血管紧张素转换酶基因插入_缺失多态性检测方法的研究

作者单位:200025上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所·基础研究·血管紧张素转换酶基因插入/缺失多态性检测方法的研究王谷亮　韩战营　朱鼎良　詹一鸣　张伟忠　周怀发　茅守玉【摘要】　目的　采用三条引物法进行血管紧张素转换酶(ACE)基因分型检测,并与Rigat法进行比较,以探讨Rigat造成DD型分型的错判率,并用此方法检测了中国汉族人群中ACE基因I/D基因型的分布频率以及插入(I)/缺失(D)多态性与高血压病(EH)间的相关性。

方法　EH患者(EH组)206例,用上述两种方法进行ACE基因分型;正常血压组(NT组)156例以及核心家系25个共118例,三条引物法进行ACE基因分型。

结果　E H组Rigat法得出的DD型比例较三条引物法高。

与三条引物法相比较,Rigat法对DD型的错判率为13.04%。

用三条引物法进行基因分型的结果如下:(1)在NT组, ACE各基因型的分布频率为:II型0.51,ID型0.41,DD型0.08。

等位基因频率为:I0.71,D0.29。

(2)25个EH家系所有成员的基因分型结果,完全符合孟德尔遗传规律。

(3)E H与NT两组间基因型和等位基因频率无显著性差异。

结论　三条引物法1次完成ACE基因分型,有良好的特异性、准确性和重复性。

【关键词】　肽基二肽酶A;　基因;　高血压Typing of hum an ACE gene I/D po lymorphism:comparison of Rigat metho d to triple primer method　WA NG G uliang,H AN Zhanying,ZH U Dingliang,et al.Ruijing Ho spital,Shanghai Second M edical University, Shanghai Institute of Hypertension,Shanghai200025,China【Abstract】　Objective　There is insertion/deletion(I/D)polymorphism in human angiotensin I-converting enzyme(ACE)gene.The standard method developed by Rigat might sometimes mistype ID heterozygotes as DD homozygotes.The purp ose of this study was to determine the mistyping rate of DD genotype b y Rigat method compared with triple primer method,the distribution of ACE genotypes in Chinese,and the association of the ACE gene I/D polymorphis m with essential hypertension.Methods　206patients with essential hypertension were genotyped by both Rigat method and triple primer method,156normotensive subjects and25nuclear families including118individuals were genotyped by triple primer method only.Results　1.The freq uencies of DD genotype and D allele detected by Rigat method in206essential hypertensives were higher than that detected by triple primer method.When23DD individuals genotyped by Rigat method were retyped using triple primer method,3of them(13.04%)were retyped as ID.2.The frequencies of II,ID and DD genotypes in156 normotensives were51%,41%and8%,respectively.The frequencies of I and D alleles were71%and29%, respectively.3.In25nuclear families,the ACE I/D polymorphism detected were well-accordant with Mendelian inheritance.4.There was no significant difference in frequencies of both genotypes and alleles between hypertensive group and normotensive group.Conclusion　Triple primer method could be specifically and accurately used to detect the ACE I/D polymorphis m.【Key words】　Peptidyl-Dipeptidase A;　Gene;　Hypertension 人血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)基因存在插入(I)/缺失(D)多态性,即在第16内含子存在或缺失由287个碱基组成的Alu 片段。

人群中ACE基因存在三种基因型:II纯合型、ID杂合型和DD纯合型[1]。

ACE基因型的检测方法很多,国内至今仍广泛应用Rigat于1992年创建的方法(Rigat法)[2]。

由于该方法将部分ID型错定为DD型[3,4],在国外已经被改进方法取代,但国内至今对此问题仍未广泛重视。

我国报道的人群ACE基因DD型频率偏高,就可能与使用此方法有关。

那么,Rigat法造成我国人群DD型的错判率是多少?国人ACE基因I/D基因型频率分布的真实情况又如何?ACE三种基因型在正常人与高血压病(E H )患者中的分布究竟有无差异?为此,本研究采用国外目前最常用的三条引物法对上述问题作出回答[5,6],以期引起国内同行的高度重视。

资料与方法 一、研究对象1.E H 组:上海瑞金医院高血压科住院患者206例,男性163例,女性43例,年龄35～84(54.01±13.13)岁,收缩压(175.82±27.2)mm Hg (1mm Hg =0.133kPa ),舒张压(109.85±15.3)mm Hg 。

均为汉族,居住在上海地区。

E H 诊断参照1999年中国高血压防治指南规定的诊断标准,即收缩压≥140mm Hg 和(或)舒张压≥90mm Hg 。

对象间无血缘关系,且排除继发性高血压。

2.正常血压组(NT 组):156例,来自健康体检人群。

男性73例,女性83例,年龄39-62(49.14±4.34)岁,收缩压(112.94±11.7)mm Hg ,舒张压(75.60±8.24)mm Hg 。

对象间无血缘关系。

3.核心家系:25个,共计118例,男57例,女61例,年龄33～81(53.52±14.63)岁。

父母双全且至少有2个子女。

二、实验方法1.DNA 抽提:抽取外周静脉血4ml ,EDTA 抗凝,红细胞清洗液2ml 洗涤、离心3次,取沉淀,再加白细胞裂解液2ml 、蛋白酶K 18μg ,37℃水浴4h ,加酚、氯仿、乙醇提取白细胞基因组DNA 。

2.ACE 基因分型:(1)Rigat 法[2]:PCR 法扩增ACE 基因第16内含子多态性位点所在的目的片段。

引物1:5′-CTGGAGACCACTCCC ATCCTTTCT -3′,引物2:5′-GATGTGGCC ATCAC ATTC GTCAGAT -3′。

PCR 反应体系:总体积50μl ,模板DNA 100ng ,引物1、2各10pmol /L ,3.0mmol /L Mg 2+,50mmol /L KCl ,10mmol /L Tris -HCl (pH 8.4),0.5mmol /L dNTPs 和1U Taq DNA 聚合酶(上海生工)。

PCR 反应在PE480热循环仪上进行。

反应条件为:94℃变性1min ,58℃退火1min ,72℃延伸1min ,共30个循环。

扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳100V 30min ,溴乙锭染色,紫外光下观察结果,拍照记录。

(2)三条引物法:引物序列参照参考文献[5],引物1:5′-CATCCTTTCTCCC ATTTCTC -3′,引物2:5′-TGGGATTACAGGCGTGATAC AG -3′,引物3:5′-ACTTCAGAGCTGGAATAAAATT -3′(上海生工合成),引物2是插入片段的特异扩增引物。

PCR 反应体系:总体积50μl ,模板DAN 100ng ,引物1、2、3各加15pmol /L ,3mmol /L Mg 2+,50mmol /L KCl ,10mmol /L Tris -HCl (pH 8.4),0.5mmol /L dNTPs ,Taq DNA 聚合酶1U 。

反应条件:94℃预变性3min ,94℃1min ,55℃1min ,35个循环。

扩增产物在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,150V 60min ,溴乙锭染色,紫外光下观察结果,拍照记录。

三、统计学分析各组频数间比较用χ2检验,P <0.05为统计学上有显著性差异。

结果 1.EH 组ACE 基因两种方法分型结果的比较(表1):E H 组206例患者,分别用Rigat 法和三条引物法进行ACE 基因型检测。

两种方法分型结果均符合Hardy -Weinberg 平衡。

两种方法对II 型的分型结果完全一致;但用Rigat 法得出的3例DD 型,用三条引物法测定为ID 型(表1,图1、2)。

以三条引物法为标准,Rigat 法对DD 型的错判率为13.04%。

表1　EH 组ACE 基因I /D 多态性测定的两种方法比较方法基因型II ID DD 等位基因I D Rigat 法0.430.460.110.660.34(n =206)(89)(94)(23)(272)(140)三条引物法0.430.470.100.670.33(n =206)(89)(97)(20)(275)(137) 注:括号内为例次注:I 、D 等位基因的扩增产物分别为490bp ,190bp 。