细胞工程3

结果与讨论

不同浓度的R-6G处理对草木樨状黄芪原生原生质体 培养24小时后, 几乎全部死亡。因此选择UV处理 3 分钟和 5 分钟的霸王原生质体作为融合亲本,未经紫 外线照射的原生质体为对照, 共设2 个组合。此外还 发现, 经 UV 照射的霸王原生质体与对照相比, 细胞 聚集现象较少, 且分裂较晚。培养24小时后对照细 胞已经变大, 一部分成为椭圆形, 2-3 天发生了第 1 次分裂, 而紫外线照射后的原生质体细胞变形现象 却发生得较晚, 一般约在第 3 天, 第 1 次分裂也延迟 到第 9 天。
研究内容
本研究通过不对称原生质体融合技术建立了
2 种植物科间体细胞杂交的实验体系, 探索将 沙漠植物引入离体遗传操作的新途径, 以期为 开发利用沙漠植物遗传资源提供理论依、收集纯化及活力检测
亲本原生质体的预处理 原生质体诱导融合

将预处理后的双亲原生质体以大约 1:1 的比例, 混合悬浮于 Ca(NO3)2洗液中, 然后将混合液滴加到直径为 6 cm 的培养 皿中, 静置 20 分钟。将聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 融合诱导液(Xia and Chen,1996)一对一地滴在原生质体混合 液滴上, 静置 5 分钟, 然后加入两倍体积的Ca(NO3)2洗液, 在室温下静置 30 分钟, 使原生质体贴到培养皿底部。然后将 洗液吸去, 用DPD液体培养基洗涤3次, 每次间隔10分钟。最 后加入DPD培养液, 用parafilm膜封口, 25°C暗培养直至形 成杂种小愈伤组织。实验同时采用下列组合作为对照: (1)未 经 R-6G处理的草木樨状黄芪原生质体单独培养; (2)未经紫 外线照射处理的霸王原生质体单独培养; (3)经过紫外线照射 处理的草木樨状黄芪原生质体培养; (4)经过 R-6G 处理的霸 王原生质体培养; (5)未经诱导融合处理的双亲原生质体混合 培养。融合物与对照皆用 D P D培养液进行液体浅层培养

杂种融合细胞的鉴别和筛选 用上述Ca(NO3)2洗液将异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate, FITC)配制成1 mg.mL- 1的母液, 使用浓度为 20 µg.mL- 1。在诱导融合之前标记霸王原生质 体10分钟。在Leica荧光显微镜下, 霸王原生质体细胞质呈绿 色, 草木樨状黄芪原生质体中含叶绿体,细胞质呈红色, 异核 体同时显示两种荧光而被鉴别。此外, 适当浓度 R-6G 处理 的草木樨状黄芪原生质体,细胞质失活而不能分裂。适当剂量 紫外线(UV-B)处理的霸王原生质体, 因 DNA 受损伤也失去分 裂能力。只有异源融合细胞由于生理互补效应, 可以恢复活 力并持续分裂。根据这一筛选体系, 可淘汰两亲本的原生质 体及同源融合产物, 筛选出杂种细胞。
草木樨状黄芪和木本霸王的科间 体细胞杂交
摘要

在成功培养原生质体的基础上, 用改进的PEG-高pH高钙法诱 导草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides)和木本霸王 (Zygophyllum xanthoxylum)原生质体融合, 得到了科间体细 胞杂种融合细胞。采用罗丹明-6G预处理草木樨状黄芪原生 质体以及UV-B辐照霸王原生质体, 使双亲原生质体及其同源 融合产物均不能持续分裂而死亡, 融合后的杂种细胞由于生 理互补可恢复持续分裂能力而被筛选出来。融合产物经培养 分裂获得了2个杂种细胞系, 其中1个分化出芽。染色体计数 和分子鉴定证明了杂种的真实性。初步比较了杂种细胞系及 亲本对盐分和水分胁迫的耐受性, 结果表明杂种细胞系对盐 分和水分胁迫的耐受性介于两个亲本之间。
融合原生质体细胞的分裂

在初始培养的1-2天, 原生质体异源融合细胞的细胞质中叶绿 体还未均匀分布, 异核体较易识别(图 1A)。在荧光显微镜下 观察, 可见绿色的霸王原生质体与红色的草木樨状黄芪原生 质体粘连(图 1B)。经过融合处理并培养 1 天后, 原生质体粘 连界限消失, 形成融合原生质体。单独培养的亲本原生质体 及混合培养的双亲原生质体在 2-3 天开始分裂, 并在 1个月 后形成小愈伤组织。而融合细胞培养 9 天之后才出现第 1次 分裂, 以后的细胞分裂也比较缓慢, 且分裂频率很低, 多数融 合培养物进行了 1 次或少数几次分裂后就不再分裂。经 UV 照射 3 分钟的霸王原生质体与经 R-6G 处理的草木樨状黄芪 原生质体融合产物(图 1C)培养 2 个月后, 出现了 2 块直径为 1.5- 2 mm 的结构致密的小愈伤组织, 分别编号为 1# 和 2#。