锦鲤疱疹病毒潜伏感染实时荧光定量PCR检测方法的建立

合集下载

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)004【摘要】为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.%To exploratory the feasibility of multiple gene detection of koi herpesvirus (KHV) by PCR, the PCR detections were conducted to amplify the TK and Sph genes of KHV to comparing with the amplification of ORF7 which was recommended by inspection and quarantine standard for KHV detection. The three genes were amplified with the spcefic primers and the the template DNA of virus extracted from the KHV infected KF cells. The results showed that the fragments of 409 bp (TK), 292 bp (Sph), and 484 bp (ORF7) could be specifically amplified with a detection limit at 1.9×l06 copies/μLof KHV. It was evident that the all of these gene could be used to detection of KHV.【总页数】4页(P316-318,330)【作者】孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连116001;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.利用多重PCR方法检测7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)研究 [J], 张耀川;许亮;张洁;田锦;李玉舒;石进朝2.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;刘中勇;黄宝春3.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄4.利用PCR方法检测转基因大豆加工食品中的修饰基因 [J], 邓鸿铃5.PCR方法检测食品中致病菌常用的靶基因及其引物 [J], 段莹;陶景玉;卢行安;陈明生;崔秀云因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布

锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布

锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布
锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布*
何汶璐1#,李根1#,康慧敏1,何嘉乐1,杨壮志2,阳瑞雪1,汪开毓1,耿毅1,欧阳萍1 **
【摘要】摘要:【⽬的】研究锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)感染鲤鱼的侵染规律与动态病理损伤,为CyHV-3致病机理的研究奠定实验基础,同时为有效防控锦鲤疱疹病毒病提供参考。

【⽅法】采⽤浸泡法对鲤鱼进⾏⼈⼯感染试验,于不同时间点剖检采样,进⾏动态病理学观察和荧光定量PCR检测,选择具有代表性的外部(鳃)和内部器官(肾脏)进⾏动态病理学观察。

【结果】鳃⼩⽚呼吸上⽪细胞增⽣严重并伴有⼤量炎症细胞浸润,肾脏主要表现为间质性肾炎,肾⼩管上⽪细胞变性坏死。

试验鱼在感染前期病毒含量最⾼的是鳃组织,肠道中未检测到病毒,随着感染时间的延长,各组织内的病毒含量逐步增加。

病毒感染10 d 后,鳃、肾脏以及脑组织的病毒含量达到最⾼值,随后病毒量保持稳定。

脾脏、肝脏和肠道中病毒含量的最⾼值出现在感染第14天。

【结论】CyHV-3在鲤鱼体内先⼊侵鳃组织,随后到达肾脏、脾脏等全⾝各组织器官中。

【期刊名称】云南农业⼤学学报
【年(卷),期】2018(033)005
【总页数】7
【关键词】锦鲤疱疹病毒;鲤鱼;病理损伤;病原组织分布
修回⽇期:2018-05-06 ⽹络出版时间:2018-10-13
*基⾦项⽬:中国博⼠后科学基⾦(2015M582563);教育部留学回国⼈员科研启动基⾦[教外司留(2015)311号]。

⽹络出版地址:http:///doc/5917835637.html
/10.12101/j.issn.1004-。

多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因

多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因
W u i i Ch n F n Z a g Yi i, i n i, i h n y n Li h x o g r n, e ag, h q n y2 L u Yu l L u Z o g o g , n Z i i n 2
(. a go gIset nadQur t eT cn lg etrGun z o 16 3 C ia 1 Gun d n p c o aai eh oo yC ne, a gh u50 2 , hn ; n i n n n
中国动物检疫 2 1 年 第2 卷 第 1 期 01 8 1
一3 9一

多重 P R方法检测锦鲤疱疹病毒基 因 C
乌 日琴 陈 芳 张艺 宜 z刘芸 莉 2刘 中勇 , 志雄 , , , 林
(. 东出入境检验检疫局技术 中心, 东广州 50 2;. 1广 广 16 2 华南农业大学动物科学系, 东广州 504 ) 3 广 16 2
K V病毒 P R检测结果与常规 P R检测结果基本吻合,在多重 P R检测体系中K V T H C C C H K基因片 段检测的灵敏度高于检验检
疫行业标准方法。结果表 明, 多重 K V病毒 P R检 测方法能够快速 、 H C 准确和灵敏地检测 K V病毒基 因。 H 关键 词: 测; 检 锦鲤疱疹病毒 ; 多重 P R C
中图分类号 :8 2 6 9 6 ¥ 5 .5 . 文献标识码: A 文章编号:0 5 9 4 (0 11 - 0 90 1 0 - 4 X 2 1) 10 3 - 5
A ut lx P R s yf rSmutn o sDee t n o Ko r e vr sGel M l pe C Asa i l e u tc o f i i o a i Hep s i l u o

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用摘要:本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA,利用针对锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针,经反应体系优化,应用实时荧光定量PCR检测技术,通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。

整个过程快速、简捷,操作简单,可对KHV进行快速有效的诊断,具有一定的应用价值。

关键词:锦鲤疱疹病毒;荧光定量PCR;TaqMan;一步法中图分类号:S941.41+9文献标识号:A文章编号:1001-4942(2016)07-0125-04锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)引起的一种传染性疾病。

KHV能够感染锦鲤、鲤鱼和剃刀鱼,其鱼苗、幼鱼、成鱼均可感染。

锦鲤疱疹病毒病多发于春、秋季,潜伏期两周左右,鱼发病并出现症状24~48 h后开始死亡,2~4 d内死亡率可迅速达到80%~100%[1,2]。

此病首先在以色列暴发,接着美国、欧洲(如英国、德国、比利时)及亚洲一些国家均有此病发生,给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[3,4]。

锦鲤疱疹病毒颗粒呈球状,有囊膜,直径约170~230 nm,其核衣壳为对称十面体,直径为100~110 nm,该病毒由31种病毒多肽组成,遗传物质为双链DNA,基因组大小约为277 kb[5,6]。

目前锦鲤疱疹病毒病的检测方法有电镜检测、ELISA、普通PCR和荧光定量PCR等[7]。

TaqMan荧光定量PCR是在PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性荧光探针,该探针为一段寡聚核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[8~11]。

鲤春病毒血症病毒SYBR Green I荧光定量RT—PCR方法的建立

鲤春病毒血症病毒SYBR Green I荧光定量RT—PCR方法的建立

De v e l o mp me n t o f a S YBR Gr e e n I b a s e d r e a l - - t i me RT- ・ PCR
a s s a y f o r r a p i d d i a g n o s i s o f s p r i n g v i r e mi a o f c a r p v i r u s
v i r u s( s vc v )w i t h a p a i r o f p i r me r s d e s i g n e d a c c o r d i n g t o t h e N s e q u e n c e o f S VC V. T h e s t a n d a r d c u r e s h o we d t h a t t h e
r e c o mb i n a n t p l a s mi d . T h e a s s a y w a s s p e c i i f c or f d e t e c t i n g S VC V w i t h a l i mi t d e t e c t i o n o f 1 0 。 T C I D5 加 L w h i c h wa s 1 0 0 t i me s
Ab s t r a c t :I n t h i s s t u d y , a S YBR Gr e e n I b a s e d r e a l - t i me RT — P CR a s s a y wa s e s t a b l i s h e d f o r d e t e c t i n g s p i r n g v l r e mi a o f c a r p
合 征 病 毒 为 阴性 ,特 异 性 强 ;该 方 法 对 S VC V检 测下限 为 1 0 。 T C I D ̄ / mL,

应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒

应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒

戊 醇 等 购 自长 春 鼎 国生 物 技 术 有 限公 司 。
1 3 特 异 性 引 物 .
由 上海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合
成。
14 P . CR试 剂
用设 计好 的锦 鲤疱 疹 病 毒 特 异性 引 物 进 行 P R C
反 应 , 时 设 立 阴 性 对 照 ( ufr 。通 过 l 同 TE b f ) e
引物 进 行 P R 反 应 , 时 设 立 阴 性 对 照 ( E b f r 。 通 过 1 琼 脂 耱凝 胶 进 行 鉴 定 。 阴 性 对 照 比 较 。 C 同 T uf ) e 与 在
4 4 p处 出 现特 异 性 目的 条 带 。经 序 列测 定 。 得 P R产 物 的基 因序 列 与 N B 上 锦 鲤 疱疹 病 毒 的 同源 率达 8b 所 C C I
闫 春梅 , 雅 斌 , 伟 , 占 山 , 家松 张 郑 熊 张
( 林 省 水产 科 学 研 究 院 。 林 长春 1 0 3 ) 吉 吉 3 0 3
摘 要 : 为建 立 并优 化锦 鲤 疱 疹病 毒 检 测 方 法 , 对 目前 国 内集 约 化 养 殖 鲤 鱼 大 面 积 流 行 的 病 死 现 象进 行 有 针 针 对 性 的 检测 . 对在 疫 区采 集 到 的病 鱼肾 睫 、 胰 脏 、 等 组 织 , 取 基 因 组 D 肝 肠 提 NA, 用 锦 鲤 疱 疹 病 毒 特 异 性 应
道, 该病给 渔业生产带 来 了极重 大危 害 , 必须尽快
开 展 KHV 流 行 病 学 、 断 与 检 测 及 免 疫 预 防 等 诊
方 面的研究 。

采 自吉 林 省 内某 网 箱 养 殖 场 。

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因
待检样品组织 50 ~ l00mg,加入 300!L 裂解液,将 组织捣碎充分溶解,离心 l2000 r / min,离心 5min,取上 清液置于 l.5mL 离心管中,加入 l0 ~ l5!L GOIden bead (上海 申 能 博 彩)充 分 摇 匀,室 温 放 置,并 使 充 分 混
匀。l2000 r / min,离心 lmin。弃去上清,加入 200!L 70%乙醇,反复洗涤 2 次。弃去上清,50C 条件下干 燥 l0min。30!L 灭菌水溶解,充分摇匀。l2000 r / min, 离心 lmin,上清液即为待测样品 DNA。 2 . 2 . 2 蛋白酶 K - 酚 / 氯仿抽提法:见文献[2]。 2.3 引物设计及序列
引物进行筛选,确定了快速检测中应用的一对引物。
2 材料和方法 2 . l KHV 病毒株
本室自存,在水族箱内感染健康锦鲤至出现发
病症状取患病组织作为待测样品。
2 . 2 DNA 提取方法比较 2.2.l 异硫氰酸胍抽提法:
裂解液:异硫氰酸胍(GLSON)6 mOI / L、N - 十二 烷基酰基氨酸(N - LaLrOyI SarOOSine)0 . 5% 、二硫苏 糖醇(DTT)lmmOI / L、醋酸钠 300 mmOI / L、糖原 20!g。
图 l 是分别利用 2 种不同的 DNA 制备方法从 病鱼组织中分离锦鲤 KHV 病毒 DNA 进行 PCR 检测 的结果。结果显示利用蛋白酶 K - 酚 / 氯仿抽提法 不能检测患病锦鲤体内的 KHV 病毒,而利用异硫氰 酸胍抽提 法 可 以 有 效 地 从 患 病 锦 鲤 的 组 织 中 制 备 DNA,病毒浸染组织 PCR 检测呈阳性,PCR 产物大小 和预期一致。 3 .2 两种不同核酸制备方法在 KHV 的 PCR 检测 中敏感性的比较

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因_孟庆峰

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因_孟庆峰

细胞悬液,提取 DNA,根据 GenBank 中登录的 KHV 基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设
计合成 3 对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和 ORF7 基因进行 PCR 检测。通过优化后的
反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测。结果表明:3 对引物能够分别特异性扩增出 409 bp、292 bp 和 484 bp
孟庆峰 1,2,张 琼 3,宋战昀 2,肖成蕊 2,刘 阳 2,蔡 阳 2,张 艳 1,钱爱东 1*,王伟利 2*
(1. 吉林农业大学 动物科技学院,吉林 长春 130118;2. 吉林出入境检验检疫局,吉林 长春 130062; 3. 辽宁出入境检验检疫局,辽宁 大连 116001)
摘 要:为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因 PCR 检测方法,本实验将 KHV 接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变
2 结果与讨论
2.1 3 个基因 PCR 检测结果 分别采用设计的 3 对 引物以 KHV DNA 为模板进行扩增,扩增产物用 1 % 琼脂糖凝胶进行检测,分别在大约 409 bp、484 bp、 292 bp 位置出现目的条带(图 1)。将测序结果进行分 析表明 3 段基因均为目的基因。
本研究基于 TK 基因、Sph 基因和出入境检验检 疫 行 业 标 准 推 荐 的 ORF7 基 因 [6]的 保 守 序 列 设 计 合 成 3 对 特 异 性 引 物 , 以 KHV 标 准 株 核 酸 为 模 板 , 利用优化的反应体系对 KHV 3 个主要基因进行 PCR 扩增(表 1)。结果表明,应用 3 个反应体系均能扩增 出目的条带,无杂带产生,具有较好的特异性。 2.2 KHV P CR 检测特异性试验结果 以优化的反 应体系及反 应条件对 KHV、SVCV、IHNV 和 CHV 进行扩增。结果显示,仅 KHV 核酸扩增 出目 的 条 带,其他病毒株及阴性对照均未扩增出条带(图 2)。 表明 PCR 检测 KHV 特异性好,无交叉反应。 2.3 KHV P CR 检测敏感性试验 利用建立的方法对 不同稀释倍数的模板进行扩增,经过计算,ORF7 基 因、Sph 基因和 TK 基因的 PCR 最低检测病毒核酸拷 贝数分别为 1.6×107 copies/μL、2.66×106 copies/μL 和 1.9×106 copies/μL,敏感性较好(图 3~图 5)。敏感 性试验表明 TK 基因的 PCR 最低检测病毒核酸拷贝 数最低,同时有研究表明 TK 基因在致病性中发挥 着作用[7],在该病毒种属中也相对保守,所以利 用 TK 基 因 进 行 鉴 定 比 用 另 两 种 基 因 进 行 确 证 效 果 好。

锦鲤疱疹病毒病简述

锦鲤疱疹病毒病简述

锦鲤疱疹病毒病简述段宏安;周毅;徐晔;姚燕林;丁超;曹洁;范广宇;孟祥龙【摘要】锦鲤疱疹病毒病是一种危害严重,尚无有效治疗方法的高致病性传染病。

本文汇集大量科研成果,从病原学、流行病学、病理学三个角度对该病毒的特性进行简述,在此基础上,推荐了实验室检测技术,提出了防控建议。

%Koi herpesvirus disease(KHVD)is a serious and highly infectious disease and there is still no effective treatment for it at home and abroad. In the paper,the characteristics of the virus were described based on research findings from its etiology,epidemiology and pathology. Laboratory test techniques were recommended and prevention and control measures were proposed.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】5页(P48-51,52)【关键词】锦鲤疱疹病毒病;KHV;病原学;流行病学;病理学;预防与控制;检测技术【作者】段宏安;周毅;徐晔;姚燕林;丁超;曹洁;范广宇;孟祥龙【作者单位】连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港 222042【正文语种】中文【中图分类】S943锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)感染鲤鱼及锦鲤等变种而引起的一种高致病性急性传染病。

实时定量荧光PCR检测人疱疹病毒6型方法的建立

实时定量荧光PCR检测人疱疹病毒6型方法的建立

中图分类号:R446.62 文献标识码:A实时定量荧光PCR检测人疱疹病毒6型方法的建立廖维维1,叶琇锦2,何静松2(1.浙江省人民医院检验科,浙江杭州310014;2.浙江大学医学院附属第一医院血液科)摘要:目的 建立实时定量荧光PCR的方法检测人疱疹病毒6型。

方法 根据Genebank发表的人疱疹病毒6型的全基因序列,以人疱疹病毒6型U67基因的一段高度保守序列为扩增靶序列,合成引物和探针,构建质粒P MD192T2U67作为标准品。

对人疱疹病毒6型进行实时定量荧光PCR检测,优化反应体系,从线性范围、重复性、敏感性、特异性等四个方面对体系进行方法学评价。

并用建立的实时定量PCR的方法对17例造血干细胞移植后患者HHV26的感染情况进行检测。

结果 成功构建了重组质粒P MD192T2U67。

建立了实时定量荧光PCR技术检测人疱疹病毒6型,该方法的灵敏度高(1.6433×101cop ies/μl),特异性好,重复性好(批内变异系数为5.6%~11.2%,批间变异系数为7.5%~13.2%)。

17例造血干细胞移植患者HHV26的感染率为47.5%。

结论 建立的Taq man技术的实时定量荧光PCR的方法可以快速,特异,灵敏的检测人疱疹病毒6型。

关键词:实时定量PCR;人疱疹病毒6型;造血干细胞移植 人疱疹病毒6型(hu man her pesvirus HHV26)是1986年从艾滋病和淋巴增生异常患者中分离出的一种新型疱疹病毒,属于β病毒亚科(1)。

在人体中,当机体的免疫功能受到抑制时病毒会再次激活。

造血干细胞移植后的病人,由于移植后免疫功能受抑制有40%~65%的病人会出现HHV26病毒的激活或感染,影响移植的成功率和病人的预后。

因此建立快速敏感的检测HHV26感染的方法以指导临床用药,对提高移植的成功率具有重要意义。

实时定量荧光PCR(RT PCR)的技术是近几年发展起来的一种新技术,具有高敏感性,高特异性,高精确性等优点,克服了普通PCR假阳性污染和准确定量困难等缺点,已成为核酸定量检测的首选方法。

鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法[发明专利]

鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法[发明专利]

专利名称:鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法
专利类型:发明专利
发明人:张文,徐立蒲,吕晓楠
申请号:CN201910275066.4
申请日:20190408
公开号:CN109897918A
公开日:
20190618
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法,该方法包括以下步骤:第一、合成引物与TaqMan探针:根据CEV P4a基因序列,对引物序列进行优化,上游引物第1个碱基改为简并碱基W,下游引物第1个碱基改为简并碱基R;根据KHV ORF7基因保守序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针;分别使用FAM和VIC作为探针报告基团,BHQ1作为探针淬灭基团;第二、确定反应体系及条件:采用20μL反应体系,2×Probe PCR Master Mix
10μL,上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L~0.8μmol/L之间,QN ROX参考染料0.1μL,模板2.5μL,DEPC水补足20μL;反应程序为:95℃预变性2min,1个循环;95℃5s,50~60℃退火31s,40个循环。

申请人:北京市水产技术推广站
地址:102600 北京市大兴区北京经济开发区科创十四街99号1幢
国籍:CN
代理机构:天津合正知识产权代理有限公司
代理人:吕琦
更多信息请下载全文后查看。

不同试剂盒检测锦鲤疱疹病毒效果比较

不同试剂盒检测锦鲤疱疹病毒效果比较

不同试剂盒检测锦鲤疱疹病毒效果比较李敏黄炳炽彭家杰胡健声洪伟彬莫钻兰黄洁莹广东省东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞523000摘要为提升实验室对锦鲤疱疹病毒病(koi herpes virus disease,KHVD)病原检测的能力,加强水生动物防疫系统实验室能力建设,本实验室参加了2020年由全国水产技术推广总站组织的锦鲤疱疹病毒病病原检测能力测试。

按照中国检验检疫科学研究院下发的《能力测试作业指导书》,结合水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法第1部分:锦鲤疱疹病毒》(SC/T7212.1-2011)对样品进行鉴定,检测结果为满意。

另外,本实验室选用3种商品化的锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒(A、B、C),以本次参测盲样为样品进行了试剂比对,试验结果表明:只有A与作业指导书要求的《SC/T7212.1-2011》检测结果完全相同,B和C均未检测出阳性盲样。

关键词锦鲤疱疹病毒;检测;能力测试;试剂盒锦鲤疱疹病毒病,是由锦鲤疱疹病毒(Koi her⁃pevirus,KHV)所引起的致死率80%~100%的流行性疾病,仅感染锦鲤、鲤及其变种[1-4]。

该病被我国列在《一、二、三类动物疫病病种名录》中的二类疫病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的疫病[5]。

1998年,该病首次由德国和以色列学者发现,中国香港于2001年发生首例,随后在印度尼西亚、日本等东南亚国家相继发生,现已流行于世界各地[6-7]。

水产行标《SC/T7212.1-2011》作为此次锦鲤疱疹病毒病病原检测能力测试的依据和实验室检测的主要方法,属于传统聚合酶链式反应(PCR),具有灵敏度高、准确率高等优点,但在实际应用中,需要TK、Sph基因PCR、电泳和产物测序,存在检测时间长、操作繁琐且易污染、不能准确定量等问题。

荧光定量PCR检测耗时短、操作简便、能定量等优点被广泛应用于病原体检测[8-10],越来越多商品化的荧光定量PCR试剂盒被研发出来。

一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒及其检测方法[发明专利]

一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒及其检测方法[发明专利]

专利名称:一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒及其检测方法专利类型:发明专利
发明人:邹红,熊凡,张金,李文祥,吴山功,王桂堂
申请号:CN201610863478.6
申请日:20160928
公开号:CN106350608A
公开日:
20170125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了一种用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列扩增的引物对。

本发明还公开了一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列的扩增方法。

本发明了公开了一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒。

本发明公开了一种荧光定量检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的方法。

本发明能为快速、准确地检测出锦鲤疱疹病毒Ⅲ型提供保证,为预防疾病,科学用药,和保障鱼类健康提供了保障。

依据本发明专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼主要患病组织(肝、脑、肾)TK基因的核酸检测。

申请人:中国科学院水生生物研究所,武汉转导生物科技发展有限公司
地址:430072 湖北省武汉市武昌区东湖南路7号
国籍:CN
代理机构:武汉宇晨专利事务所
更多信息请下载全文后查看。

鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)_检测方法的建立及应用

鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)_检测方法的建立及应用

第39卷第2期大连海洋大学学报Vol.39No.2 2024年4月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr.2024DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-216文章编号:2095-1388(2024)02-0234-07鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用陈曦,杨金先,葛均青∗(福建省农业科学院生物技术研究所,福建福州350003)摘要:为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-ai-ded amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测㊂结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39ħ,反应时间为20min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度㊁特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1ˑ102copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)㊁蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)㊁鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高㊁特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)㊂研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速㊁灵敏㊁可靠㊁准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查㊂关键词:鳗鲡疱疹病毒(AngHV);实时荧光RAA;快速检测中图分类号:S941.41㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)是感染鳗鲡并引起鳗鲡病毒性疾病脱黏败血综合征的高致病性病原[1-2],最早于1990年从养殖的日本鳗鲡(Anguilla japonica)中分离鉴定[3],在全球各个国家和地区均有发现[4-7]㊂自20世纪90年代中国开展鳗鲡规模化养殖以来,该病就在鳗鲡养殖场中常年发生,具有发病率高㊁传染性强和死亡率高等特点[8-9],给养殖者造成了巨大的经济损失[10-11]㊂同时,AngHV在鳗鲡体内存在潜伏感染,使部分病鱼难于从体表症状判断其患病情况[12-13],因此,建立快速有效㊁简便灵敏的AngHV检测方法,对于AngHV的早期诊断和防控具有极其重要的意义㊂AngHV是一种具有囊膜的线性双链DNA病毒[14],隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)鲤疱疹病毒属(Cyp-rinivirus)[15],可感染日本鳗鲡㊁欧洲鳗鲡(A.anguilla)和美洲鳗鲡(A.rostrata)等养殖鳗鲡品种[16]㊂目前,对AngHV的检测主要依赖于实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)[17]㊁PCR[18]等常规分子生物学检测方法,但上述方法对检测人员和设备要求较高,且程序烦琐㊁耗时较长,限制了其在基层的推广应用㊂重组酶辅助扩增(recombi-nase-aided amplification,RAA)是一种利用重组酶㊁单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶等在等温条件下进行核酸扩增的技术㊂该技术的主要原理是重组酶与引物形成复合体,当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时,在单链DNA结合蛋白的帮助下,使模板DNA解链,并在DNA聚合酶的作用下,形成新的DNA互补链,在等温条件下, 15~30min内完成目的DNA的快速扩增[19-20]㊂该技术具有反应快速㊁灵敏度高㊁特异性强及对仪器依赖程度低等优点,特别适用于基层和现场即时检测使用㊂㊀收稿日期:2023-10-09㊀基金项目:福建省公益类科研院所基本科研业务专项(2021R1027007,2023R1081);福建省农业科学院 5511 协同创新工程建设项目(XTCXGC2021013)㊀作者简介:陈曦(1982 ),男,助理研究员㊂E-mail:kobeid@㊀通信作者:葛均青(1977 ),男,博士,研究员㊂E-mail:jqge@㊀㊀前期研究表明,ORF95基因编码AngHV病毒粒子的囊膜结构蛋白[21],序列保守且基因丰度较高[22],适合作为病毒检测的靶位点㊂本研究中,基于ORF95基因保守区序列设计特异性引物和探针,以鳗鲡疱疹病毒DNA为模板,建立了鳗鲡疱疹病毒实时荧光RAA检测方法,并评价其灵敏度㊁特异性和重复性及应用效果,以期为精准防控AngHV提供技术支持㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料鳗鲡疱疹病毒㊁美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)㊁蛙虹彩病毒(Rana gryl-io virus,RGV)㊁鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)及对虾白斑综合征病毒(White spot syn-drome virus,WSSV)基因组DNA均由福建省农科院生物技术研究所保存㊂疑似感染鳗鲡疱疹病毒的鳗鲡组织样品由本课题组于2022 2023年在福建省各鳗鲡养殖场采集并保存㊂主要试剂:2ˑTaq master Mix(Dye Plus)㊁DNA Marker和pCE2-TA/Blunt载体购自诺唯赞(南京)生物科技股份有限公司;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒和血液/细胞/组织DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司; RAA核酸扩增试剂(基础型和荧光型)购自众测(杭州)生物科技股份有限公司㊂引物合成和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成㊂1.2㊀方法1.2.1㊀引物及探针的设计㊀根据AngHV的ORF95序列,利用Lasergene7.1生物学软件,按照RAA 引物设计原则设计引物,同时设计ORF95的PCR 引物,序列和目的片段长度见表1,引物和探针浓度均稀释至10μmol/L使用㊂将AngHV接种于EO 细胞系中,待细胞产生典型病变后,收集细胞,离心取上清液,用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取总DNA㊂以提取的病毒DNA为模板,利用RAA核酸扩增试剂盒(基础性)对候选引物进行RAA扩增,确定获得单一扩增条带后,将其作为实时荧光RAA的候选引物,并根据引物设计相应的检测探针(表1)㊂1.2.2㊀实时荧光RAA方法的扩增条件优化㊀以提取的病毒DNA为模板,利用RAA核酸扩增试剂(荧光型)㊁引物及探针进行实时荧光RAA扩增㊂表1㊀实时荧光RAA和PCR扩增的引物及探针Tab.1㊀Primers and probes used for real-time fluorescence RAA and PCR amplification引物primer序列(5ᶄ-3ᶄ)sequence(5ᶄ-3ᶄ)用途function AngHVRAAF:CTCATAGACTCCACATCTTCCGATCTCATCATCR:TAACACCTCTCAAACTACGACCACGCAGAC实时荧光RAA AngHVRAA-ProbeACACCGCTGCAATTTTCTCCGACCACAA[FAM-dT]C[THF]C[BHQ-dT]GACAGACTGAGATTG-GT/C3-spacerORF95S F:CTCATAGACTCCACATCT PCR R:AACACCTCTCAAACTACG扩增反应体系:荧光缓冲液25μL,上㊁下游引物各2μL,探针0.6μL,DNA模板1μL,ddH2O 16.9μL㊂将上述溶液与冻干酶粉混匀,最后加入激活剂(醋酸镁溶液) 2.5μL,分别在37㊁39㊁42㊁45ħ下反应20min,使用实时荧光定量PCR 仪检测荧光强度,每隔30s采集一次荧光信号,根据荧光信号强度确定最佳反应温度㊂同时,观察荧光信号的起峰和进入平台期时间,确定实时荧光RAA的反应时间㊂1.2.3㊀实时荧光RAA方法的灵敏度检测㊀以提取的病毒DNA为模板,以设计的PCR引物ORF95S-F/ORF95S-R(表1)进行PCR扩增㊂将PCR扩增获得的单一片段产物进行胶回收,参考试剂盒说明书,与含有pCE2-TA/Blunt载体的反应缓冲液在室温下进行连接反应5min,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,利用质粒小量抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取质粒,经PCR鉴定后,对阳性克隆测序[生工生物工程(上海)股份有限公司]验证,获得质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S;用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度,用DNA/RNA Copy Number Calcula-tor(/bio/dnacopynum. php)计算每μL提取DNA样品中质粒的拷贝数,并作为标准品,置于-80ħ超低温冰箱中保存备用㊂以梯度稀释的阳性质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S为模板,利用RAA核酸扩增试剂(荧光型)与筛选后的引物及探针进行实时荧光RAA检测,分析所能检测的最低鳗鲡疱疹病毒浓度㊂1.2.4㊀实时荧光RAA方法的特异性检测㊀将保存的AngHV㊁AEAdoV㊁RGV和KHV菌株分别接种于细胞中,待多数细胞发生典型细胞病变后,收集细胞,提取病毒DNA,以此DNA为模板,以上述532第2期陈曦,等:鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用质粒pCE2-TA /Blunt-ORF 95S 为阳性对照,ddH 2O 为阴性对照,用建立的实时荧光RAA 方法进行检测,评价检测方法的特异性㊂1.2.5㊀实时荧光RAA 检测方法的重复性检测㊀分别取浓度为1ˑ104㊁1ˑ105㊁1ˑ106copies /μL 的阳性标准品重组质粒pCE2-TA /Blunt-ORF 95S 作为模板进行实时荧光RAA 检测,每个浓度设置3个重复,根据阈值循环数(cycle threshold value,C T )的变异系数分析实时荧光RAA 的组内重复性;重复试验3次,分析其组间重复性㊂1.2.6㊀实时荧光RAA 检测方法的应用㊀取本实验室采集并保存的疑似鳗鲡脱黏败血综合征病料组织样品25份,提取其总DNA,以DNA 为模板,用建立的实时荧光定量qPCR 检测方法确认AngHV 的感染情况[17],用建立的实时荧光RAA 和普通PCR 方法进行检测,比较各组织样品鳗鲡疱疹病毒的检出情况,计算阳性样品检出率㊂2㊀结果与分析2.1㊀引物设计及靶序列扩增利用设计的引物对AngHV RAA-F /R,从AngHV 基因组中扩增出约240bp 的单一条带(图1(a)),经测序验证,确定其为目标序列,以此设计相应探针(表1,图1(b)),用于后续构建实时荧光RAA 检测方法㊂M DL600DNA marker;N 阴性对照;1 目的片段㊂M DL600DNA marker;N negative control;1 target fragment.图1㊀AngHV 的RAA 靶序列扩增Fig.1㊀Amplification of target sequence of RAA in AngHV2.2㊀反应条件的优化和确立利用引物对AngHV RAA-F /R 和探针AngHVRAA-Probe,在不同温度下进行实时荧光RAA 检测㊂结果显示,在39ħ条件下,实时荧光RAA 反应可获得最高荧光吸收值;在所有温度条件下,从第10个循环(5min)开始出现稳定阳性信号;在39㊁42ħ条件下,从第30个循环(15min)进入荧光信号采集平台期(图2)㊂为确保反应充分,后续试验以39ħ作为最优反应温度,以40个循环(20min)作为最优反应时间㊂图2㊀不同温度条件下AngHV 的实时荧光RAA Fig.2㊀Real-time fluorescence RAA in AngHV underdifferent temperature conditions632大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷2.3㊀实时荧光RAA 方法的灵敏度检测以10倍倍比稀释的pCE2-TA /Blunt-ORF 95S 为模板进行实时荧光RAA 检测㊂结果显示:1ˑ107~1ˑ105copies /μL 的病毒,从第10个循环开始出现稳定阳性信号;1ˑ104~1ˑ102copies /μL 的病毒,从第20个循环开始出现始稳定阳性信号;而1ˑ101copies /μL 的病毒及阴性对照,在40个循环内均无明显的扩增信号(图3)㊂因此,实时荧光RAA 方法的最低AngHV 检测量为1ˑ102copies /μL㊂1~7依次为1ˑ107~1ˑ101copies /μL 的重组质粒;N 阴性对照(以ddH 2O 为模板)㊂1-7represent recombinant plasmids ranging from 1ˑ107-1ˑ101copies /μL;N represents negative control (ddH 2O as template).图3㊀AngHV 实时荧光RAA 方法的灵敏度检测Fig.3㊀Sensitivity of real-time fluorescence RAA assayfor detection of AngHV2.4㊀实时荧光RAA 方法的特异性检测利用常见的水产动物病毒株进行特异性检测,结果显示,仅AngHV 和阳性质粒pCE2-TA /Blunt-ORF 95S 出现扩增曲线,而AEAdoV㊁RGV㊁KHV㊁WSSV 和阴性对照均未出现扩增曲线(图4)㊂这表明,该实时荧光RAA 检测方法对AngHV 具有较好的特异性,且与AEAdoV㊁RGV㊁KHV 和WSSV等无交叉反应㊂1 AngHV;2 pCE2-TA /Blunt-ORF 95S;3 AEAdoV;4RGV;5 KHV;6 WSSV;N 阴性对照(以ddH 2O 为模板)㊂1 AngHV;2 pCE2-TA /Blunt-ORF 95S;3 AEAdoV;4 RGV;5 KHV;6 WSSV;N negative control (ddH 2O as template).图4㊀AngHV 实时荧光RAA 方法的特异性检测Fig.4㊀Specificity of real-time fluorescence RAA assayfor detection of AngHV2.5㊀实时荧光RAA 方法的重复性检测用1ˑ106㊁1ˑ105㊁1ˑ104copies /μL 3个浓度的阳性标准品分别进行实时荧光RAA 的重复性检测㊂结果显示:3个浓度样品的组内变异系数均小于5%,分别为1.7%㊁3.4%㊁4.4%;组间变异系数同样小于5%,分别为1.4%㊁ 2.9%和4.8%(表2)㊂这表明,该检测方法重复性好,可保证检测结果的稳定性和可靠性㊂表2㊀AngHV 实时荧光RAA 检测的重复性Tab.2㊀Repeatability of real-time fluorescence RAA assay for detection of AngHV质粒浓度/(copies㊃μL -1)plasmid concentration组内变异系数coefficient of variation in the groups组间变异系数coefficient of variation among the groups组内C T 值C T value in the group变异系数/%coefficient of variation组间C T 值C T value among the groups变异系数/%coefficient of variation1ˑ106 5.82ʃ0.10 1.7 5.76ʃ0.081 1.41ˑ1057.50ʃ0.25 3.47.73ʃ0.230 2.91ˑ1048.81ʃ0.394.48.48ʃ0.4104.82.6㊀实时荧光RAA 检测方法的应用利用前期建立的qPCR 方法对收集的25个鳗鲡脱黏败血综合征病料样品进行检测,共检出AngHV 阳性样品23个,阴性样品2个㊂进一步用实时荧光RAA 和普通PCR 方法对样品进行检测,结果显示,实时荧光RAA 的检测结果与qPCR 的检测结果一致,阳性检出数均为23个,而普通PCR 的阳性检出数为19个,普通PCR 的阳性检出率(76%)明显低于实时荧光RAA 的检出率(92%)(表3)㊂732第2期陈曦,等:鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA )检测方法的建立及应用表3㊀AngHV实时荧光RAA的应用Tab.3㊀Application of real-time fluorescence RAA assay for detection of AngHV方法method 阳性样品检出数量detection numberof the positive阳性检出率/%detection rateof the positive实时荧光RAA2392 qPCR2392PCR19763㊀讨论3.1㊀建立实时荧光RAA检测方法的依据由AngHV感染所引起的脱黏败血综合征是鳗鲡黑仔和幼鳗阶段发生率最高㊁危害严重的传染性疾病[8,10],病鳗常出现皮肤脱黏㊁红头㊁烂鳃和败血等症状,严重威胁着鳗鲡养殖业的发展[11]㊂AngHV的一个重要特征是可形成潜伏感染,此时病毒在鱼体中的载量较低,并不会引起典型的临床症状[5,12]㊂因此,对AngHV进行快速㊁灵敏和准确的检测,尽快采取积极的防控措施,是降低AngHV感染的关键环节,也是避免引入潜伏感染苗种的重要保障㊂目前,AngHV核酸分子检测技术主要依赖于PCR和qPCR[17-18],但上述方法对设备和操作有较高的要求,且耗时较长㊂RAA作为一种新型的核酸扩增技术,与PCR技术相比,可在35~45ħ的恒温条件下进行扩增,一般在30min内即可获得结果,且不需要昂贵的变温热循环仪,操作相对简单[19-20]㊂因此,RAA技术在食品安全[23]㊁病原微生物检测[24]等方面均具有广泛的应用潜力㊂在水生动物的疫病检测方面,Kanitchinda等[25]将该技术应用在虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)的检测上,Wang等[26]建立了针对草鱼呼肠孤病毒(grass carpreo virus,GCRV)的实时荧光RAA 检测方法,杨惠源等[27]建立了鰤诺卡氏菌(No-cardia seriolae)的RAA检测方法㊂上述工作为在AngHV上实现实时荧光RAA的检测提供了可靠的参考依据㊂3.2㊀实时荧光RAA检测方法的影响因素靶序列选择是影响实时荧光RAA检测效率和特异性的主要决定因素㊂前期研究表明,AngHV 病毒粒子由核衣壳㊁间质层和囊膜组成[22],囊膜蛋白与病毒入侵宿主细胞等密切相关[28]㊂在编码病毒囊膜蛋白的基因中,ORF95基因丰度相对较高[22],且在不同AngHV毒株间的序列保守性较强[29],因此,本研究中设计的引物和探针,以ORF95基因的保守区序列为模板㊂在对检测方法的优化中,本研究中确认了AngHV实时荧光RAA 反应的最佳温度为39ħ,且5min左右即开始出现稳定荧光信号,15min可到达荧光信号采集平台期㊂这表明,AngHV的实时荧光RAA检测方法所需时间较短㊂需要注意的是,由于反应速率快,在充分混匀各组分后,应尽快置入仪器采集荧光信号,避免错过起峰时间而直接进入荧光信号采集平台期,从而造成结果误判[30]㊂灵敏度是影响病毒早期诊断结果的一个重要因素㊂病毒性疾病一般在暴发之前,存在一个低水平感染的积累期㊂高灵敏的方法可以更早地检测到病毒感染,以便尽早地进行预警㊂本研究中建立的AngHV实时荧光RAA检测方法最低可以检测到1ˑ102copies/μL病毒,其灵敏度为普通PCR的100倍,因此,可在较低感染水平上检测出AngHV㊂同时,实时荧光RAA对AngHV具有良好的特异性,对几种常见的水生动物DNA病毒无交叉反应㊂该检测方法的重复性较佳,组间和组内变异系数均小于5%㊂上述结果表明,实时荧光RAA检测方法具有较高的可靠性㊂而在临床样品的应用检测中,实时荧光RAA的阳性检出率(92%)远高于普通PCR的检出率(76%)㊂加上实时荧光RAA在操作性能方面具有的优势,如反应体系所需的酶均以冻干粉形式保存,方便运输;反应不需要精确的热循环,只需要有限的设备支持,如便携式迷你离心机㊁水/金属浴和小型荧光采集仪等,因此,该检测方法更加适合基层或简易实验室对AngHV的快速检测㊂4㊀结论1)本研究中根据AngHV的ORF95基因序列,通过引物设计㊁反应温度优化及反应时间确定,建立了AngHV的实时荧光RAA检测方法,该方法的阳性检出率远高于普通PCR,与实时荧光PCR的检出率相当㊂2)实时荧光RAA检测方法最佳反应温度为39ħ,可在20min内得到检测结果,对AngHV的最低检测量为1ˑ102copies/μL,且特异性强㊁重复性好,对于临床样品的检出率高,可用于AngHV 的临床快速检测㊂832大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷参考文献:[1]㊀葛均青,杨金先,龚晖,等.鳗鲡疱疹病毒的分离与鉴定[J].水产学报,2014,38(9):1579-1583.㊀㊀㊀GE J Q,YANG J X,GONG H,et al.Isolation and identification ofa herpesvirus from cultured European eels Anguilla anguilla inChina[J].Journal of Fisheries of China,2014,38(9):1579-1583.(in Chinese)[2]㊀杨金先,李英英,陈强,等.美洲鳗鲡 脱黏败血综合征 病原的分离鉴定及其致病性研究[J].中国预防兽医学报,2023,45(2):138-143.㊀㊀㊀YANG J X,LI Y Y,CHEN Q,et al.Isolation,identification and pathogenicity of the pathogen of mucus sloughing and hemorrhagic septicemia disease in American eel,Anguilla rostrata[J].Chi-nese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2023,45(2):138-143.(in Chinese)[3]㊀SANO M,FUKUDA H,SANO T.Isolation and characterization of anew herpesvirus from eel[M]//Pathology in marine science.Am-sterdam:Elsevier,1990:15-31.[4]㊀CHANG P H,PAN Y H,WU C M,et al.Isolation and molecularcharacterization of herpesvirus from cultured European eels Anguil-la anguilla in Taiwan[J].Diseases of Aquatic Organisms,2002, 50(2):111-118.[5]㊀JAKOB E,NEUHAUS H,STEINHAGEN D,et al.Monitoring ofHerpesvirus anguillae(HVA)infections in European eel,Anguilla anguilla(L.),in northern Germany[J].Journal of Fish Diseases, 2009,32(6):557-561.[6]㊀KIM H J,YU J H,KIM D W,et al.Molecular evidence of anguillidherpesvirus-1(AngHV-1)in the farmed Japanese eel,Anguilla ja-ponica Temminck&Schlegel,in Korea[J].Journal of Fish Disea-ses,2012,35(4):315-319.[7]㊀MCCONVILLE J,FRINGUELLI E,EVANS D,et al.First examina-tion of the lough neagh European eel(Anguilla anguilla)popula-tion for eel virus European,eel virus European X and Anguillid herpesvirus-1infection by employing novel molecular techniques [J].Journal of Fish Diseases,2018,41(12):1783-1791. [8]㊀樊海平.养殖美洲鳗鲡的主要疾病与防治[J].台湾海峡,1998,17(4):477-481.㊀㊀㊀FAN H P.Diseases prevention and treatment of cultured American eel,Anguilla rostrata[J].Journal of Oceanography in Taiwan Strait,1998,17(4):477-481.(in Chinese)[9]㊀樊海平,杨明,张蕉霖,等.鳗鲡疱疹病毒的流行情况与控制技术[J].科学养鱼,2019(8):46-48.㊀㊀㊀FAN H P,YANG M,ZHANG J L,et al.Epidemic situation and control technique for anguillid herpesvirus HVA[J].Scientific Fish Farming,2019(8):46-48.(in Chinese)[10]㊀樊海平.鳗鲡病害发生的现状及防治关键[J].科学养鱼,2000(5):5-6.㊀㊀㊀FAN H P.Current situation and control key of eel diseases[J].Scientific Fish Farming,2000(5):5-6.(in Chinese) [11]㊀陈强,李英英,杨金先,等.鳗鲡疱疹病毒对欧洲鳗鲡的致病性[J].水产学报,2021,45(6):940-947.㊀㊀㊀CHEN Q,LI Y Y,YANG J X,et al.Pathogenicity of anguillid her-pesvirus to Anguilla anguilla[J].Journal of Fisheries of China,2021,45(6):940-947.(in Chinese)[12]㊀VAN NIEUWSTADT A P,DIJKSTRA S G,HAENEN O.Persist-ence of herpesvirus of eel Herpesvirus anguillae in farmed Europe-an eel Anguilla anguilla[J].Diseases of Aquatic Organisms,2001,45:103-107.[13]㊀HANSON L,DISHON A,KOTLER M.Herpesviruses that infectfish[J].Viruses,2011,3(11):2160-2191.[14]㊀DAVIDSE A,HAENEN O L M,DIJKSTRA S G,et al.First isola-tion of herpesvirus of eel(Herpesvirus anguillae)in diseased Eu-ropean eel(Anguilla anguilla L.)in Europe[J].Bulletin of theEuropean Association of Fish Pathologists,1999,19(4):137-141.[15]㊀DAVISON A J,EBERLE R,EHLERS B,et al.The order Herpes-virales[J].Archives of Virology,2009,154(1):171-177. [16]㊀杨金先,陈强,李英英,等.鳗鲡疱疹病毒的生物学及理化特性[J].水产学报,2020,44(9):1435-1440.㊀㊀㊀YANG J X,CHEN Q,LI Y Y,et al.Biological and physicochemi-cal characteristics of anguillid herpesvirus[J].Journal of Fisher-ies of China,2020,44(9):1435-1440.(in Chinese) [17]㊀李英英,杨金先,陈曦,等.鳗鲡疱疹病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].水产学报,2021,45(5):769-777.㊀㊀㊀LI Y Y,YANG J X,CHEN X,et al.Establishment and application of SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative PCR fordetection of anguillid herpesvirus[J].Journal of Fisheries of Chi-na,2021,45(5):769-777.(in Chinese)[18]㊀葛均青,杨金先,李友娟,等.鳗鲡病毒性疾病病料中鳗鲡疱疹病毒的PCR检测[J].福建农业学报,2012,27(9):961-964.㊀㊀㊀GE J Q,YANG J X,LI Y J,et al.Polymerase chain reaction for the detection of herpesvirus anguillae in eel viral disease samples[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences,2012,27(9):961-964.(in Chinese)[19]㊀PIEPENBURG O,WILLIAMS C H,STEMPLE D L,et al.DNAdetection using recombination proteins[J].PLoS Biology,2006,4(7):e204.[20]㊀吕蓓,程海荣,严庆丰,等.用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸[J].中国科学:生命科学,2010,40(10):983-988.㊀㊀㊀LÜB,CHENG H R,YAN Q F,et al.Recombinase-aid amplifica-tion:a novel technology of in vitro rapid nucleic acid amplification[J].Scientia Sinica(Vitae),2010,40(10):983-988.(in Chi-nese)[21]㊀CHEN X,YANG J X,LI Y Y,et al.Anguillid herpesvirus1(An-gHV)ORF95encodes a late,structural envelope protein[J].Vi-rus Genes,2021,57(3):280-283.[22]㊀VAN BEURDEN S J,LEROY B,WATTIEZ R,et al.Identifica-tion and localization of the structural proteins of anguillid herpes-virus1[J].Veterinary Research,2011,42:105. [23]㊀曹丙蕾,王群,刘敏,等.重组酶聚合酶扩增技术在动物源性食品检测中的应用[J].食品科技,2022,47(8):312-316.㊀㊀㊀CAO B L,WANG Q,LIU M,et al.Application of recombinant en-zyme polymerase amplification technology in the detection of ani-932第2期陈曦,等:鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用mal derived food[J].Food Science and Technology,2022,47(8):312-316.(in Chinese)[24]㊀马巧妮,王萌,朱兴全.重组酶介导扩增技术及其在病原微生物快速检测中的应用进展[J].中国生物工程杂志,2021,41(6):45-49.㊀㊀㊀MA Q N,WANG M,ZHU X Q.Research advances in recombi-nase-aided amplification technology and its application in rapiddetection of pathogenic microorganisms[J].China Biotechnology,2021,41(6):45-49.(in Chinese)[25]㊀KANITCHINDA S,SRISALA J,SUEBSING R,et al.CRISPR-Casfluorescent cleavage assay coupled with recombinase polymeraseamplification for sensitive and specific detection of Enterocytozoonhepatopenaei[J].Biotechnology Reports,2020,27:e00485. [26]㊀WANG H,ZHOU S T,WEN J X,et al.A real-time reverse-tran-scription isothermal recombinase polymerase amplification assayfor the rapid detection of genotype III grass carp(Ctenopharyng-odon idella)reovirus[J].Journal of Virological Methods,2020,277:113802.[27]㊀杨惠源,陈国权,温依铭,等.重组酶介导等温扩增技术检测鰤鱼诺卡氏菌方法的建立[J].大连海洋大学学报,2023,38(1):104-111.㊀㊀㊀YANG H Y,CHEN G Q,WEN Y M,et al.Establishment of a recombinase-aided amplification(RAA)assay for detection ofNocardia seriolae[J].Journal of Dalian Ocean University,2023,38(1):104-111.(in Chinese)[28]㊀BRIDEAU A D,ENQUIST L W,TIRABASSI R S.The role of vi-rion membrane protein endocytosis in the herpesvirus life cycle[J].Journal of Clinical Virology,2000,17(2):69-82. [29]㊀DONOHOE O,ZHANG H Y,DELREZ N,et al.Genomes of an-guillid herpesvirus1strains reveal evolutionary disparities and lowgenetic diversity in the genus Cyprinivirus[J].Microorganisms,2021,9(5):998.[30]㊀施奕,徐昌平,余蓓蓓,等.重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J].病毒学报,2020,36(3):522-532.㊀㊀㊀SHI Y,XU C P,YU B B,et al.Research progress in recombinase polymerase amplification(RPA)[J].Chinese Journal of Virolo-gy,2020,36(3):522-532.(in Chinese)Development and application of a real-time fluorescence recombinase-aided amplification method for detection of Anguillid herpesvirusCHEN Xi,YANG Jinxian,GE Junqing∗(Institute of Biotechnology,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou350003,China) Abstract:In order to establish a real-time fluorescence recombinase-aided amplification(RAA)method for detec-tion of Anguillid herpesvirus(AngHV),a primer pair and probe targeting ORF95sequence of AngHV was de-signed,followed by optimizing the reaction temperature and fixing the reaction time.The results showed that the es-tablished real-time fluorescence RAA had optimal reaction temperature of39ħ,with the reaction time of20min. The further evaluation of sensitivity,specificity,and repeatability showed that the detection method had the mini-mum AngHV detection concentration of1ˑ102copies/μL and had high specificity on AngHV,and showed no cross amplification reaction with American eel adomavirus(AEAdoV),Rana grylio virus(RGV),Koi herpesvirus (KHV),and White spot syndrome virus(WSSV).There was less than5%of co-efficiency of variation within and between groups for the method which was then applied to analyse25collected samples.It was found that the detec-tion rate of the real-time fluorescence RAA was consistent with that by qPCR of92%,but much higer than PCR with the detection rate of76%.These results revealed that the established RAA method for detection of AngHV was rapid,sensitive,reliable,and accurate,which is used for rapid clinical detection and conducting epidemiological investigations on AngHV.Key words:Anguillid herpesvirus(AngHV);real-time fluorescence recombinase-aided amplification;rapid de-tection042大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷。

【CN110218815A】检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒及其检验方法【专利】

【CN110218815A】检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒及其检验方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910147262.3(22)申请日 2019.02.27(66)本国优先权数据201820294563.X 2018.03.02 CN(71)申请人 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心地址 518033 广东省深圳市福田区福强路1011号申请人 金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司(72)发明人 刘莹 黄建德 温智清 刘荭 何燕华 贾鹏 段雪昆 郑晓聪 邱莞思 王津津 林成贤 (74)专利代理机构 隆天知识产权代理有限公司72003代理人 陈曦 向勇(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒及其检验方法(57)摘要本发明提供一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒,适用于聚合酶连锁反应,试剂盒包含引物对,引物对包含如序列辨识编号1所示的正向引物和序列辨识编号2所示的反向引物。

本发明另提供一种利用上述试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的检验方法。

由此,可以快速且特异性地自待测样本中检测锦鲤疱疹病毒。

权利要求书1页 说明书7页序列表2页 附图6页CN 110218815 A 2019.09.10C N 110218815A权 利 要 求 书1/1页CN 110218815 A1.一种检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒,其特征在于,包含:一引物对,包含:一序列辨识编号1所示的正向引物;以及一序列辨识编号2所示的反向引物。

2.如权利要求1所述的检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒,其中,更包含一接样环组件,用以将一待测样本转移至一试验管中。

3.如权利要求2所述的检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒,其中,更包含一阳性对照组核酸干粉。

4.如权利要求1所述的检测锦鲤疱疹病毒的试剂盒,其中,更包含一如序列辨识编号3所示的荧光探针。

5.一种检测锦鲤疱疹病毒的检验方法,其特征在于,包含:提供一待测样本作为一模版;将该模板以权利要求1所述的试剂盒进行一聚合酶连锁反应,以获得一聚合酶连锁反应产物;以及侦测该聚合酶连锁反应产物的分子量大小是否92bp。

一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法

一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法

一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法薛中仪;朱春艳;王瑶;吴霆【摘要】鲤科疱疹病毒Ⅱ型是异育银鲫重大疫病病原,该病毒引发的异育银鲫鳃出血病(大红鳃病)能导致养殖生产巨大经济损失,为满足水产疫病预防与诊断需求,本文建立了一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法,旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法.【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2015(036)007【总页数】4页(P45-48)【关键词】异育银鲫;疱疹病毒;鳃出血病;PCR快速检测【作者】薛中仪;朱春艳;王瑶;吴霆【作者单位】宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800【正文语种】中文【中图分类】S943一种鲤科疱疹病毒II型的PCR快速检测方法薛中仪,朱春艳,王瑶,吴霆(宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应225800)摘要:鲤科疱疹病毒Ⅱ型是异育银鲫重大疫病病原,该病毒引发的异育银鲫鳃出血病(大红鳃病)能导致养殖生产巨大经济损失,为满足水产疫病预防与诊断需求,本文建立了一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法,旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法。

关键词:异育银鲫;疱疹病毒;鳃出血病;PCR快速检测中图分类号:S943文献标志码:A文章编号:1004-2091(2015)07-0045-04doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2015.07.010资助项目:江苏省水产病害测报项目(2015);国家大宗淡水鱼产业技术体系建设(CARS-46-31)作者简介:薛中仪(1987-),女,助理工程师,在读在职研究生,研究方向:水产养殖与病害防控. E-mail:***************,通信作者:吴霆(1975-),男,高级工程师. E-mail:****************1 前言鲤科疱疹病毒II型(CyHV-2)是水生动物疫病的重要病原,传统宿主是金鱼,Jung等[1]于1995年首次报道了CyHV-2,该病毒引起的病害给日本金鱼养殖业造成了巨大的经济损失,根据其病理学特征而被命名为疱疹病毒性造血器官坏死病毒。

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因乌日琴;刘中勇;黄宝春【期刊名称】《检验检疫学刊》【年(卷),期】2005(015)002【摘要】[目的] 建立锦鲤疱疹病毒的PCR检测方法,并提高检测的准确率和简化操作程序.[方法] 分别利用蛋白酶K-酚/氯仿抽提、异硫氰酸胍(GuScN)抽提法从组织样品中提取KHV病毒DNA,并设计两对特异性引物进行PCR检测.[结果] 异硫氰酸胍抽提法可以有效地去除样品中的影响因素,而蛋白酶K-酚/氯仿抽提法提取的DNA中不能检测到病毒的DNA片段.同时评价了两对特异性引物,选择灵敏性高和操作简便的引物PQDS和PQDV作为快速检测的引物.[结论] 本实验初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法.【总页数】3页(P6-8)【作者】乌日琴;刘中勇;黄宝春【作者单位】广州白云机场出入境检验检疫局;广东出入境检验检疫局;广州白云机场出入境检验检疫局【正文语种】中文【中图分类】S9【相关文献】1.多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型 [J], 李荔枝;张军;胡萍;周国君;王晓静;朱建荣2.快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的PCR方法学评价 [J], 陈宇明;胡婷婷;倪洁;王蓓;蒋晓飞;关明;徐峰;刘维薇3.快速检测肺炎链球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用 [J], 侯艳娇;罗欲承;邵晨;倪颖;邵世和4.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄5.利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因 [J], 孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
a Re a l - Ti me P CR t e s t wa s d e s i g n e d t h r o u g h s p e c i i f c p r i me r s d e s i g n e d t o t a r g e t KHV S ph g e n e . Un d e r t h e o p t i mi z e d r e a c t i o n c o n d i t i o n s . t h e r e s u l t s s h o we d t h a t t h i s me t h o d wa s s p e c i ic f or f l a t e n t d e t e c t i o n o f KHV wi t h o u t c r o s s r e a c t i o n t o
关 键 词 :锦鲤疱疹病毒( { v ) ; 潜伏感染;实时荧光定量 P C R( R e a l — T i m e P C R ) 中图分类号 :¥ 9 4 1 . 4 1 文献标志码 :A 文章编号: 1 0 0 7 — 1 0 3 2 ( 2 0 1 7 ) 0 3 — 0 3 1 0 — 0 5
Me t ho d o f Re a l -Ti me PCR f o r t he de t e c t i n g l a t e n t i n f e c t i o n o f ko i he r pe s v i r us
C H E N J u n j i e , L I Y u a n y u a n , Y A NGR u i x u e , G U J i n g j i n g , WA NGKa i y u , G E NGYi , O U Y A NGP i n g
( C o l l e g e o f V e t e r i n a r y Me d i c i n e , S i c h u a n Ag ri c u l t u r a l Un i v e r s i y t , C h e n g d u 6 1 1 1 3 0 , C h i n a ) Ab s t r a c t : T o e s t a b l i s h a r a p i d , s e n s i t i v e a n d s p e c i i f c a p p r o a c h f o r n f e c t i o n o f k o i He r p e s v i r u s ( K HV) ,
o t h e r i f s h p a t h o g e n i c v i r u s e s , i n c l u d i n g c a r p p o x h e r p e s v i r u s ( C y H V— 1 ) , g o l d i f s h h e pe r s v i us r ( C y H V- 2 ) a n d e e l h e pe r s v i r u s ( A n g HV - 1 ) . T h e l o we s t l i mi t a t i o n o f d e t e c t i o n c o n c e n t r a t i o n b y Re a l - T i me P C R wa s 4 2 c o p i e s p e r 1 u L . A t o t a l o f
投稿 网址 :h t  ̄: # x b . h u n a u . e d u . c n
锦鲤疱疹病毒潜伏 感染实 时荧光定量 P CR检 测方法 的建立
陈俊杰 ,李媛媛 ,阳瑞雪 ,古 晶晶,汪开毓 ,耿毅 ,欧阳萍
( 四川农业大学动物 医学 院 ,四川 成都 6 1 1 1 3 0 )
湖南农业大学学报( 自然科学版) 2 0 1 7 , 4 3 ( 3 ) : 3 1 0 — 3 1 4 . D OI : 1 0 . 1 3 3 3 1 / j . c n k i . j h a u . 2 0 1 7 . 0 3 . 0 1 6
J o u r n a l o f H u n a n Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y( N a t u r a l S c i e n c e s )
摘 要 :为建立一种特异 和敏感 的检 测锦鲤疱 疹病 毒( k o i h e r p e s v i r u s ,K H V ) 潜伏感染 的方法 ,以 K I t V S p h 基因
为靶序列设计特 异性 引物 ,通过条件优化建立 R e a l - T i me P C R检测 方法 ,并且对该方法进行特异性和敏感性评估 及 临床样 品应用 研究 。结果显示 :建立 的方法与鲤痘疱疹病毒 、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鲡疱疹病毒均无交 叉 反应 ,特异性 强 ;最低检出率为 4 2拷贝/ ,灵敏度高 。用本方法对 6 3份临床样 品进行检测 ,有锦鲤疱疹病 毒 病( KH VD ) 病史 的 1 8份样 品的检测结果全为 阳性 ,阳性率 为 1 0 0 %; 从有 临床症 状的鱼中得 到的 1 5 份样 品的检 测 结果全为阳性 ,阳性率为 1 0 0 %;3 0份无任何 临床症状鱼 中的 6 份被检测 为阳性 ,阳性 率为 2 0 %。本试验 中建 立的水生动物疱 疹病毒潜伏感染快速检测方法 ,可为潜伏感染 K HV 的临床检测提供一种快速 、敏感和特异 的检 测手段 ,可为 KH V D 的分子流行病学调查 和预防提供参考 。
相关文档
最新文档