超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验
(1) 实验原理
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯
即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。
(2)试剂
Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)
实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用
Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)
0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)
NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,
黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)
实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用
PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,
800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。
实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。
PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上
Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度
SOD_测定方法
SOD_测定方法
SOD（Superoxide Dismutase）是一种重要的抗氧化酶，它可以将有
害的超氧自由基转化为氧和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。SOD
的测定方法有多种，下面将介绍常用的几种方法。
1.超氧根自由基抑制法：
该方法通过测定SOD对超氧自由基的抑制能力来测定SOD的活性。超
氧根自由基在存在特定底物的条件下，可以引起化学反应的颜色变化，通
过测量这种变化的幅度可以得出样品中SOD的活性。超氧根自由基抑制法
具有可操作性强、结果可靠的特点，是常用的SOD活性测定方法之一
2.X射线法：
该方法利用X射线产生的自由基对辅酶A的氧化程度来测定SOD活性。辅酶A在被氧化前后，有很大的吸收差别，可以通过比较吸收光谱来计算SOD活性。
3.含氮蓝法：
含氮蓝为特定底物，可以在碱性条件下与还原型NBT（硝基蓝）产生
紫色的还原型NBT。SOD能够阻止NBT的还原反应，因此通过测量样品和
对照组在一定时间内的吸光度差值，可以计算出SOD的活性。
4.电化学法：
该方法利用电化学生物传感器对SOD的电化学反应进行测定。在电极
表面，SOD催化还原型O2为H2O2，而H2O2又在电极表面电催化为电流。
通过测量电流的大小，可以得出样品中SOD的活性。
这些方法各有优缺点，选择合适的测定方法应根据实验条件和目的来确定。无论采用何种方法，都需要严格控制实验条件，如温度、时间、pH 值等，以确保测定结果的准确性和可重复性。鉴于SOD活性在不同组织和物种之间有所差异，建议在研究中同时采用多个测定方法进行验证，以获得更可靠的结果。
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验
(1) 实验原理
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯
即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。
(2)试剂
Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)
实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用
Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)
0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)
NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,
黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)
实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用
PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,
800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。
实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。
PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上
Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度
抗氧化活性研究方法
抗氧化活性研究方法
引言：
氧化反应是指分子或原子失去电子，而还原反应是指分子或原子获得电子。由于氧化反应产生的自由基具有高度活性，能够对细胞结构和功能造成损害，导致多种疾病的发生。因此，研究抗氧化活性及其机制对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。本文将介绍几种常用的抗氧化活性研究方法。
一、DPPH自由基清除能力测定法
DPPH自由基清除能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色自由基，其颜色随着氧化程度的增加而减弱。在该方法中，将待测样品与DPPH溶液混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。抗氧化活性强的样品能够清除DPPH自由基，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。
二、还原能力测定法
还原能力测定法是通过测定待测样品对还原剂的还原能力来评估其抗氧化活性。常用的还原剂包括铁离子、铜离子等。在该方法中，将待测样品与还原剂混合，通过测定混合液的吸光度变化或还原剂浓度的变化来评估样品的抗氧化活性。抗氧化活性强的样品能够还原还原剂，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降或还原剂浓度的降低。
三、氧化脂质抑制能力测定法
氧化脂质抑制能力测定法是通过测定待测样品对氧化脂质的抑制能力来评估其抗氧化活性。常用的氧化脂质包括脂肪酸、脂肪油等。在该方法
中，将待测样品与氧化脂质混合，通过测定混合液中脂质的氧化程度来评
估样品的抗氧化活性。抗氧化活性强的样品能够有效抑制氧化脂质的形成。
四、超氧阴离子清除能力测定法
超氧阴离子是一种常见的自由基，具有较高的活性。超氧阴离子清除
抗氧化实验方法
附录
抗衰老实验
实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：
超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl
缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：
在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制
超氧阴离子积累的作用能力。抑制率可根据下式计算：
式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率
二实验仪器和试剂：
1 主要仪器：
紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：
待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。三试剂配制：
1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris
碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL
水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris
碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三
酚定容于10mL水中。现配现用，4h内有效。
四实验方法：
1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于
超氧阴离子自由基清除能力测试试剂盒分光光度计法
超氧阴离子自由基清除能力测试试剂盒
（A002-96T分光光度计法）
一、测定原理
该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT
的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。
二、试剂组成
试剂一：液体40mL×1瓶；
试剂二：液体1mL一瓶；
试剂三：液体1mL一瓶；
试剂四：粉剂一支；
试剂五：1mg/mL没食子酸标准品，1mL。
三、储存条件及有效期
试剂盒-20℃可保存6个月。
四、试剂的配制
试剂一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液；
试剂二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光；
试剂三工作液：试剂三工作液由试剂三加上100mL试剂一工作液配得，现配现用；
试剂四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配
成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。
试剂五：1mg/mL没食子酸标准品，100μL，-20℃保存。
五、操作步骤
测定吸光值。
1空白管很重要，建议做3个以上平行；
2如样品颜色较浅可不做对照管
六、计算公式
注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0；
2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。
七、注意事项
1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；
2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定方法
SOD（超氧化物歧化酶）是一种重要的抗氧化酶，通过催化O2.-的自
动氧化为O2和H2O2来清除有害氧自由基。SOD的活性能够反映生物体内
清除氧自由基的能力，因此SOD活性的测定对于研究氧自由基相关疾病以
及抗氧化剂的评价具有重要意义。以下是目前常用的几种SOD活性的测定
方法：
1. Nitroblue tetrazolium (NBT)法：这是最早用于测定SOD活性的
方法之一、该方法基于超氧自由基能够氧化NBT成为紫色的甲胺蓝（blue formazan）。SOD能够阻止NBT的氧化过程，从而减少blue formazan的
产生。测定时，试样中的NBT和蛋白质混合后加入酶底物，通过测定产生
的blue formazan的吸光度来评估SOD的活性。
2. epinephrine autoxidation法：该方法基于SOD能够催化抑制肾
上腺素自动氧化反应，从而测定其活性。肾上腺素在氧气存在下会自动氧
化生成可见光吸收的产物，而SOD的存在能够阻止这个自动氧化过程，减
少可见光吸收的产生。通过测定反应体系中可见光吸收的变化来评估SOD
的活性。
3. Pyrogallol autoxidation法：该方法与上述方法类似，基于SOD
能够催化抑制邻二氧苯酚（pyrogallol）自动氧化反应，从而测定其活性。邻二氧苯酚在氧气存在下会自动氧化生成氧的产物，而SOD的存在能够阻
止这个自动氧化过程。通过测定反应体系中氧的产生速率或者邻二氧苯酚
消耗速率来评估SOD的活性。
4. Xanthine oxidase法：该方法基于SOD能够催化脲酶氧化邻位双
超氧阴离子自由基清除实验
超氧阴离子自由基清除实验
超氧阴离子自由基清除实验是一种用于测量超氧阴离子自由基（O2-）在发射光谱中的吸收程度的实验方法。该实验需要设备有发射光谱仪、恒
定光源和荧光检测器。实验步骤如下：1、将要测量的样品置于发射光谱
仪中，并调节恒定光源；2、将荧光检测器置于样品前，并开启荧光检测器；3、使用发射光谱仪测量样品发射光谱；4、计算发射光谱的吸收程度；
5、根据发射光谱的吸收程度和超氧阴离子自由基（O2-）的濃度，得出超
氧阴离子自由基（O2-）的清除量。。
以上就是超氧阴离子自由基清除实验的实验过程，通过这个实验，可
以测量超氧阴离子自由基（O2-）的清除量，这对于环境中污染物的控制
有着非常重要的意义。
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法
自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。
其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。
原理部分：
1.DPPH·法测试机理
DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。
2. 羟基自由基（·OH）
1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法
自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。
其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。
原理部分：
1.DPPH·法测试机理
DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。
2. 羟基自由基（·OH）
1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验）
1、清除DPPH自由基能力的测定
称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：
DPPH
()
12
1100%
A A
A
-
=-⨯
清除率
A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；
A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；
A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定
在10mL离心管中分别加入L pH 的磷酸缓冲液和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。取上清液，加入蒸馏水和 FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定
分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液和5mmol/L的菲洛嗪溶液，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：
Fe2+
()
12
1100%
A A
A
-
=-⨯
螯合率
A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；
A1—样品溶液反应后的吸光值；
常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li
常见体外抗氧化实验方法
(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3
①DPPH·自由基清除法 2 Array
②ABTS·+自由基清除法 5
③ FRAP法(铁还原法) 8
11
④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自
氧化法)
⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14
⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16
⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18
⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20
⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23
⑩抗氧化产物的预测26
①DPPH·自由基清除法/DPPH法
原理：
DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。
当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。
实验操作[1]:
1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）
取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。该DPPH溶液避光保存，4h内用完。
（注意：如果是用分光光度计
．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）
1.2 样品液的配置
样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
超氧阴离子自由基的测定
超氧阴离子自由基的测定
试剂：65 mmol·l-1 PBS（磷酸盐缓冲液），10mmol·l-1盐酸羟胺，α-萘胺，乙醚，黄胺，三氯甲烷
材料：叶片
第一步：称取2 g叶片，加入6ml 65 mmol·l-1 PBS（pH 7.8），冰浴研磨成匀浆，
四层纱布过滤，5000×g（4℃）离心10 min。取1 ml上清液加入0.9 ml上述缓冲液和0.1 ml 10mmol·l-1盐酸羟胺，25 ℃温浴20 min。然后取0.5 mlα-萘胺，于25℃下反应20 min，最后加入同体积乙醚充分摇动，1 500×g离心5 min，取粉红色水相测定530 nm的OD值。同时做NO2-标准曲线，将[NO2-]乘以2得[O2-·]，结果以O2-·nmol·min-1·mg-1protein 表示。
第二步：
实验组空白调零组
PBS 0.5 0.5
盐酸羟胺0.1 0.1
摇匀，25℃水浴加热10min
实验组空白调零组
提取液0.5 0
PBS 0 0.5
摇匀，37℃水浴加热20min
实验组空白调零组
黄胺 1 1
α-萘胺 1 0.5
摇匀，37℃水浴加热20min
实验组空白调零组
三氯甲烷 3 3
↓
10000r/min 离心3min（5000r/min 6min）
↓
取粉色水相（上层）测定A530
A530（NO2¯）=A（实验组）—A（空白调零组）
备注：
提取液：称取2 g叶片，加入6ml 65 mmol·l-1 PBS（pH 7.8），冰浴研磨成匀浆，四层纱布过滤，5000×g（4℃）离心10 min，收集得到的上清液。
实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定
实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定
的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大
吸收峰为515 nm[17-20]，当DPPH 溶液中加入自由基
清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。因
此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质
的抗氧化能力。其作用原理如图1。
图1 DPPH 自由基清除作用原理
Fig. 1 Principle of DPPH free radical scavenging
1.2.6 DPPH 自由基清除试验的测定方法将每种
供试品溶液分别取20 μL 加样在96 孔板中，再在每
个孔中平行加入180 μL DPPH 溶液。同时设立对照
组（等量乙醇代替供试液），空白组（20 μL 乙醇加
入180 μL DPPH 溶液）。轻轻振荡，使充分混匀，
将96 孔板放置在避光环境下反应30 min。药物与
自由基反应完全，在波长515 nm 处测定，记录最
终吸光度（A）值。
自由基清除率D=（A 对照组−A 样品组）/（A 对照组−A 空白）
式中A 样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；A 对照组
为对照组未加药的吸光度；A 空白为空白组的吸光度。为了减
小实验误差，每样品设6 复孔，6 复孔取平均值。
DPPH·(二苯代苦味酞自由基)在有机溶
剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在
sl7nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清
除剂存在时,孤对电子被配对,吸收消失或减弱,
通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除
剂的活性。DPPH·法用以评价天然抗氧化剂
抗氧化活性的一种快速(反应时间仅需20min
抗氧化测定方法（三种）
实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定
——抗氧化实验之一
一、目的要求
通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。
二、实验原理
超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。
邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。
三、器材及试剂
（一）器材
恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。
（二）试剂
邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。
（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
超氧自由基清除
超氧自由基清除
超氧自由基在细胞内可以通过超氧化物歧化酶（SOD）被清除。此外，人体摄入的抗氧化剂也可以清除超氧自由基，其清除能力常用连苯三酚法进行检测。抗氧化剂分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类，其中酶类清除剂主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等。目前最常用的自由基清除测定方法包括ABTS法、DPPH法、ORAC法、羟自由基清除能力和超氧自由基清除能力。这些方法可以用于评价样品清除超氧阴离子自由基的能力。例如，邻苯三酚法是在弱碱性条件下，通过邻苯三酚的自氧化反应来测定超氧阴离子自由基的清除能力。此外，芥子碱硫氰酸盐也被研究用于清除超氧阴离子自由基，并通过化学发光法进行了测定。因此，超氧自由基的清除主要依赖于体内自身的抗氧化酶系统以及通过摄入抗氧化剂来实现。
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超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧
化法）
（适用于：SOD及各种抗氧化剂）
操作图解
具体方法
1 溶液配制
1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）
40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH
计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）
取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液
2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。
3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液）
ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。
3 计算公式
清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100
4 注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。因此，实验过程中，要严格控制温度。缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。这样数据才比较稳定。
5 实验结果（以原儿茶酸为例）
采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。
图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）
参考文献:
[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.
致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。