TUNEL法原位检测肿瘤组织细胞凋亡的改进
TUNEL法检测体外培养细胞凋亡的体会
的
处理和
的显色时间上应严格掌握。在加入
后最
好在显微镜下观察显色情况并及时终止。整个过程应谨防
干片。
培养细胞涂片和盖片培养细胞的
检测，各有优
缺点：!涂片染色的程序较容易，而盖片易在染色过程中被 夹碎，而且不容易识别细胞面和非细胞面。为易于识别其细
胞面，可在盖片边角处做缺口标记，并用特定粘合剂将盖片
细胞面朝上贴于载玻片上；但实验过程的多次洗涤会使盖片
引证文献(3条)
1.蔡军.辛梅珍.姜叙诚.赵雁飞 As2O3诱导胃癌细胞凋亡及细胞骨架改变病理学观察[期刊论文]-临床与实验病理学
杂志 2003(4)
2.张俐.于波.林建华 中药片仔癀胶囊对骨肉瘤U-2OS细胞诱导凋亡的作用[期刊论文]-中国骨伤 2009(4)
3.刘伍梅 PRRSV感染Marc-145细胞的病毒形态发生学、细胞超微结构变化及细胞凋亡的研究[学位论文]硕士 2005
细胞（盖片培养细胞）和
细胞涂片（培养细胞
涂片）进行了
染色效果的比较。
材料和方法
材料 原位细胞死亡检测试剂盒， 为
公司产品。 ：日本产品，由中国医学科学院肿
瘤研究所程 书 钧 院 士 惠 赠，实 验 时 由 培 养 液 配 制 成 相 应 浓
度。
人肝癌细胞由中国医学科学院血液学研究所
提供。
为
产 品，新 生 牛 血 清 购 自 中 国 医 学
常用涂片法，贴壁生长的细胞常用盖片法，必要时可以两者
结合应用。
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TUNEL法和AnnexinV__省略_析法检测成纤维细胞凋亡的对比研究_佟俊杰
［关键词］ 成纤维细胞凋亡； 流式细胞术； TUNEL
［中图分类号］ Ｒ349． 53 ［文献标识码］ A DOI:10.13591/ki.kqyx.2014.s1.003
［文章编号］ 1003-9872（ 2014） S1-0012-04
Comparative study on TUNEL and Annexin v-FITC in detecting fibroblast apoptosis
·12·
口腔医学 2014 年 第 34 卷 增刊 1
TUNEL 法和 Annexin V － FITC 流式细胞分析法 检测成纤维细胞凋亡的对比研究
佟俊杰1 ，苗 清2 ，王志国3 ，徐全臣1
［摘要］ 目的 通过 AnnexinV － Fitc 流式细胞分析法和 TUNEL 法检测凋亡，比较两种方法的优缺点。方法 以成纤维细胞
色质呈特异的棕黄色着染，而正常细胞的胞核不着染。流式细胞仪实验结果显示，实验组的 G0 / G1 期的细胞比例明显增多，
相对应的 S 期细胞比例明显减少，而在 G2 / M 期较对照组却出现了明显的变化，6、12h 组 DNA 含量分别为 352． 0 ± 1． 0、301． 1
± 1． 1，较未加力组 255． 2 ± 1． 7 有显著延长，而 24 h 加力组 DNA 含量 303． 4 ± 10． 6 与 6 h 组比较细胞周期却出现了缩短。结 论 AnnexinV － Fitc 流式细胞分析法特异性高，TUNEL 法灵敏度高，两法和 Annexin V － FITC 流式细胞分析法检测成纤维细胞凋亡的对比研究
·13·
变形，从而使附底生长的细胞受机械牵张。以成纤 维细胞（ l929） 为对象构建成纤维细胞体外培养 － 力 学刺激模型。 1． 2． 2 细胞的传代培养 用含胎牛血清的 ＲPMI － 1640 培养液（ 体积分数为 10% ） 调整细胞密度，置 于 37 ℃ 、体积分数为 5% 的 CO2 培养箱中，传代培 养，每 2 ～ 3 d 更换培养液 1 次，取第 3 ～ 5 代细胞用 于实验。调整细胞密度为 1 × 105 个 / cm2 ，转移至 BioFlex 柔性 6 孔细胞培养皿内继续培养，24 h 后第 1 次换液，待细胞长至 75% ～ 80% 融合时，更换无血 清培养液使细胞同步化，12 h 后开始加力。细胞所 受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸应变率（ % ） 表示，加力组细胞的力值定为 12% ，频率为 10 个循 环 / min，每一循环包括 3 s 收缩 /3 s 舒张。 1． 2． 3 分组 分为正常对照组、加力 6 h，12 h，24 h 组。分别对待测细胞加载 6、12、24 h 的牵张力和 压缩力。 1． 2． 4 TUNEL 原位细胞凋亡检测 刺激细胞凋亡 后，PBS 洗涤 1 次，用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 ～ 60 min，PBS 洗涤 1 次，加入含 0． 1% Triton X － 100 的 PBS 冰浴孵育 2 min，PBS 洗涤 1 次。在用甲醇配制 的 0． 3% 过氧化氢溶液（ 0． 3% H2 O2 in Methanol） 中 室温孵育 20 min，用 PBS 洗涤 3 次。在样品上加 50 μL 生物素标记液，37 ℃ 孵育 60 min。注意： 孵育时 需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以 尽量减少生物素标记液的蒸发。用 PBS 洗涤 1 次， 滴加 0． 1 ～ 0． 3 mL 标记反应终止液，室温孵育 10 min。用 PBS 洗涤 3 次。在样品上加 50 μL Strepta-
TUNEL法检测细胞凋亡
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
■1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。
tunel法检测细胞凋亡实验步骤
tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。
其中一种常用的方法是使用tunel法。
本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。
实验步骤如下：1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。
将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。
在进行实验之前，需要根据实验设计的需要处理细胞。
例如，可以给予细胞不同的处理，如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。
2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。
常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。
将缓冲液加入培养皿中，使细胞完全覆盖，并在室温下固定15分钟。
3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。
洗涤的目的是去除固定液中的残留物质，以减少后续步骤中的非特异性背景。
4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解，使细胞透膜。
将适量的酶加入细胞中，根据实验的需要，可以调整酶的浓度和作用时间。
一般来说，酶的浓度为20μg/ml，作用时间为30分钟。
5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。
tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP，可以与DNA断裂的末端结合。
按照试剂盒说明书的要求，将tunel试剂加入细胞中，与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。
反应时间一般为1-2小时。
6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。
然后，可以选择使用荧光染料（如DAPI）染色，以标记细胞核。
将染色液加入细胞中，孵育15分钟后再次用PBS洗涤。
7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上，并使用合适的显微镜观察细胞。
可以调整显微镜的放大倍数和焦距，以获得清晰的图像。
TUNEL法原位检测凋亡细胞的某些改进
TUNEL法原位检测凋亡细胞的某些改进第22卷第3期2001年7月武汉大学学报(医学版)/’Sed/ealJoumalofW诅nUrd*~ersityV ol22.No3Jtt[y.2001TUNEL法原位检测凋亡细胞的某些改进王乔曾庆云丁成萦徐明口宗文刘维新武汉大学医学院人体解剖学教研室,武汉430071摘要目的:探索避免TUNEL法检测凋亡细胞出现的假阳性和消除非特异性反应的方法.方法:脑和心肌组织石蜡切片.改进的’nJNEt染色选用多聚甲醛固定,蛋白酶K修复抗原,将H封闭内源性过氧化物酶放在反应液标记DNA片段之后,先后用小牛血清或羊血清两次封闭非特异性反应.结果:证实本实验方法避免了假阳性.背底十分清亮.结论:改进后的1”UNEL方法适用于凋亡细胞的检测.主厦词细胞凋亡;免疫组织化学:方法中固分类号R3613细胞凋亡(Apoptosis)是因生理性或病理性刺激引起的一种受基因调控的自身程序性细胞死亡.细胞凋亡不仅在生物体发育过程中与细胞增殖,分化保持动态平衡以维持机体结构和功能的正常,而且细胞凋亡的异常可能是艾滋病,老年性痴呆等神经退变性疾病,缺血性损伤,肿瘤和自身免疫性疾病的重要发病机制.因此,细胞凋亡检测技术可广泛应用于实验研究和临床检验,目前正倍受关注.近年来,我们应用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的核苷酸(dtrre)缺口末端标记法(TUNEL)对缺血再灌注损伤的脑组织和心肌组织的细胞凋亡进行了研究,并且在TUNEL染色过程中如何避免假阳性,消除非特异性反应,降低背底颜色等方面进行了探索和改进,获得了满意的实验结果,现报道如下.阻断内源性过氧化物酶,室温,10min.0.01mol/LPBS(pH7.4)洗5minx3次.切片滴加20%羊血清,3%dx牛血清白蛋白及1%封阻剂,37℃,15min,再次封闭非特异性反应.切片滴加1:2稀释的POD(HRP连结的抗荧光素抗体)20l,置湿盒内.37,30min进行免疫反应,扩大信号.0.Olrnol/LPBS(pH74)洗5rainx3次.镜控下,DAB.O2显色.胞核呈深棕色即用自来水流水冲洗终断反应.苏木精复染.梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片.1.3实验切片分组I组:按本实验改进的方法进行TUNEL染色.lI组:染色方法同I组.但只用小牛血清一次封闭非特异性反应.III组:按实验试剂盒常规方法进行染色.1材料和方法2结果1.1实验材料SD大鼠缺血30min再灌48h的脑组织或缺血30min再灌注2h的心肌组织.4%多聚甲醛灌注(脑)固定或浸泡(心肌)固定.常规石蜡包埋,切片.1.2TUNEL染色参考宝灵曼公司的细胞凋亡检测药盒并按本实验改进的方法操作.切片脱蜡入水,切片滴加蛋白酶K(20g/m1),37℃,15min,修复抗原.O.01mot/LeBs(pH7.4)洗3mlnx3次.滴加20%小牛血清和3%小牛血清白蛋白,37℃,l5n.封闭非特异性反应.滴加反应液加l(咐r2l,荧光素连接的核苷酸混合缓冲液l81)置湿盒内,37 ℃,lh.对照片不加.0.01mol/LPBS(DH7.4)洗5mJnx3次.在DNA片段标记后,用0.3%H,缺血再灌注的海马,小脑及心室肌细胞都可见呈深棕色的阳性细胞核,染色质凝聚,浓缩,呈凋亡细胞的形态学征象.部分阳性细胞核染色质仍很疏松.I组阳性细胞较少,胞浆及细胞外间质,胶原纤维等不着色,背景十分清亮.II组阳性细胞也较少,但背底颜色较深.ⅡI组阳性细胞多,背底颜色深,呈棕色反应.未加Tcrr的对照片呈阴性.3讨论TUNEL法是一种分子生物学与免疫组织化学相结合原位检测凋亡细胞DNA片段的方法,因其灵敏可靠而被广泛用于细胞凋亡的研究.其基本原理是:细胞凋亡时.核酸内切酶祷激活.染色质或DNA武汉太学学报(医学皈)第22卷被切割,出现单链或双链缺口,产生与DNA断点相同的3’OH末端,在一定缓冲液体系下脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dm’P)不需要模板标记到缺口3’OH末端,再用免疫细胞化学方法将结合有HRP的抗荧光素抗体与标记后的DNA 断点处的荧光素结合,扩大信号,加人HRP显色底物DAB-02后则呈棕色反应.因而有棕色反应可表明出现DNA断裂的3’OH末端.凋亡已经发生, 即使未出现核染色质凝聚,浓缩的典型征象,亦应视为摘亡细胞.我们用透射电镜观察早期的捅亡细胞的染色质仍很疏松,仅部分凝聚趋边.TUNEL染色一般都是在反应液标记DNA片段之前用阻断内源性过氧化物酶,但有报道H’02会减弱TdT的活性j,并可能打断DNA』,出现新的缺口,导致假阳性.因而我们用tt20:阻断内源性过氧化物酶是放在DNA片段标记之后,既可阻断内源性过氧化物酶与显色底物DAB.O2反应致使背底颜色过深,也可避免出现假阳性.我们改进的TUNEL染色背底十分清亮,亦可能与先后用小牛血清或羊血清加封阻剂两次封闭非特异性反应有关.TdT是由小牛胸腺细胞提取的,HRP标记的抗荧光素抗体则为绵羊的G.为了避免混杂有不纯抗体或天然抗体引起的非特异性反应,因而先后用相应的正常血清封闭.白蛋白可封闭醛固定后的醛基.组织最好采用4%多聚甲醛灌注固定为妒.亦可用4%多聚甲醛或10%中性福尔马林浸泡固定.若兼顾电镜标本可用4%多聚甲醛加0.5%戊二醛混合固定.这些固定液固定的组织切片TUNEL染色效果好.固定的组织在包埋前必须充分流水冲洗,去除残留的醛基.醛固定的组织,可发生与蛋白质的交联,掩盖了组织中的部分抗原决定簇.因而,在进行免疫组化反应之前都需要修复抗原.可用酶消化修复或微波修复.用酶消化时若所用酶混有核酸酶活力的酶则使DNA降解造成假阳性.我们用蛋白酶K消化修复抗原,蛋白酶K高度纯化而无核酸酶活力.TUNEL染色的试剂盒价格昂贵,我们在实践中将反应液回收后即时重复使用一次,亦可得到满意效果.参考文献l曾庆云,丁成萦,王乔,等尼莫通对大鼠海马缺血再灌注损伤的保护作用一原位细胞凋亡研究.解剖学杂志,1998. 2l(增刊):2372xuM,z啷QY,Dingc Y,eta1.sluayon日p0pt衄i8inacute i~mieandrepeffu~lratm0/oe~xtium.中国组织化学与细胞化学杂志,000,9(增刊):1223Ml”A,Ata~sioA,8ehifferD.叽1r衄tⅢdetection0f DNAstrandb.abnew-alcellsinsituend-labellingtedl?mq~e8JPatl~l,1995,176(1):274w删肋lit-JookeRR,I~i#erR,elA肿wmethodto如一tenet印叩出镌g髓d-l出出ingd铀嘱?删edD—A.Jt~oebem&Cytoehem,1993.41(1):75Negoe~A,10Ⅱ1ierP,bb吐.MdeIlrF.eta1.Insituapop.协ceeUl~elllngthe』NELmetNxt:impm,~ementatldev.u蚰oncellprel:~iom.J}Iis眦}lem&Cy~oehern,1996,44(9):959(2O00.07.18收稿)TheImprovementAboutiIlSituAl~ptoficCellDetectionbyTUNELMethodWangQi∞,Z酊|gQmg-~n,ⅨIlgClleng-蛐l罟,etalDEmnenlofHulmnA~mmy-Nedic~lcoLLe鲁e,Wuh吼University,Wuh鼬430071,ChinaAI~aetObieet~ve:Toexploreawayofavoidfalsep0siIjvere~ctMtyandolo~ng/1011.specificreactivjtyintheT UNELap.optollcdetectioninsitu,Methods:ThepⅢ曲nsectionsofbrainandmyoeardiumtissueswereslainedbvimpmved‘I1JNELmethod,P0l珊alde}1)TdeWItSchosena8胁ti仰fluid.Pmtein~eKWItSu8edtO他pai 他anti舯.neinhIbI【i∞ofend08∞0I1spelDda8ewith02WItSperformedaftermefldngtheDNAfragmentswithther衄c石vj 竹nujd.B0inese.n1maldll0Ⅱn&Isheepse删mwereusedtoir~ibitthe1301”1一specificreactivityfortwotimes.ResuIts:TheimprovedfIle山odevoided&I暑epositivefeac【ty-a工ldadearbackg∞undw丑sobserved.Conelmion:ThejⅡ1pmvedTUNELstainln只me出.0dc邮beused幻detecttheap0pt0ticoell8.MeSHap0pt08;Ⅱnm0his眦heI1li蝌;method~。
tunel和dapi染色原理
TUNEL 和 DAPI 染色原理近年来，细胞生物学和病理学领域的研究对于细胞凋亡和核酸染色方法的需求逐渐增加。
TUNEL 和 DAPI 染色方法作为常用的细胞学染色技术，被广泛运用于细胞凋亡和核酸检测方面。
下面将对 TUNEL 和DAPI 染色原理进行详细介绍。
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling）染色原理：1. TUNEL 染色原理概述TUNEL 技术是一种用于检测细胞凋亡的方法。
在细胞凋亡过程中，DNA 断裂是一个重要的特征。
TUNEL 技术利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在 DNA 断裂端引入标记的 dUTP 的原理，通过检测 DNA 断裂端的标记来识别凋亡细胞。
2. TUNEL 染色方法步骤（1）取样处理：将样本固定和包埋后，进行脱水和脱脂等处理。
（2）蛋白酶预处理：利用蛋白酶处理打开细胞核膜，提高核酸的透过性。
（3）TUNEL 反应：在 TdT 的作用下，未修饰的末端脱氧核苷酸与荧光素化的 dUTP 形成共价结合。
（4）显微镜观察：使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
3. TUNEL 染色原理应用TUNEL 染色方法被广泛应用于许多领域，如肿瘤研究、病理学、药理学等。
通过检测细胞中凋亡的程度，可以对生物样品进行定量和定性分析。
DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色原理：1. DAPI 染色原理概述DAPI 是一种结合到 DNA 的蓝色荧光染料，具有高度亲和力和高度特异性。
DAPI 与 DNA 结合后在核型显微镜下会呈现出亮蓝色的荧光。
2. DAPI 染色方法步骤（1）细胞固定：利用适当的方式将细胞固定在载玻片上。
（2）DAPI 染色液：将含有 DAPI 的染色液滴在载玻片上，让细胞充分吸收。
（3）显微镜观察：利用蓝光激发荧光显微镜观察并拍摄图像。
3. DAPI 染色原理应用DAPI 染色方法在细胞学和病理学领域有着广泛的应用。
TUNE L法检测细胞凋亡
TUNE L法检测细胞凋亡1 原理TUNEL〔terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法〕是通过检测细胞凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况来评价细胞凋亡的有效方法。
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30﹪的染色体DNA 在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体式DNA片段〔核小体式剪切〕。
由于DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3’-OH末端。
增加细胞膜通透性→脱氧核糖核苷酸末端转移酶〔TdT Enzyme〕和荧光素〔fluorescein〕标记的dUTP进入细胞内→在TdT的辅助下dUTP与凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端结合→再用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗荧光素抗体与dTUT上的荧光素〔fluorescein〕特异结合〔荧光显微镜观察〕→最后用辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺〔DAB〕、过氧化氢与HRP发生氧化、环化反响，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色→特异准确地定位正在凋亡的细胞→普通显微镜下观察和计数不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
适用于组织样本〔石蜡包埋、冰冻和超薄切片〕和细胞样本〔细胞爬片、涂片〕的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
2 器材与试剂2.1器材：光学显微镜及其成像系统、染色缸、湿盒、各种规格的加样器及枪头、镊子、24孔或6孔板、盖玻片、载玻片、1.5mleppendorf管、平皿、吸管、锡纸、摇床、计时表、荧光显微镜、光镜、MARKER笔、冰盒、恒温箱、加湿器、塑料缸、微波炉等。
细胞凋亡检测之Tunel法的实验步骤
细胞凋亡检测之Tunel法的实验步骤如今，细胞凋亡检测是目前非常热门的研究方向，它不仅可以用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究，还能应用于临床诊疗、新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及肿瘤的基因治疗等，对于相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价也具有举足轻重的地位。
目前研究组织体内细胞凋亡最广泛的方法是什么呢?无疑是——Tunel 法，它不仅能检测早期基因组的断裂，还能能通过标记的多少，进行半定量研究。
首先，我们先来看一下细胞凋亡和细胞坏死的区别：Tunel法应用Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
Tunel法详细的实验步骤1. 常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min;2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;3. PBS漂洗2次;用Proteinase K工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;4. 加入含2%过氧化氢的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次5. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
6. 玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
7. 加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS 漂洗3次;8. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm);9. 玻片干后加50μl DIG-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp 核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。
在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。
原位细胞凋亡技术TUNEL法的改进
达 或 表 达不 足 ， 时 荧光 标 记 法与 酶 联 染 色 两种 方 法 的 联 合应 用 优 势 互补 ， 大程 度 的提 高 准确 性 。 同 最 【 关键 词】 原位 缺 口末 端 标 记 ： 光计 ； 荧 酶联 显 色
与该 术 式 对脑 组 织 的 损伤 较 少 有 关 。 颅 骨钻 孔 血肿 清 除 引流术 是在 非 直 视下 进行 ， 也有 它 的局 限性 。（） １发病 ６ ｈ
ｐ ｃ ｆ ｎ ｔ ｕ ｉ ｎ ｏ ａ ￣ｏ ｅｐ ｏ ｅ ｍ ｐ ｎ ａ ｔ ｉ ｓｉ ｔ ｆ ｓ ｋ ｒ ｇ ａ ｕ ｏ ｏ ｔ ｏ ｒ ｆ ｒ ａ ｉ ｓａ ｕ ａ ｃ ｄ ｍ ｉ ｅ ｃ ｌ ｅ ｅ ｒ ｌ ａ ｔ ｒ ｒ ｌａ ａ ｅ ｃｍ ｄｉａ ｂ ａ
内患者 由于发病时问短 ， 血肿 可能尚不
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进 展 ［］立 体 定 向和 功 能 性 神经 外 科 杂 Ｊ ．
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稳 定 ， 固不 完 全 ， 凝 手术 可 能诱 发继 续 出 【】 Ｖａｏ ． ａｎ ｓ ｎ ｎｇ ｍｅｔ ｆ ３ ｒｎＪＤｉｇ ｏｉ ａ ｄｍａ ａ ｅ ｎ ｓ ｏ 血或 再 出血 ， 不 主 张 超早 期 手 术 。 ２ 故 （） ｌｂｌ ｏ ｄ ｐ ｅ ｓ ｒ ｕ ｉｇａ ｕｅｃ ｒ — ａ ｉ ｂｌ ｏ ｒ ｓ ｕ ｅ ｄ ｒｎ ｃ ｔ ｅ ｅ ｅ 术 中若 引流 出新鲜 血 液 ， 明 脑 出血 在 说
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tunel法检测细胞凋亡原理
tunel法检测细胞凋亡原理一、介绍细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它在多种生理和病理过程中发挥重要作用。
tunel法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）是一种常用的检测细胞凋亡的方法，它利用细胞凋亡时DNA断裂产生的末端暴露的3’-OH末端为基础，通过连接dUTP标记的核苷酸，再经过酶促反应形成标记物，最终通过染色和显微镜观察来检测细胞凋亡。
本文将深入探讨tunel法检测细胞凋亡的原理、步骤以及其优缺点和应用。
二、tunel法的原理1.细胞凋亡的DNA断裂细胞凋亡在DNA断裂的过程中，导致DNA链上产生单链和双链断裂，这些断裂可暴露3’-OH末端。
这些断裂的末端会暴露出来，为tunel法提供了基础。
2.核苷酸连接在tunel法中，细胞内的3’-OH末端与dUTP（脱氧尿嘧啶核苷酸）结合，形成连接的核苷酸。
3.核酸标记连接的核苷酸可以通过酶促反应来标记。
一般使用terminaldeoxynucleotidyl transferase（TdT）酶，它能够将标记物连接到核苷酸的3’-OH末端。
4.核酸染色标记后的核酸可以通过荧光染色或者抗体染色来可视化。
tunel法通常使用具有荧光标记的抗体，这样可以直接观察细胞凋亡的情况。
三、tunel法的步骤tunel法的主要步骤包括样品的处理、反应体系的建立、酶促反应和染色。
下面是一个通常的tunel法的实验步骤：1.样品的制备将要研究的细胞或组织制备成切片或细胞悬液的形式。
对于固定的组织样品，可以通过切片的方式得到。
2.反应体系的建立根据实验的需要，建立适当的反应体系。
通常使用含有一定浓度TdT酶和dUTP的反应缓冲液，其中还包括辅酶和其他必要的试剂。
3.酶促反应将反应体系与样品共同处理，保持一定的反应时间，以便TdT酶能够与3’-OH末端发生连接作用。
4.染色完成酶促反应后，使用荧光标记的抗体或者其他染料染色，以便观察细胞凋亡的情况。
TUNEL检测细胞凋亡实验报告
TUNEL法检测细胞凋亡实验实验原理：细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。
细胞凋亡涉及caspase活化、线粒体跨膜电位下降，位于细胞膜脂内层的磷脂酰丝氨酸转位到蛋白表面，DNA呈规律性断裂等。
基于这些特征，多种检测凋亡的方法也迅速发展起来，常用的方法包括形态学检查，分子生物学方法，免疫电泳和细胞学检查。
TUNEL，为原位末端转移酶标记技术。
其原理是：先增加细胞膜通透性，让rTDT和荧光素生物素标记的dUTP进入细胞内，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的辅助下将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而可进行凋亡细胞的检测。
最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
实验前准备在开始实验前，确保所用到的试剂都准备到位。
如：0.2% TritonX 100，TUNEL检测试剂盒（包含10× TdT酶浓缩液、荧光素标记的1× dUTP、转化剂POD），DAB试剂盒，3%过氧化氢甲醇，磷酸缓冲液PBS等。
本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得公司提供的移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头，湿盒，恒温箱等。
本次TUNEL实验按照以下常规步骤来展开，首先样品处理，封闭内源性过氧化物酶干扰后进行细胞通透化。
滴加TUNEL反应液反应后POD转换，DAB显色后在显微镜下观察并进行结果分析。
样品处理在标有实验组，阳性对照组和阴性对照组的切片上滴加4%不含甲醇的甲醛室温固定10min。
弃去甲醛，用PBS洗两次，每次5min。
封闭用滤纸擦去周围多余的PBS，滴加3%过氧化氢甲醇，室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶干扰后，弃去将载玻片用PBS洗2次，每次5min。
细胞通透化去尽PBS后，滴加100μl由PBS配制的0.2% TritonX 100。
于湿盒中室温孵育5min。
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结1. ⼏种细胞凋亡检测⽅法中TUNEL法的优点和缺点是什么？2. TUNEL法的实验原理是什么？3. TUNEL实验中⼏个关键步骤是什么？4. 如何减弱⾮特异性染⾊？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显⾊时间和条件如何把握？9. ⾸次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作⽤和⽅法分别是什么？11. 脱蜡和⽔化在TUNEL法中的作⽤和⽅法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中⼏个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和⽔化。
脱蜡可以先60度20min，再⽤⼆甲苯两次5~10min；⽽⽔化⽤梯度⼄醇从⾼浓度到低浓度浸洗，这些以便后⾯的结合反应充分、均匀；2. 把握好细胞通透的时间。
⼀般根据切⽚的厚薄，选择蛋⽩酶k的孵育时间，常⽤10~30min，⼏um切⽚⽤短时间；⼏⼗um切⽚⽤长时间，通过摸索达到既不脱⽚，有能够使后⾯的酶和抗体进⼊胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
⼀般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长⾄2h，但要结合你最终的背景着⾊。
4. DAB显⾊条件的选择。
⼀般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜⾊，最长不超过30min；我不喜欢⽤promega公司提供的DAB液（桃红⾊），不利于辨认棕褐⾊。
5.PBS的充分清洗。
我个⼈认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应⼗分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切⽚的⾮特异性着⾊。
6. 此外，内源性POD的封闭也⼗分关键。
对于肝脏、肾脏等⾎细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升⾼过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染⾊。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切⽚先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进⼊细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再⽤HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素⾄少可以再结合3个biotin分⼦），最后⽤DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发⽣氧化、环化反应，形成苯⼄肼聚合物⽽呈现棕褐⾊，最终通过计数每张切⽚上不同视野中TUNEL阳性细胞的⽐例来判断细胞凋亡发⽣情况。
如何用Tunel法搞定石蜡切片冰冻切片细胞涂片的凋亡检测
如何用Tunel法搞定石蜡切片冰冻切片细胞涂片的凋亡检测Tunel法常用于检测细胞凋亡，其原理为细胞凋亡发生时，相关DNA内切酶会被激活，从而切断核小体间的DNA。
在细胞凋亡晚期，DNA会被降解为180-200 bp的片段。
TdT介导的dUTP末端标记法（TUNEL）是在TdT的催化下将荧光素标记的dUTP与断裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
Tunel试剂盒适用于组织样本（石蜡切片、冰冻切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
今天就为大家介绍三种样品的处理方法：一.石蜡切片1）脱蜡与水化：将切片依次放入二甲苯I（15min）→二甲苯II （15min）→100％乙醇（5min）→95％乙醇（5min）→90％乙醇（5min）→85％乙醇（5min）→80％乙醇（5min）→70％乙醇（5min）→ddH2O冲洗5min，重复3次；2）用组化笔圈好组织，在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；3）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；二.冰冻切片1）1×PBS洗5min，3次。
2）用组化笔圈好组织，在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；3）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；三.细胞涂片：1）固定细胞，将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。
2）洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5min。
重复用PBS 洗一次。
动作要轻柔，防止细胞脱片。
3）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。
4）每个样本上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用5min；5）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；三种样品处理的方法略有不同，最关键的差别在于蛋白酶(PK）的处理时间，一般组织样品处理的时间略长，细胞处理时间最好控制在几分钟内，防止样品通透过度，造成组织或细胞脱片。
TUNEL法-也称DNA 断裂的原位末端标记法,这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3’-OH进行原位标记
TUNEL法-也称DNA 断裂的原位末端标记法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3’-OH进行原位标记TUNEL法-也称DNA 断裂的原位末端标记法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3’-OH进行原位标记，借助一种可观测的标记物，如荧光素，能对凋亡细胞核DNA中产生的3’-OH 末端进行原位标记，用荧光显微镜即可进行观察。
学术术语来源——骨髓基质干细胞缺血心肌内移植早期：可减少心肌细胞凋亡但未改善心功能文章亮点：1 实验通过结扎法切断心脏血流造成大鼠急性心肌梗死模型，观察到骨髓基质干细胞移植到缺血坏死心肌内对心肌细胞凋亡有保护作用，但对于心肌血流动力学、心脏功能保护方面短期内未见改善作用，这说明骨髓基质干细胞移植早期对心脏功能改善作用不甚明显。
2 作者认为，在骨髓基质干细胞移植早期，细胞在局部增殖分化为新的心肌细胞比例有限，尤其是在心肌梗死早期有大量心肌细胞死亡，局部发生严重的炎症反应等多种因素都不会使得心脏血流动力学或心脏功能明显改善。
关键词：干细胞；移植；骨髓干细胞；骨髓基质干细胞；移植；急性心肌梗死；细胞凋亡；血流动力学；超声心动图；SD大鼠主题词：骨髓；干细胞；心肌梗塞；细胞凋亡摘要背景：骨髓基质干细胞移植到梗死心肌组织能够起到抑制和减少心肌细胞凋亡的效应，而这一作用与心功能改善是否有相关性还不清楚。
目的：观察缺血心肌内移植骨髓基质干细胞早期对心脏功能的影响。
方法：采用结扎左前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，假手术组仅穿线不结扎。
骨髓基质干细胞移植组于心肌梗死术后30 min分5个位置于梗死边缘向心肌组织内移植大鼠骨髓基质干细胞0.1 mL(2×106)，而假手术组、模型组术后分别向心肌内注射相同剂量的生理盐水。
细胞移植后3 d监测血流动力学、超声心动图，TUNEL法检测心肌细胞凋亡的变化。
结果与结论：移植后第3天，与假手术组相比，模型组梗死区及缺血区心肌细胞凋亡明显；骨髓基质干细胞移植组梗死区和缺血区心肌细胞凋亡数目均较模型组显著减少。
TUNEL联合免疫组化DcR3染色在肝癌组织切片检查中的应用分析
TUNEL联合免疫组化DcR3染色在肝癌组织切片检查中的应用分析摘要：目的在肝癌组织切片检查中，使用DNA缺口末端标记（TUNEL）的同时，搭配使用免疫组化DcR3染色方式，分析应用效果。
方法选择2014年4月到2015年4月本院以手术方式切除的12例肝癌组织分别切片4张，1号切片单纯进行TUNEL，2号切片单独进行免疫组化诱捕受体3（DcR3）染色，3号切片先免疫组化DcR3染色随后进行TUNEL，4号切片先TUNEL后行合免疫组化DcR3染色，研究DcR3在病变组织中表达形式和细胞凋亡最适合联系方法。
结果 14例肝癌组织切片样本中，1号切片中可判定11例细胞凋亡状况，2号切片当中有10例阳性，3号切片或者4号切片均能观察到11例细胞凋亡情况、10例免疫组化DcR3染色阳性。
结论在同1张肝癌组织切片上使用TUNEL的同时，搭配使用免疫组化DcR3染色的方法，可实现同时判定细胞凋亡与DcR3的表达形式。
关键词：TUNEL；免疫组化DcR3染色；肝癌组织切片TUNEL技术主要用在原位检测细胞凋亡状况之中，属于分子生物学与细胞形态学相结合的研究方式，对处于无残缺状态的单个凋亡细胞核实施原位染色，可正确判定凋亡特点。
DcR3是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，可以阻断细胞凋亡。
1.资料与方法1.1一般资料选择2014年4月到2015年4月在本院进行手术切除的12例肝癌组织样本，均通过甲醛固定和石蜡包埋处理。
切片厚度均为4um，共4张。
1.2方法将4张切片进行分号，便于研究。
1号切片单纯进行TUNEL，2号切片单独进行免疫组化诱捕受体3（DcR3）染色，3号切片先免疫组化DcR3染色随后进行TUNEL，4号切片先TUNEL后行合免疫组化DcR3染色。
在进行TUNEL联合免疫组化DcR3染色操作时，流程均按照说明书进行。
1.3判定标准1.3.1免疫组化DcR3染色只要细胞当中发现显著棕红色颗粒，该细胞为阳性，如其在25%分数以下为0，、25%到50%分数为1、51%到75%分数为2、在75%以上分数为3；根据样本中细胞是否存在染色、染色深浅判定分数，无染色分数为0、浅棕红色分数为1、棕红色分数为2、鲜红色分数为3。
tunel染色 作用
tunel染色作用Tunel染色的作用什么是Tunel染色？Tunel染色是一种常用的细胞和组织样本检测方法，用于检测细胞凋亡的发生与程度。
Tunel是”Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”的缩写，即末端脱氧核苷酸转移酶-去氧尿嘧啶核苷酸末端标记法。
这种染色技术通过标记DNA断裂末端的dUTP来检测细胞凋亡。
Tunel染色的原理Tunel染色的原理基于细胞凋亡时DNA断裂的现象。
在细胞凋亡发生时，DNA会断裂并形成自由的断裂末端。
Tunel染色利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在这些断裂末端上加入标记的dUTP。
通过连接这些标记的dUTP，我们可以利用荧光或颜色物质的发射来显示细胞凋亡的发生和程度。
Tunel染色的应用Tunel染色在生物医学领域中具有广泛的应用。
以下是一些Tunel 染色的主要应用：•细胞凋亡研究：Tunel染色可以帮助科学家们研究各种生理和病理条件下细胞凋亡的发生机制、调控因子以及凋亡信号通路。
•药物研发：许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。
Tunel染色可以评估药物对细胞的作用，并帮助科学家们筛选和优化药物候选物。
•疾病诊断：凋亡在许多疾病的发展中起着重要作用。
Tunel染色可以用于检测和诊断与细胞凋亡相关的疾病，如癌症、神经系统疾病和心血管疾病等。
Tunel染色的优点Tunel染色作为一种检测细胞凋亡的方法，具有以下几点优点：•高灵敏度：Tunel染色能够检测到细胞凋亡的微弱信号，可以提供准确的凋亡检测结果。
•易于操作：相比其他凋亡检测方法，Tunel染色的操作相对简单且迅速，可广泛应用于实验室和临床领域。
•可定量化：Tunel染色结果可以通过计算染色阳性细胞百分比或强度来量化细胞凋亡的程度，提供定量化的数据支持。
•多重应用：Tunel染色可以与其他染色方法相结合，如免疫组化染色、细胞形态学分析等，扩展其应用领域。
原位末端转移酶标记技术
原位末端转移酶标记技术在现代生物学研究领域中，原位标记技术已是一项非常重要的技术。
一些特殊的实验需要通过特定的手段对样品进行标记，使原有的未标记结构物变得可以被观测和检测到，进而更准确地掌握样品的内部组成和结构情况。
其中，“原位末端转移酶标记技术”也就是一项重要的技术之一。
“原位末端转移酶标记技术”（TdT-mediated dUTP-biotinnick end labeling，TUNEL）是指用末端转移酶(TdT)与生物素掺杂的dUTP核苷酸（或其他标记的核苷酸），标记组织或细胞DNA片段断裂处。
在染色体研究、细胞凋亡等研究中，TUNEL技术广泛应用。
下面，将对“原位末端转移酶标记技术”的具体实施步骤进行阐述：第一步，准备样品。
TUNEL技术主要用于富含核酸的样品，如细胞核和细胞。
首先，需将待检测的组织或细胞取出，用生理盐水洗涤，去掉表面的皮脂、油脂等杂质。
通过某些特殊的手段可以对样品进行固定。
第二步，制作反应混合物。
取10 μL 1×反应缓冲液、8 μL dUTP-biotin标记混合物、1 μL TdT酶（10 U/μL），20 μL混合均匀即可。
第三步，反应处理。
取适量DNA样品，加入反应混合物，进行反应。
反应温度可根据研究要求在37℃-40℃之间进行，通常反应时间为1-2h。
第四步，准备样品切片。
处理的不同样品需要进行不同的制片处理。
对于细胞，可以通过离心和固定等方式。
对于组织，需要进行组织的包埋操作等。
第五步，进行特殊染色。
通过特殊染色操作，对样品进行标记。
标记后可通过荧光显微镜或其他仪器进行显示和观察。
总之，“原位末端转移酶标记技术”在生物学研究中应用广泛，其标记出的样品可以直观地提供样品DNA断裂情况，是一项十分重要的生物学技术。
上述操作流程可以作为“原位末端转移酶标记技术”的简单技术手段，具体实施过程中还需根据研究对象等具体情况进行不同的调整和研究。
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肿瘤组织 中阳性 的瘤细 胞细胞 核呈 棕黄 色 ， 色质凝 染
聚、 浓缩 ， 凋亡 细胞 的形态学征象 ， 呈 部分 阳性 细胞核染 色质 仍 很疏松 ， 部分呈 圆形深染 的棕 黄色小体 ， 为典 型的凋亡 小 体。Ａ组为完全按照试剂盒说 明操 作 ， 几乎所有 的肿瘤细胞
稀释 ） 。置 湿 盒 内 ３ ℃ ，５ ｒ ｎ ７ ４ ｉ。对 照 片 不 加 Ｔ Ｔ ０ Ｏ ａ ｄ ，．１ ｍ ｌＬＰ Ｓ洗 ， ｍｎＸ３次 。（ ） ． ％ Ｈ ０ ｏ Ｂ ／ ５ ｉ ５ ０３ ２ ２甲醇溶液 阻断 内源性过氧化物酶 ， 室温 １ ｎ ００ ｏ Ｌ Ｂ ０ｍｉ，． １ｍ ｌ Ｐ Ｓ洗 ， ｍ ｎ× ／ ５ ｉ ３次。（ ） 次封 闭非特异性反应 ： 片滴加 ２ ％羊血清 ３ ６再 切 ０ ７ ℃ ，０ｍｉ。（ ） 片滴 加 １： ２ ｎ ７ 切 ２稀 释的 Ｐ Ｄ（ Ｒ Ｏ Ｈ Ｐ连结 的抗
具有灵敏度高快速并能准确 的反应细胞凋亡形态特征 、 染色 定位及其 在组 织中的分布 ， 可检测 出极少量 的凋 亡细胞 ， 因
而在细胞凋亡 的研 究中已被 广泛采用 。 我们在使用 Ｔ Ｎ Ｌ试 剂盒时 ， 能全部 机械地按 照使 ＵＥ 不
ｍｎ× ｉ ２次 ， 无水 乙醇 ３ｍｎＸ２次 ，５ 和 ７ ％ 乙醇各 洗 １ ｉ ９％ ５
出现几乎所有肿 瘤细胞胞 核都 着色 ， 难以判断 出真正的凋亡 细胞 ， 其余各组 Ｃ组 、 、 Ｅ组 Ｆ组假 阳性细胞数量亦较 多（ ３ 图
—
６ 。Ｇ组未加 Ｔ Ｔ的对照片呈阴性 反应。 ） ｄ
・
６ ８－ ２
临床与 实验病理 学杂 志
ＪＣｉ Ｅｐ Ｐ ｔｏ ０ ８Ｏ ｔ ４ ５ ｌ ｘ ａｈｌ ０ ｃ； （ ） ｎ ２ ２
Ｔ Ｎ Ｌ法 原位 检 测 肿瘤 组 织细 胞 凋 亡 的改进 ＵＥ
张爱凤 ， 陈平圣， 鲁 勤， 东风 刘
组： 为改进 组 ， 本 实验 改 进 的方 法 进 行 Ｔ Ｎ Ｌ染 色。Ｃ 按 ＵＥ 组： 滴加反应 液 后孵 育 时 间 为试 剂 盒推 荐 的 时 间 ６ ｉ， ０ ｒｎ ａ
酶 （ｄ ） Ｔ Ｔ 的作用 下 ， 需要模 板就 可 以催 化地高 辛 、 不 生物素 或荧光素 等标记 的脱氧核糖核苷酸结合到 Ｄ Ａ的 ３’ Ｎ 。 ， 末端
再利用免疫组化方法进 行检测 。这类 方法 就是脱氧 核糖核 苷酸末端转移酶介导 的缺 口末端标 记法 （ Ｕ Ｅ ） Ｔ Ｎ Ｌ 。尽管检 测细胞凋亡 的方法有数种 ， 而利 用凋亡 的原位酶标记 的方法
所示。 ２ 结 果
原位末端标记技术 是当今较 为流行 的一类定 量凋亡 细 胞评判方法 ， 以脱 氧核苷酸末端转移酶 （ ｄ ）介导的核苷酸 ＴＴ
（Ｕ Ｐ ｄ Ｔ ）缺 口末端标 记法（ Ｕ Ｅ 应用最 为广泛 。在对各 Ｔ Ｎ Ｌ） 种组织进行凋亡研究时 ， 多数采用从各种试剂公 司购买 的试
均呈阳性染 色 ， 而绝大多数为假 阳性染色 （ １ 。按本 实验 图 ） 改进 的方 法 Ｂ组 （ ２ 阳性 细胞清 晰 ， 图 ） 可见典 型 的凋 亡小 体 ， 阳性细胞数量极少 ， 假 胞质及 细胞外 间质 、 胶原纤维等不 着色 ， 背景非特异性染 色弱 。Ｄ组按 试剂盒 推荐 Ｔ Ｔ浓 度 ， ｄ
１ １ 实验材 料 荷 瘤兔 肝癌 移植 瘤组 织。选用 １ ％ 中性 ． ０ 缓冲福 尔马林 固定 。常规石蜡包埋 ， 片。 切 １２ Ｔ Ｅ ． ＵＮ Ｌ染色 参考 Ｒ ｎｈ公司 （ 自北京 中杉公 司） ｏｃ 购
的细胞凋亡检 测试剂盒 并按本 实验 改进 的方 法操作 。 （ ） １ 预处理 ： 石蜡包埋的组织切 片脱蜡入水 ， 序为二 甲苯 洗 ， 顺 ５
关键 词 ： 细胞凋亡 ； 免疫组织化学 ；Ｕ Ｅ Ｔ Ｎ Ｌ法
中 图分 类 号 ： ２ ． ５ Ｒ３ ９２ 文 献标 识码 ： Ｂ
文章编号 ：０ １ ７ ９ （０ ８ ０ ０ ２ １０ — ３９ ２０ ）５— ６ ８—０ ２
０３ Ｈ Ｏ ． ％ 阻断在 Ｄ Ｎ片 断被标 记前 ， Ａ 其余 步骤 同 Ｂ组 。 Ｄ组 ：ｄ Ｔ Ｔ浓度 为试 剂盒 推荐 的浓度 １： ０ 其余 步骤 同 Ｂ １， 组 。Ｅ组 ： 微波 修 复 ， 用 只用 血清 封 闭 １次 ， 其余 步骤 同 Ｂ 组。Ｆ组 ： 只用小 牛血清 一次 封闭非特 异性反 应 ， 但 其余 步 骤 同 Ｂ组 。Ｇ组 ： 阴性对照 。未加 Ｔ Ｔ， ｄ 其余 同 Ｂ组 。如表 １
次， 每次 ３ｍｉ。（ ） 复抗 原 ： 片滴加 蛋 白酶 Ｋ（０ ｎ ２修 切 ２
ｍ ）７℃ ，５ｍｎ ０ 叭 ｍ ｌＬＰ Ｓ洗 ５ｍｉ ３次 。 （ ） 闭 １３ １ ｉ；． ｏ Ｂ ／ ｎ× ３封
３ 讨论
非特异性反应 ： 滴加 ２ ％胎牛血清和 ３ ０ ％小牛血清 白蛋 白３ ７
℃ ，０ ｍ ｎ （ Ｄ Ａ 片 段 标 记 ： 加 反 应 液 ５ １ Ｔ Ｔ ２ ｉ。 ４） Ｎ 滴 ０ （ ｄ
细胞发生凋亡时 ， 染色体 双链 Ｄ Ａ会 出现许 多不对称 Ｎ 的断裂点 ， 露出 ３ ＿Ｈ末端 ， 暴 ，Ｏ 在脱 氧核糖核苷酸 末端转移
２５ ， ． ｌ荧光素连接 的核苷 酸混 合缓 冲液 ４ ． ｌ 即 ｌ： ０ ７５ ， ２
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
剂盒 。虽然试剂盒使用方便 ， 是有 时结果并 不理 想 ， 但 如非
特异性染 色过 多， 景染 色深 。对 动物 组 织 的研 究 更是 如 背
此 。我们在 Ｔ Ｎ Ｌ染色过 程 中如何 更好 地利用 试剂盒 ， ＵＥ 在 避免假 阳性 、 消除非特 异性反 应 、 降低 背景染 色等方 面进行 了探索和改进 ， 获得了满意的实验结果 ， 现介绍如下。