我国分子细胞工程技术培育超细毛羊的研究

欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀欀氈氈氈氈专题论述我国分子细胞工程技术培育超细毛羊的研究石国庆，万鹏程，代蓉，杨永林，倪建宏（新疆农垦科学院院畜牧兽医所，新疆石河子832000）摘要：通过对中国美利奴细毛羊12年的持续研究，利用传统育种手段结合分子育种技术，组装应用现代动物生殖工程技术，建立了一套细毛羊品系培育的分子改良技术路线，完善和丰富了我国细毛羊的种群结构。

同时，新品系培育丰富了我国细毛羊种质遗传多样性，也为改良低产低质细毛羊品种提供了优质育种素材，对于提高我国细毛羊生产水平，确保我国养羊生产的国际领先地位和竞争优势具有重要意义。

关键词：分子细胞工程；超细毛羊；育种中图分类号：S813.3文献标志码：A文章编号：0529－5130（2014）12－0097－05利用传统育种手段结合分子育种技术，组装应用现代动物生殖工程技术，建立一套细毛羊品系培育的分子改良技术路线是一件非常有意义的工作，我们通过对中国美利奴细毛羊12年的持续研究，利用现有的地方优良品种、引进品种和培育品种，通过综合利用基因筛选、标记基因辅助育种、胚胎移植、内窥镜子宫角输精、体外胚胎生产及体细胞克隆等分子细胞工程育种技术结合细毛羊科学化饲养管理及羊毛现代化管理等综合配套技术在超细毛羊的培育和产业化应用上取得了较大的突破，为改良低产低质细毛羊品种提供了优质育种素材，对于提高我国细毛羊生产水平，确保我国养羊生产的国际领先地位和竞争优势具有重要意义。

1中国美利奴细毛羊的选育措施和回顾1.1组建细毛羊育种核心群在对不同性别、年龄、场群的羊毛细度、长度和产量，以及繁殖率和产毛时间调查基础上，分别在新疆农垦科学院实验种羊场、新疆紫泥泉种羊场、兵团农四师、农五师相关农牧团场种羊场等细毛羊生产单位组建育种基础群及生产群，培育超细型细毛羊新品系育种群2850只，生产群12750只。

1.2超细毛羊胚胎的引进与种羊培育为进一步提高中国美利奴超细毛羊品系的羊毛品质，课题研究在延续多年研究成果的基础上，分别于1999年、2002年、2009年和2011年度从引进超细毛羊胚胎600枚，通过胚胎移植技术获得超细毛羊纯收稿日期：2014－02－17基金项目：科技部863项目（2011AA100307－06）；科技支撑计划（2011BAD28B05－1－1）；国家绒毛用羊产业技术体系（CAＲS －40－07）；新疆兵团科技攻关（2011BA006）；科技部星火项目（2012GA891001）；科技部自然基金：（31360540）作者简介：石国庆（1959－），男，研究员，博士，从事动物育种与繁殖研究种后代共计218只，其中公羊112只，经过多年选种选育和纯繁扩繁，目前已累计培育出超细毛羊种公羊562只，并广泛推广应用于国内多个种羊繁育场。

1.3育种信息管理系统建设利用新疆紫泥泉种羊场2001—2007年的生产性能测定记录和系谱记录（其中主要包括：产羔记录、断乳记录、产毛记录、鉴定记录、配种繁殖记录以及羊群保健和畜群周转记录等），建立了如下5个数据库：超细毛羊育种信息库、用户数据库和羊场信息数据库，进而开发了“新疆兵团超细毛羊育种信息管理系统”。

目前，该信息管理系统已基本在兵团农四师、农五师部分细毛羊种羊场推广实施，结合现代计算机信息管理技术实现了育种档案的电子化管理，极大提高了选种选育的效率，也为从事优良种群的系谱档案管理提供了永久记录。

1.4超细毛羊羊毛性状主效基因筛选及辅助标记基因选育研究对超细毛羊的主要经济形状（超细毛羊羊毛细度和产毛量）进行分子标记，发现角蛋白关联蛋白K20基因多态性可能是超细毛羊羊毛细度的一个分子标记。

对羊毛产毛性状有影响的KAP 基因家族的KAP1.3、KAP6.1和KAP6.2基因进行了PCＲ－SSCP 检测，检测样本数420份，并进行了基因型分析，在此基础上对多态片段进行了克隆测序，通过序列分析，结合毛用性状的检测开展了与主要产毛性状指标产毛量、剪毛后体重、毛长、细度等的相关分析。

已发现部分未见报道的多态位点，序列分析表明其中有引起氨基酸序列变化的突变位点；在与毛用性状的相关分析中也发现部分突变位点有作为分子标记的可能。

对高甘氨酸酪氨酸蛋白（HGTP ，KAP6、KAP7和KAP8）基因在中国美利奴细毛羊和哈萨克羊皮肤组织中的表达进行了分析，并向GenBank 提交后获得KAP7的3个序列号（JN639007，JN707699，JN707700），其他关于KAP6和KAP8尚有14个序列在审核中，还有3个序列准备申请专利，研究内容及论文发表在准备之中。

本研究还利用DDＲT－PCＲ、基因芯片技术筛选与羊毛细度有关的侯选基因。

发现了一批差异表达基因。

完成芯片杂交试验和差异表达基因筛选的基础上，2010年初随机选取了5个基因用定量PCＲ对芯片结果进行了验证，在5个基因中仅有1个与芯片结果不一致，其余4个与芯片结果一致，其说明了芯片结果的可靠性。

1.5高繁殖力主效基因的分子标记辅助育种应用分别对新疆紫泥泉的超细毛羊高繁性能进行分子遗传标记辅助育种选择，利用已经确定的调控细毛羊多胎性状的FecB基因为标记基因，通过分子标记辅助育种技术结合常规选种选育组建了带有多胎基因的细型与超细型细毛羊群体分别达到2280只和650只。

目前多胎基因检测的效率可以达到90%以上，极大提高了多胎细毛羊品系的培育效率。

1.6绵羊发育相关基因的研究与应用GDF8是肌肉生长抑制因子，其基因的突变可能导致GDF8的失活，造成肌肉肥大。

通过PCＲ－ＲFLP、PCＲ产物直接测序和克隆测序等技术方法，对4个绵羊品种（中国美利奴、湖羊、萨福克和）中参与肌肉发育调控的GDF8基因中一个单碱基突变（SNP）进行了检测，结果在4个绵羊品种中皆未发现GDF8基因的SNP突变情况。

1.7细毛羊毛品质相关基因的克隆及毛囊特异表达载体的构建利用转基因技术成功克隆绵羊KAP6.1基因并构建KAP6.1基因的真核表达载体，通过将重组质粒瞬时转染细胞获得转基因细胞系用于生产转基因克隆细毛羊。

针对羊毛长度基因的调控，设计并构建了绵羊FGF5基因的干扰载体，通过重组质粒转染细胞系成功获得稳定表达siＲNA及非特异性对照siＲNA的转染细胞系病用于生产转基因克隆细毛羊。

1.8优良细毛羊的高效繁殖综合技术研究与应用①建立了稳定高效的转基因克隆生产转基因绵羊的技术平台课题执行期间，课题组成员采集培养超细毛羊胎儿成纤维细胞，经外源基因转染筛选获得转基因细胞株，然后通过转基因克隆技术累计生产转基因克隆胚胎1500余枚，生产转基因克隆羊16只。

本技术平台转基因体细胞核移植重构卵融合率平均70% 75%，重构胚卵裂率80%以上，囊胚率平均达10% 15%。

②腹腔镜子宫角输精及超数排卵及胚胎移植（MOET）扩繁技术体系的建立2001—2012年间，通过大规模推广并采用绵羊腹腔镜子宫角深部输精技术，迅速扩大了优质种羊覆盖范围和良种选育速度，极大利用有限的优秀种公羊冷冻精液，使配种母羊群情期受胎率接近或达到鲜精人工授精的水平，通过该技术的应用已累计配种改良一般细毛羊35420余只，通过应用腹腔镜子宫角输精技术母羊的情期受胎率最好达到75.6%，创造了国内大规模绵羊子宫角输精后情期受胎率的最好记录。

同时，在原有基础上继续进行MOET技术的研究应用与技术推广，11年间累计开展细毛羊胚胎移植实验5238例，实施鲜胚胚胎移植26次和冷冻胚胎移植18次。

其中，鲜胚移植受胎率最高达到69.9%，平均受胎率稳定在55%的水平，冻胚移植受胎率最高达到48.6%，平均在40%左右，累计生产胚胎移植优质细毛羔羊2732只。

2009年进行MOET技术的研究应用，对74只60日龄的细毛羊供体羊进行超排试验，共获得4659枚可用胚胎。

使用22只成年羊作为供体羊对160只受体羊实施胚胎移植工作。

③体外受精扩繁技术体系的建立课题执行期间，通过体外受精技术生产优质胚胎1120余枚，移植受体380只。

本技术平台体外卵母细胞的成熟率可达到80%以上，体外受精的卵裂率达到70 75%，囊胚率平均达30%以上。

④以体细胞克隆为基础的扩繁技术体系的建立及优良种羊的扩繁采用体细胞克隆技术已累计生产克隆胚胎1250多枚，其中移植受体母羊350多头次，截止2012年7月已获得克隆羊后代22只，相关研究工作仍在继续开展。

通过试验研究，目前实验室已建立起绵羊体外胚胎发育、生产及体细胞克隆的技术平台，克隆胚胎囊胚率可稳定达到30%左右，经过胚胎冷冻保存经解冻后复苏率可达到90%以上，移植受胎率在10%以上。

1.9优质超细毛羊饲养及保健综合配套技术研究种羊的选择从遗传方面提高生产性能，但需要实施行之有效的培育措施才能使其遗传潜力得以发挥，故此培育必须加强各阶段的饲养管理。

课题组从项目区实际出发，主要从母羊的饲养管理，羔羊的培育、育成羊、成年母羊、种公羊的饲养管理等几个阶段的营养需求，补饲标准，饲养方式等方面开展研究，在得到充分数据支持的情况下，制定了优质超细毛羊饲养规程。

通过实施这几个规程，项目区羊群的饲养管理和综合保健技术得到推广和应用，选育的超细型细毛羊，净毛率平均达到60%以上，净毛产量比以前提高0.21 0.33kg，产羔率提高10%，羔羊成活率增加8%。

种羊出售比例由过去的54%提高到85%，增加了31%，产生了明显的经济效益和社会效益。

1.10优质细毛羊种羊推广及基地配套设施建设从2001年以来，通过科技部、农业部及兵团各级项目的支持，项目承担单位新疆农垦科学院通过在细毛羊领域的持续不断研究，在中国美利奴（新疆军垦型）细毛羊的基础上培育出了羊毛细度在16 18μm的超细毛羊新品系，并先后向伊犁、塔城、博州、奎屯、石河子等五个师、市，农四师、五师、七师、八师、九师及自治区巩乃斯种羊场、阿克苏拜城种羊场、甘肃皇城种羊场、青海三角城种羊场和甘肃肃南种羊场等22个种羊繁育场及推广项目示范区推广超细种公羊1250只，细型种公羊2860只，并大面积采用人工授精技术以扩大细型细毛羊数量，提高对低产低质羊的改良效果。

通过进一步完善基地基础设施、走产、学、研紧密结合的发展道路，通过种羊场示范作用，辐射带动周边地区，示范基地已经基本形成。

同时，为鼓励和促进项目示范单位各细毛羊养殖场对细毛羊养殖的积极性，课题负责人利用各级科研经费的支持，坚持每年向项目示范区各相关羊场配套基础设施。

目前，已累计向各基层示范单位发放牛羊甜食砖250t，澳式羊毛打包机12台，电脑12台，照相机16架，羊衣50000套，以加强基层单位科研基础设施建设，建立健全科研管理体制，对先进管理技术的引进和利用，提高养羊业的生产和管理水平。

1.11细毛羊生产检查从2001年至今，每年5—6月份组织区内外专家开展了新疆兵团细毛羊检查评比大赛，已检查督促项目执行完成情况。