第七讲 DNA或蛋白质的化学修饰与基因表达
蛋白质表达与基因的关系从DNA到蛋白质
蛋白质表达与基因的关系从DNA到蛋白质在生物学中，蛋白质表达是一个关键的过程，它负责将基因中的信息转化为蛋白质的产生。
这个过程涉及到DNA的转录和翻译，以及许多其他的调控机制。
本文将探讨蛋白质表达与基因之间的关系，并详细介绍从DNA到蛋白质的过程。
一、DNA的转录蛋白质表达的第一步是DNA的转录。
DNA是一种双螺旋结构的分子，由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳕嘧啶）组成。
通过转录，DNA中的信息被复制到一条称为RNA的分子上。
转录发生在细胞的细胞核中。
在转录开始前，一个称为启动子的DNA序列将信号给转录酶，指示它在何处开始进行复制。
转录酶按照DNA的模板将RNA合成，并遵循一定的配对规律（腺嘌呤与尿嘧啶，胸腺嘧啶与腺嘌呤）。
转录的终止由终止子序列指示，转录酶在这个序列上停止复制。
转录产生的RNA被称为信使RNA（mRNA），它是将基因信息从细胞核带到细胞质的一种分子。
mRNA中的碱基序列以三个为一组的方式编码特定的氨基酸，这些氨基酸将被用于合成蛋白质。
二、RNA的翻译蛋白质表达的下一步是RNA的翻译。
这个过程发生在细胞质的核糖体中，涉及到多种RNA和蛋白质的相互作用。
翻译的开始由起始子序列指示，该序列编码蛋白质的第一个氨基酸——甲硫氨酸。
随后，核糖体沿着mRNA链滑动，并读取每个密码子，将相应的氨基酸加入正在合成的蛋白质链中。
这个过程需要使用转移RNA（tRNA）分子。
tRNA分子具有特定的折叠结构，能够与mRNA上的密码子相配对。
每个tRNA分子携带一种特定的氨基酸，它们通过tRNA合酶与特定的密码子配对。
这样，RNA的翻译将持续下去，直到到达终止子序列。
终止子通知核糖体停止合成蛋白质，完成翻译过程。
三、蛋白质的后续调控在蛋白质合成完成之后，还存在许多后续的调控机制，以确保蛋白质可以正确执行其功能。
首先，蛋白质可能需要经过修饰，如磷酸化、甲基化等，以调节其结构和功能。
这些修饰通常由特定的酶催化。
第七章原核生物的基因调控
第七讲原核生物的基因调控科学家把这个从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。
要了解动、植物发展发育的规律、形态布局特征和生物学功能，就必需弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握了基因表达调控的奥秘，我们手中就有了一把揭示生物学微妙的金钥匙。
基因表达调控主要暗示在以下几个方面：①转录程度上的调控(transcriptional regulation)；②mRNA加工成熟程度上的调控(differential processing of RNAtranscript)；③翻译程度上的调控(differential translation of mRNA).原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。
在真核生物尤其是高等真核生物中，激素程度(hormone level)和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。
二、基因表达调控的底子道理〔一〕基因表达的多级调控基因的布局活化、转录起始、转录后加工及转运、mRNA降解、翻译及翻译后加工及蛋白质降解等均为基因表达调控的控制点。
可见，基因表达调控是在多级程度长进行的复杂事件。
此中转录起始是基因表达的底子控制点。
四个底子的调控点：〔1〕基因布局的活化。
DNA表露碱基后RNA聚合酶才能有效结合。
活化状态的基因暗示为：1.对核酸酶敏感；2.结合有非组蛋白及修饰的组蛋白；3.低甲基化。
〔2〕转录起始。
最有效的调节环节，通过DNA元件与调控蛋白彼此作用来调控基因表达。
〔3〕转录后加工及转运。
RNA编纂、剪接、转运。
〔4〕翻译及翻译后加工。
翻译程度可通过特异的蛋白因子阻断mRNA 翻译翻译后对蛋白的加工、修饰也是底子调控环节。
蛋白质的修饰和表达
蛋白质的化学修饰
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
蛋白质的修饰和表达
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缺失突变
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2．区域性定向突变
基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也 可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称 片段取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性 内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序 列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。
新概念：Gene SOEing:即通过重叠延伸进行剪接
（splicing by overlap extension）,也就是说通过重组延
伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起。
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DNA 片 段 的 剪 切
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取代突变
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插入突变
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研究目的
通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能 之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在 这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用 完全不同的氨基酸序列来置换。 盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突 变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基 因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特 定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。
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③核甘酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件
对于突变引物与模板DNA的比率
解释基因表达的调控机制。
解释基因表达的调控机制。
> 原题：解释基因表达的调控机制基因表达调控是指在细胞中控制基因转录和翻译的过程。
通过调控基因表达，细胞可以根据内外环境的需求来合成所需的蛋白质。
基因表达调控涉及多个环节和分子机制。
一、转录调控1. 转录因子：转录因子是一类可以与DNA结合的蛋白质，它们能够促进或抑制特定基因的转录。
转录因子的结合位点通常位于基因的启动子区域，它们可以通过调控转录复合物的形成来影响RNA聚合酶的结合和启动转录的过程。
2. 染色质修饰：染色质修饰是指对DNA及其相关的蛋白质进行化学修饰，从而改变染色质结构和可访问性。
例如，DNA甲基化可以抑制某些基因的转录，而组蛋白乙酰化则可以促进基因的转录。
二、转录后调控1. RNA剪接：RNA剪接是一种将RNA前体分子中的内含子去除，将外显子连结起来的过程。
通过不同的剪接方式，可以产生不同的mRNA亚型，从而影响蛋白质的翻译。
2. mRNA降解：mRNA降解是指将mRNA分解为较小的碎片，从而停止蛋白质的合成。
通过调控mRNA的稳定性，可以控制基因的表达水平。
三、翻译调控1. 转运调控：通过调控mRNA的转运过程，可以控制mRNA的定位和稳定性。
这种调控方式可以影响基因的表达水平。
2. 蛋白质修饰：蛋白质修饰是指在翻译后对蛋白质进行化学修饰的过程。
蛋白质修饰可以影响蛋白质的功能、稳定性和亚细胞定位。
综上所述，基因表达调控涉及转录调控、转录后调控和翻译调控等多个层面和分子机制。
这些调控机制相互作用，共同影响基因的表达水平和细胞的功能。
对这些调控机制的深入研究，有助于我们更好地理解生物体的发育、生长和适应环境的能力。
蛋白质的修饰和表达
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另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物 形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中 通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片 段重叠拼接起来。
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为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引 物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点 突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖 异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是 反应温度提高10-12度。
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（二）光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外，还具有一个光反应基团。
反应一般分两步进行：第一步，试剂先与 蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性 结合；第二步，光照，试剂被光激活后， 产生一个高度活泼的功能基团，与活性部 位的侧链基团发生反应。
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三、蛋白质的聚乙二醇修饰
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交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在 酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不
溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量 有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3） 吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子
交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交
联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中
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（一）巯基的化学修饰
蛋白质的修饰和表达
（一）巯基的化学修饰
由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。
烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。
其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。
N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。
影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定 的机械强度和稳定性，同时具备在温和条 件下与酶结合的功能基团
2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低 温缓冲液中进行
3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的 其他功能基团副反应尽可能少
4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少 载体的空间位阻对酶活力的影响。
酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋 法、共价结合法去实现。
1、交联法
是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、 酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进 行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来， 形成网络结构的固定化酶。
常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2， 2-二磺酸。
交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在 酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量 有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3） 吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前
最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
（二）氨基的化学修饰
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
分子生物学中的DNA表达与修饰机制
分子生物学中的DNA表达与修饰机制DNA表达与修饰机制是分子生物学的重要研究领域。
DNA包含了生物的遗传信息，对于生物体内的基因表达和调控起着至关重要的作用。
在生物体内，DNA需要进行表达和修饰才能发挥其作用。
DNA表达是指DNA序列基因信息转化为蛋白质的过程。
DNA编码蛋白质的基本原理是三联体密码子与氨基酸之间的对应关系，这也是遗传密码学的基础。
转录是DNA表达的第一步，它是将DNA的信息转录成一条mRNA链。
mRNA是一种单链RNA，它将DNA上的信息编码为蛋白质的氨基酸序列。
在转录过程中，由RNA聚合酶所催化的RNA合成依照DNA的模板链合成。
DNA的双链被酶一起分开，在模板链上一个RNA分子被生物体产生出来。
这个RNA分子通常是从模板链中单向地终止和扩展形成沿这条链的RNA分子。
RNA合成出来后，会参与到翻译过程中。
翻译是将mRNA上的信息翻译成为蛋白质的氨基酸序列的过程。
在翻译过程中，RNA的信息通常以一种3个核苷酸为一个单位的密码子序列形式存在。
这些密码子对应着蛋白质的氨基酸序列，而RNA通过与tRNA结合，指定了蛋白质的氨基酸序列。
由于RNA的信息已经被转录成为mRNA，因此翻译过程可以在细胞的核内或细胞质中进行。
在DNA表达中，还有许多修饰机制。
这些修饰机制可以改变DNA或蛋白质的化学性质，从而影响DNA的表达。
在DNA修饰中，最常见的是甲基化修饰。
甲基化修饰是指在DNA基因组中添加甲基分子的修饰。
甲基化修饰对于生物体某些基因的表达起到了重要的调控作用，如组蛋白修饰和甲基化状态的相互作用就可以改变染色质的结构和稳定性。
此外，组蛋白修饰也是DNA修饰的重要机制之一。
组蛋白是一种蛋白质，它是DNA在细胞核内的主要包装形式。
组蛋白修饰可以改变组蛋白和DNA的相互作用方式，影响DNA的表达。
组蛋白可以进行各种不同的修饰，如甲基化、磷酸化、乙酰化等。
通过这些修饰，组蛋白可以对DNA进行紧密的包装或松散的包装，从而影响DNA的表达。
组蛋白修饰与基因表达的关系
组蛋白修饰与基因表达的关系组蛋白修饰是指将染色体上的蛋白质分子(组蛋白)上添加化学修饰而改变其功能的一种生物化学过程。
组蛋白修饰可以影响染色体的结构和状态，并直接或间接地影响基因表达。
因此，研究组蛋白修饰与基因表达之间的关系对理解生命系统的调节和疾病的发生和治疗具有重要的意义。
组蛋白是由蛋白和DNA组成的染色体的重要组成部分。
组蛋白可以包裹着DNA形成核小体，使得长长的DNA可以在有限的细胞核中紧凑地储存。
组蛋白可以被修饰的位置特别多，包括乙酰化、甲基化、泛素化、丝氨酸/苏氨酸磷酸化等多种修饰方式，这些修饰可以改变染色体结构和组装状态，影响基因的可读性和可调度性。
另外，除了上述化学修饰过程外，还有种独特的组蛋白修饰方式叫做“histone variant”(组蛋白变异体)，它们和常规的组蛋白不同，可以影响基因表达甚至参与组蛋白体系的稳定性。
不同的组蛋白修饰方式对基因表达的影响不同。
一些修饰会促进基因表达，而另一些则会抑制基因表达。
举个例子，乙酰化是一种广泛存在的组蛋白修饰方式，可以使得乙酰化的组蛋白降解，让染色体更容易被转录因子及其他调节因子找到并与其相互作用。
这样一来，基因的可读性被提高，基因的表达会增加。
相反，甲基化则可以促使染色体更为紧密，难以转录因子进入，从而抑制基因表达。
因此，组蛋白乙酰化和甲基化之间的平衡关系对细胞的生命活动和个体的正常发育具有至关重要的影响。
此外，某些组蛋白修饰还可以影响基因表达的选择性表达。
例如，组蛋白的泛素化在基因表达的调节中扮演着重要的角色，它能够形成新的调节因子来调节DNA的表达。
另一方面，一种被称为SAGA调节复合物的蛋白质混合物包含可以通过乙酰化影响基因表达的组蛋白乙酰转移酶，并且可以与基因特定的转录因子相互作用。
这样一来，SAGA调节复合物能够通过乙酰化方式选择性地促进某些基因的表达，抑制某些基因的表达。
总之，组蛋白修饰是一个非常复杂的生物化学过程，是基因表达的调节机制之一。
蛋白质的修饰和表达
蛋白质的修饰和表达蛋白质修饰的化学途径虽然基因重组表达技术的应用对蛋白质结构功能的研究以及蛋白质分子的改造提供了一条非常有效的途径，然而用化学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法，可以弥补正常生物表达体系的不足。
例如，利用化学法和酶法相结合，可以从猪胰岛素制备人胰岛素；通过区段特异性取代制备适合于肿瘤定位的抗体；对用重组方法得到的多肽进行C末端酰化以及制备各种类型的蛋白质嵌合体等。
因此化学法和重组方法的相互补充，使蛋白质工程的实施更有效。
蛋白质工程的化学方法通常是产生半合成的结构，在此结构中造(或化学修饰)的多肽相缔合。
产生这种缔合的方法主要有4种键、形成肽键以及产生非天然型的共价键连接。
一、功能基团的特异性修饰个天然的多肽与一个人非共价缔合、产生二硫在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、琉基和羧基特别容易产生有用的取代。
因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。
至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的o—氨基或。
—羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。
众所周知，很多在临床上重要的肽其(：末端是被酰化的。
但当用重组的方法得到这些产物时，其C末端是自由羧基。
在自然界能进行这种酰化作用的氧化酶体系很难实用化。
寻找一种有效的方法，其能使C末端的谷氨酸和门冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷氨酸和门冬氨酸仍是努力的方向。
1．多位点取代(1)常规的氨基保护氨基可用取代基进行修饰。
常用的取代基有两种：…—butyloxy—carbonyl(Boc)是典型的酸不稳定取代基，而Methanesulphonylethyloxycarbonyl(Msc)是典型的碱不稳定取代基。
这两种基团常用于对氨基进行临时保护，以防止其他反应试剂对氨基的作用。
蛋白质的修饰与表达PPT讲稿
• 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行
改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。
• 分类：
位点特异性突变
基因突变技术
（按特点划分） 随机突变
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1)通过寡核苷酸介导的基因突变
• 位点特异性突变
2)盒式突变或片段取代突变
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⑤dNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体DNA合成的影响
• dNTP纯度要高
dCTP氧化脱氨可以产生微量dUTP，当多核 苷酸中搀入UMP时，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基 化酶可在U的位置切断DNA链，而细胞内的DNA 聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产 率。
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⑥受体细胞对突变体产率的影响
这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导 下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异 性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新， 特别是PCR技术出现后变得更高效。
(1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
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(1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素
伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起。
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DNA 片 段 的 剪 切
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取代突变
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插入突变
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缺失突变
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关于或蛋白质的化学修饰与基因表达课件
二、 蛋白质磷酸化与基因表达
因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1 （methylCpG-binding protein1）结合DNA的能力 成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间 的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。DNA 甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。 随着个体发育，当需要某些基因保持"沉默"时， 它们将迅速被甲基化，若需要恢复转录活性，则 去甲基化。
第二类为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的 酪氨酸残基。 第三类是"双重底物特异性蛋白激酶（dualspecificity protein kinase），既可使丝氨酸 和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷 酸化。
▪ 根据是否有调节物来 分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白
质激酶 （messenger-
2．甲基化抑制基因转录的机制
甲基化导致某些区域DNA构象变化， 从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑 制了转录因子与启动区DNA的结合效率。
对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全
失去转录活性。当这类启动子被增强时，即使不 去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较 高时，录的直接机制 某些转录因子的结合位点内含有CpG序列， 甲基化以后直接影响了蛋白质因子的结合 活性，不能起始基因转录。
II. 甲基化抑制转录的间接机制 CpG甲基化，通过改变染色质的构象或者 通过与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影 响转录因子与DNA的结合。
蛋白质的修饰和表达课件
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2
• 影响化学修饰的主要因素有两方面：
• 1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢 键和静电作用等，基团之间的的空间阻力。
• 2、修饰剂的反应活性。
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3
一、蛋白质侧链的化学修饰
• 在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和 的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基 和羧基特别容易产生有用的取代。
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• （一）亲和标记
• 亲和标记是一类位点专一性的化学修饰，试剂可 以专一性标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的 失活，因此又称为专一性的不可逆抑制作用。
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17Βιβλιοθήκη • 这类抑制剂可分为两类：
• 一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底物的结构 设计的，它具有和底物结构相似的结合集团，同 时还具有和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应 的活性基团。
基也可与该试剂发生反应。
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• 5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引 起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧化。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
• 专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基 团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部 位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部 位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被 作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专 一性。这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂也被称 为位点专一性抑制剂。
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• （二）光亲和标记
• 这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的特点外， 还具有一个光反应基团。
蛋白质的修饰和表达
Phage display method 2
Phage display method 2: contd.
核糖体展示技术和mRNA展示技术在体外无 细胞翻译体系中进行,用mRNA的可复制性, 使靶基因得到有效富集,不受细胞转化效率 的限制.大大提高了筛选通量.
二、基因融合和基因剪接
基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码 子删除,再接上带有终止密码子的第二个蛋 白质或多肽基因,即可实现两个基因的融合 表达.
因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止 一次,如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时,正常情况下 所有相关的氨基酸侧链都要被取代.至于谈到氨基和羧基基 团,尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别,但在化学上 很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基 相区别.
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的.
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂,是根据酶 催化过程设计的.这类抑制剂具有和底物类 似的结构,具有被酶催化和结合的性质.此外 还有一个潜伏反应基团,在酶对它进行催化 反应时,这个潜伏基团被酶催化而活化,对活 性部位起不可逆抑制作用.这类抑制剂的专 一性很高,被称为自杀性底物.
二光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外,还具有一个光反应基团.
一亲和标记
亲和标记是一类位点专一性的化学修饰,试 剂可以专一性标记于酶的活性部位上,使酶 不可逆的失活,因此又称为专一性的不可逆 抑制作用.
这类抑制剂可分为两类：
一类是Ks型的不可逆抑制剂,它是根据底物 的结构设计的,它具有和底物结构相似的结 合集团,同时还具有和活性部位氨基酸残基 的侧链基团反应的活性基团.
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二、 蛋白质磷酸化与基因表达 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把 磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的 过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式， 在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。
已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质 激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的 磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位 的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程， 其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质 脱磷酸化。
由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以，高等 真核生物中CG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组 中约存在4万个CG islands，大多位于转录单元的5„区。 没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就可能被氧 化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。 已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用, 它就变为T, 无法 被区分。因此, CpG序列极易丢失。
8. 蛋白磷酸酯酶 Ser/Thr蛋白磷酸酯酶主要包括：PP-1，PP-2A， PP-2B和PP-2C四类。 PP-1是糖代谢中的一个关键酶，具有很高的活性， 其催化亚基为38kDa，可以与其它组分或调节亚 基组成全酶。PP-2A全酶包括一个36kDa的催化 亚基和一个65kDa的调节亚基。PP-2B是目前所 发现的唯一受Ca和CaM调节的蛋白磷酸酶,催化 了磷酸化酶激酶α亚基的脱磷酸化作用。由61kDa 的A亚基和16kDa的B亚基组成。A为催化亚基。 PP-2C的分子量为43-48kDa，其活性需要mmol/L 水平的Mg2+，现对其参与调节的生理过程知之甚 少。
2. 真核细胞主要跨膜信号转导途径
3. 蛋白激酶的种类与功能 根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的 种类可分为三大类： 第一类为丝氨酸/苏氨酸型。这类蛋白激酶 使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸 化 第二类为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的 酪氨酸残基。 第三类是"双重底物特异性蛋白激酶（dualspecificity protein kinase），既可使丝氨酸 和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷 酸化。
没有Cyclin，CDK无活性。 Cyclin的合成和积累。 形成Cyclin和CDK复合物。Tyr磷酸化阻碍了ATP 的结合，CDK仍然无活性。 T-环中的Thr被磷酸化，Tyr上的磷酸基团被去掉， CDK活性大为增强。 CDK使磷酸酯酶磷酸化，进一步提高其活性。 CDK使DBRP磷酸化，具有酶活性。 在DBRP的帮助下，泛素连接酶把泛素加到Cyclin 上。 Cyclin被降解，CDK失活。 见Lehninger, figure 13-33。
CDK通过蛋白质磷酸化过程控制细胞分裂。 没有被磷酸化的PRb能与转录因子E2F相结 合并使后者不能激活一系列与DNA合成有 关的酶，导致细胞无法由G1进入S。 erbB原癌基因其实编码了一个突变的EGF 受体蛋白，它的胞内激酶活性区被永久性 激活（相当于EGF到正常EGF受体上）。 因此，erbB导致了细胞的永久型分裂。
6. CaM激酶及MAP激酶 Ca2+的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶 （CaM-kinase）来实现，它们也是一类丝氨酸/苏 氨酸激酶，但仅应答于细胞内Ca2+水平。MAP激 酶（mitogen-activated proteinkinase, MAPkinase，又称为extracellular-signal-regulated kinase，ERKS）活性受许多外源 细胞生长、分 化因子的诱导，也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白 受体系统的调控。MAP-激酶的活性取决于该蛋白 中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基是 否都被磷酸化。科学家把能同时催化这两个氨基 酸残基磷酸化的酶称为MAP-激酶-激酶，它的反 应底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被 MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同时 被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，从 而在信息传导中发挥功能。
跨膜结构区：是连接受体细胞内、外两部分，镶 嵌在细胞膜中的结构，在靠近膜内侧C端常常是 由碱性氨基酸形成簇状结构。胞内活性区：保守 性较高，由三个不同的部分组成。与跨膜区相连 的近膜区包括41-50个氨基酸，可能是RPTK活性 的功能的调节部位。第二部分为活性位点所在的 催化区，其氨基酸组成具有很高的保守性。该区 含有ATP结合位点和底物结合位点，可能是不同 类型RPTK底物特异性的决定区域。第三部分是 多变的C末端，包括70-200个氨基酸，主要是由 小分子量氨基酸组成的亲水性结构，具有高度的 可塑性。
酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP） 主要有:胞内型，跨膜受体型。 两类PTP的共同点是它们 的 催化域中氨基酸顺序极为相 似，共有240个氨基酸，内含 -HCXGXXR（S/T）G-的 "signature motif"。胞内型 PTP只有一个催化域。受体 型中常有两个催化区，其不 同类型的胞外结构往往不同。 PTP1B（胞内型）是一个 37kDa的胞内酶，在氨基酸 水平上与CD45（跨膜受体型） 的胞内部分有很高的同源 性。 CD45是一类在结构上 相关的，高分子量（150280kD）跨膜蛋白，具有与 受体极为相似的结构特点， 在免疫T细胞和B细胞中含量 极高。
5. C激酶与PIP2、IP3和DAG 磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4， 5-二磷酸（PIP2）的两个酶解 产物：肌醇1，4， 5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。C激酶 （PKC）是依赖于Ca2+的蛋白质激酶。由于IP3 所引起的细胞质Ca2+浓度升高，导致C激酶从胞 质转运到靠原生质膜内侧处，并被DAG和Ca2+的 双重影响所激活。 C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，原因是 后者大大提高了C激酶对于Ca2+的亲和力，从而 使得C激酶能被生理水平的Ca2+离子所活化。C 激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具 有一个催化结构域和一个调节结域。
第八讲 DNA或蛋白质的化学修 饰与基因表达
一、 DNA甲基化与基因表达 二、 蛋白质磷酸化与基因表达 三、 基因重排的分子机制
一、 DNA甲基化与基因表达 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， 可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化 能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导 了基因的重新活化和表达。 1．DNA甲基化的主要形式 5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基 鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要 出现在CpG和CpXpG中，原核生物中 CCA/TGG和GATC也常被甲基化。
C亚基具有催化活性，R亚基具有调节功能， 有两个cAMP结合位点。R亚基对C亚基具 有抑制作用，所以，R和C聚合后的全酶 （R2C2）无催化活性。R亚基与cAMP的结 合导致C亚基解离并表现出催化活性。 激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合， 诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶，再 将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶 激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷 酸化，进入糖酵解并提供ATP。
真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一 种被称为日常型（mainte-nance）甲基转移酶， 另一种是 从头合成（denovo synthesis）甲基转 移酶。前者主要在甲基化母链（模板链）指导下 使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶 相对应的胞嘧啶甲基化。日常型甲基转移酶常常 与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活 性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而I类和III类 都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又 能降解外源无甲基化DNA。
具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体 结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连 接这两个区域的跨膜结构。胞外配体结合区：RPTK的N 端大约500-850个氨基酸组成亲水性胞外配体结合区域， 氨基酸序列变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结 合的结构基础。
2．甲基化抑制基因转录的机制 甲基化导致某些区域DNA构象变化， 从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑 制了转录因子与启动区DNA的结合效率。
对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全 失去转录活性。当这类启动子被增强时，即使不 去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较 高时，即使增强后的启动子仍无转录活性。 因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1 （methylCpG-binding protein1）结合DNA的能力 成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间 的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。DNA 甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。 随着个体发育，当需要某些基因保持"沉默"时， 它们将迅速被甲基化，若需要恢复转录活性，则 去甲基化。
根据是否有调节物来 分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白 质激酶 （messengerdependent protein kinase），包括胞内 第二信使或调节因子 依赖性蛋白激酶及激 素（生长因子）依赖 性激酶两个亚类； 非信使依赖型蛋 白激酶。
4. 受cAMP调控的A激酶 被A激酶磷酸化的蛋白质其N端上游往 往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特异 氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改 变了这一蛋白的酶活性。这一酶活性代表 了绝大多数细胞中cAMP所引起的全部反应。 PKA全酶由4个亚基组成(R2C2）包括两个 相同的调节亚基（R）和两个相同的催化亚 基（C）。全酶的分子量为150-170kD。
1． 蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用 (1). 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与 信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使， 如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacyl glycerol）等，这种共价修饰调节方式显然比变构 调节较少受胞内代谢产物的影响。 (2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的 酶“活性”。与酶的重新合成及分解相比，这种方 式能对外界刺激做出更迅速的反应。 (3).对外界信号具有级联放大作用； (4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信 号的持续反应。 被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化。