m
并探讨基因异常甲基 化与 mRNA 表达 的关系及 其意义 。 方法
例胃癌患者癌组织及 其相应的癌旁正常组织中 5 种基因的甲 基化状态 , 以 12 例 胃镜活检 的正常胃 组织作为 对照 , 采用 RT PCR 方法相应检测了 5 种基因的 mRNA 表达水平 。 并分析每种基因甲基化程度与表达水平之 间的关系 。 结果 胃 癌 组 织 中 , p16、E cadher in 、R unx3、DA PK 和 CHFR 基 因 的 甲 基 化 率 分 别 为 41. 7% 、 8. 3 %、 58. 3% 、 33. 3% 和 58. 3 % , 相应的癌旁正常组 织中 , p16、 E cadherin、 R unx3、 DA PK 和 CHFR 基 因的甲基 化率分别为 8. 3% 、 0. 0% 、 8 . 3 %、 8. 3% 和 16. 7% , 且 75 % 的胃癌 组织中至 少有一种基 因甲基化 , 显 著高于癌 旁正常组织 25 % ( P < 0. 05), 而健康对 照组织 中无基 因甲基化 , 在 甲基 化的胃 癌组 织中均 无 p16、 E cadher in 和 DA PKmRNA 表达 , 而癌旁正常组织 、 非甲 基化的 癌组织中 均有其 表达 。 结论 生发展 。 [ 关键词 ] 胃肿瘤 ; DNA 甲基化 ; CpG 岛 ; RNA 稳定性 文献标识码 : A DO I : 10. 3969 /J. issn. 1672 6790 . 2011. 01 . 001 中图分类号 : R 735. 2 胃癌 中多基 因启 动子 CpG 岛高甲基化是一个频繁的事件 , 并且基因启动子高甲基化与其 mRNA 表达缺失 有关 ,ion of mu ltip le gene m e thylation and exp ression in gastric carcinoma H U Shi lian* , KON G X iang y ong, SU N Yu bei, SH EN Gan, XU W ei p ing, W U Lei, H UAN G D a bing, JIAN G X iao dong, CH ENG Zhao dong( * D epartm ent of G erontology, A nhui P rovincialH osp ital , H efei 230001, China) [ Abstract] O bjective T o study the pro m ote r hyper m ethylation status o f p16, E cadherin , Runx3, DAPK and CHFR genes in gastr ic carc inom a and its i m pact on the mRNA expression. M ethods M ethylation spec ific po lym erase cha in reaction(M SP) w as used to de tect pro m ote r me thy la tion status o f the p16, E cadherin , Runx3, DAPK and CHFR genes in tum or tissues , co rresponding ad jacent nor m a l tissues and o f 12 patien ts w ith gastric carc ino ma , and nor m al gastr ic b iopsy sa m ples o f 12 healthy peop le w as a lso co llected as contro . l T he mRNA expressions we re investigated by RT PCR. R esu lts N om al gastric canc ino m a has no genes m e thy la tion. The me thy la tion ra tes o f p16, E cadhe rin, R unx3 , DA PK and CHFR w ere 41. 7 % , 8. 3% , 58. 3 % , 33. 3% and 58 . 3% , respective ly , in gastric cancer tissues and 8 . 3 % , 0. 0% , 8. 3% , 8. 3 % and 16. 7% , respectively , in adjacent nor m a l tissues . M ethy lation of one o r m ore o f the genes was found in the tissue o f 75 % g astric cancer , w hich w as sign ifican tly h ighe r than that in adjacent nor m al tissue( 25 % , P < 0. 05). In contrast , no aberrant m ethy lation w as found in no r ma l gastr ic biopsy sa m ples of 12 healthy peop le . N one o f p16, E cadherin and DAPK mRNA w as expressed in a ll the gastr ic cancer tissues w ith gene promo ter hav ing hype r m ethy lation , whereas itw as expressed in ad jacen t nor m a l tissues and gastr ic cancer tissues w ithout hyper m ethy lation. Conc lusion M ultiple g ene m ethy lation is a frequen t event during g astric cance r progress ion , and m ay be a predo m inant cause o f down regulation or loss o f the gene expression. [ K ey words] Stom ach neoplasm s ; DNA me thy la tion ; CpG islands ; RNA stability