枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化

枯草芽孢杆菌发酵培养基优化作者姓名专业指导教师姓名专业技术职务目录摘要 (1)ABSTRACT (2)第一章绪论 (3)1.1枯草芽孢杆菌简介 (3)1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3)1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3)1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3)1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4)1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4)1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4)1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料 (5)1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5)1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6)1.4研究的思路、目的及意义 (7)第二章材料与方法 (7)2.1实验材料 (7)2.1.1 菌株鉴定 (7)2.1.2 培养基 (7)2.1.3 主要设备 (8)2.2 培养基的优化 (9)2.2.1 培养方法 (9)2.2.2实验流程 (9)2.2.3实验方法 (10)2.2.4正交试验 (11)第三章结果和分析 (11)3.1 鉴定结果如下 (11)3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16)3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19)3.4 实验总结 (25)致谢 (27)摘要枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。

G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。

[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验ABSTRACTBacillus subtilis is the main feed probiotic strains, in this thesis, G18 and G21 to twoB acillus subtilis culture lag phase and doubling time for the evaluation and shaking cultur e flask, an the two factors and three levels orthogonaltest, the main components ofthe fe rmentationmedium, soybean meal processing protease plus the amount of 2u / gsoybean meal, 5u / g, soybean meal, 10u / g of soybean meal and corn syrup added0.5%, 1.0%, 1. 5% do two factorsthe three-level orthogonal experiments, studies show that: G18, bes t medium: 0.5% glucose, starch 3%, soybean meal 3%, corn steep liquor1.0% yeast 0.5% , 0.2% disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate 0.1%, manganese sulfate 0.01 %, a common amylase 2u / g, starch, protease added 10u / g,soybean meal. G21 the bes t medium: glucose 0.5%, 3% starch, 3% soybean meal, corn steep liquor 1.5%, 0.5% of t he Yeast, disodium hydrogen phosphate 0.2%, magnesium sulfate 0.1% and 0.01%, man ganese sulfate, common a amylase 2u / g starch, proteaseadded 5u / g soybean meal.. [Keywords] Bacillus subtilis Medium optimization Orthogonal test第一章绪论1.1枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。

枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。

枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。

它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。

和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等。

1.2枯草芽孢杆菌的应用1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。

枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。

由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。

我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。

1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。

枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。

另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。

如，研究发现猪采食含107CFU／g枯草芽孢杆菌制剂的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量则显著下降，且这种趋势仔猪较母猪更明显；猪饲料中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高饲料转化率和氮利用率，而且可以减少氨的产生。

此外，枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。

1996年，枯草芽孢杆菌作为我国农业部正式批准的6种生物兽药之一已投入工厂化生产。

1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用国家级一类新药白天鹅气雾剂以枯草芽孢杆菌作为有效成分，主要用于治疗和预防烧伤和各种外伤引起的各种细菌感染，其作用机理是通过枯草芽孢杆菌活菌在创面上定殖、增殖而发挥生物拮抗作用，达到抗感染、促进刨面愈合的作用。

1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用在水产上运用的芽孢杆菌主要是枯草芽孢杆菌。

在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的群落，而达到防治水产疾病的目的。

芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，可降解饲料中的某些抗营养因子，饲料转化率提高8％以上，促进鱼类生长。

芽孢杆菌可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用。

芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质。

1.2.6 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。

目前国际上在遗传工程中使用的芽孢宿主菌几乎全部来自Spizien及其学生建立的枯草芽孢杆菌169菌株转化系统，它同另一种常用大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可以将转入目的基因表达出的产物分泌到细胞体外，这就降低了进一步收集、分离和纯化基因表达产物的成本和工作量。

枯草芽孢杆菌能够在生长过程中产生有用代谢产物，且大部分直接分泌到培养基中，这在简化生产工艺的同时，也存在菌株自身分泌的降解性蛋白酶会影响表达产物的稳定性甚至会破坏表达产物的缺点。

近年来有人构建的双蛋白酶和三蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB104和DB403菌株将有助于提高目的基因表达蛋白的稳定性。

这些都为枯草芽孢杆菌的广泛应用奠定了基础。

1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用尹文林等不同养殖水体用20亿／g枯草芽孢杆菌B115株0.5 mg／L后，对养殖水体的溶氧和pH无明显的影响；氨氮最大降解值出现在使用后的第3~4天，平均降低(45.40±5.06)％；亚硝酸盐氮的最大降解值出现在使用后第3天，平均降低率为(16.03±3.82)％；硫化物的最大降解值出现在使用后第 3.4天，平均降低率为(23.01±7.27)％。

与对照组相比有明显差异(P >0.1)，对总大肠茵群也有明显的抑制作用。