超氧阴离子清除实验

清除超氧阴离子自由基

清除超氧阴离子自由基
取0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（PH8.2）5ml ，置于25℃水浴中预热20min ，分别加入4ml 不同浓度的提取液，25℃水浴中预热20min ，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min 的邻苯三酚溶液1ml ，混匀后于25℃水浴中准确反应5min ，加入10mol/LHCl 1ml 终止反应，于320nm 处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。

每个试样作三个平行样，取其平均值。

实验结果以清除率E 表示： E=空白
样品空白A A A -×100% A 样品用相同样品浓度的空白调零，消除样品颜色的影响。

注：A 空白是不加样液测一值（A 0），A 样品空白(A x0)是只加样液，其他用水代替。

2.5.2.3清除羟自由基
于试管中分别加入不同浓度的提取液2ml ，9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，最后加入2ml 8.8mmol/L H 2O 2 启动反应，37℃反应15min ，以蒸馏水为空白对照，在510nm 下测量各待测液的吸光度。

考虑到本身的吸光值，以9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，蒸馏水2ml ，不同浓度的样品溶液2ml 为提取液的本底吸收。

清除率的计算公式为：
·OH 清除率=0
)0x x (0A A A A --×100% 式中：A0为空白对照液的吸光度，Ax 为加入样品液后的吸光度，Ax0为提取液本底的吸光度。

中药对超氧阴离子自由基清除率的测定

第１期
林祥潮等：中药对超氧阴离子自由基清除率的测定
３３
在表ｌ示的光度法中，羟胺氧化法由于甲萘胺溶液不稳定，因而线性相关性较差；氯所化硝基四氮唑蓝还原法和四甲基偶氮唑盐还原法都需要昂贵的氮唑类化合物；照核黄素法光中硫代碳酰腙类化合物需要合成；酶催化法需要昂贵的酶试剂且测定条件苛刻；而本方法只需用天青Ｉ为指示物质，指示反应简单直接，且指示物质易得价廉，体系稳定性好，能快作
液后，向其中一支加入０８０ｍｍｏＬ的邻苯三酚溶液，另一支不加。分别用水稀释至．０３ｍＬｌ／
刻度，在室温下反应１ｎ５ｍｉ，以水为参比，用１ｍ比色皿在６２ｌ波长处测定体系的吸光ｃ０Ｙｎｌ
度。设不加邻苯三酚时体系的吸光度为ｏ，加入邻苯三酚后体系的吸光度为１，则超氧自
超氧阴离子自由基（２・０。）作为生物体所产生的一种自由基，大量研究证明，自由基的
作用与生物衰老、某些疾病的发病机制密切相关。关于它的清除方法，光度测定已有一些报道【］以天青Ｉ为指示物质，褪色光度法测定中药清除超氧阴离子自由基未见报道。本１，但文研究发现，在一定条件下，天青Ｉ能被超氧阴离子自由基氧化而褪色，中药提取物可以清
度值记为２。超氧自由基清除率Ｒ％：二 × ０／１０４

抗氧化实验方法

附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。

因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。

抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。

三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。

现配现用，4h内有效。

四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。

牛磺酸清除超氧阴离子和羟自由基的实验研究

２．ＤｅｐａｔｒｍｅｎｔｆＰｏｈａｒｍａｃｙ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＦｏｕｒｔｈＰｅｐｌｏｅ＆Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０３３，Ｃｈｉｎａ）
ＺＨＥＮＧＪｉａ —ｊｉａ，ＵＮＹｉｎｇ，ＺＥＮＧＦａｎ—ｔａｏ
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＰｅｏｐｌｅｓ＇ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬｏｎｇｇａｎｇＤｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８１１２，Ｃｈｉｎａ；
ｉｄｅａｎｉｏｎａｎｄｏｆｔａｕｒｉｎｅ’ ｓｆｕｎｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌｓｔｏｓｔｕｄｙｈｅｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙｏｎＴａｕｒｉｎｅＣｌｅａｒｉｎｇＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅＡｎｉｏｎＲａｄｉｃａｌａｎｄＨｙｄｒｏｘｙｌＦｒｅｅＲａｉｃｄａｌ
ｔａｕｒｉｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｅｆｅｃｔｏｆｔａｕｉｒｎｅｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃｌａａｎｄｈｙｄｍｘｙｌｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｉｓｓｔｒｏｎｇ，ａｎｄｉｔｗｉｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｗｉｔｈｔｈｅａｄｄｅｄａｍｏｕｎｔｏｆｔａｕｉｒｎｅｉｎａｃｅｒｔａｉｎｒａｎｇｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｂｉａｌｉｔｙｏｆｔａｕｒｉｎｅ’ Ｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｉｓ

抗氧化实验方法

附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。

因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。

抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。

三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。

现配现用，4h内有效。

四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。

抗氧化能力分析方法

超氧阴离子（O2-·）清除能力的测定
采用邻苯三酚自氧化法，略有修改。

25℃恒温条件下，在10mL容量瓶中依次加入pH为8.3的0.05mol/L Tris-HCl 溶液5.0mL，加不同浓度的样品液0.5mL，加入蒸馏水3.3mL，加入2mmol/L邻苯三酚0.2mL，总体积共9mL。

以二次蒸馏水作对照，邻苯三酚最后加入，迅速混匀后，测定A322，每隔1min测一次，直到反应后第5min，求斜率V。

VC和BHA做样品对照。

清除率K(%)=（V s-V）/V s×100%
式中：Vs——0.5mL蒸馏水与反应体系反应的速率
V——0.5mL样品液与反应体系反应的速率
羟基自由基（·OH）清除能力的测定
本实验采用羟基自由基试剂盒的方法测定。

原理：Fenton反应是最常见的产生羟基自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton产生的.OH量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与.OH的多少成正比关系。

抑制率K1(%)=（OD1-OD2）/ OD1×100%
式中：OD1——对照管吸光度
OD2——样品管吸光度。

清除超氧阴离子能

2.1试剂ＰＭＳ溶液（硫酸甲酯吩嗪） NADH溶液（还原性辅酶I） NBT溶液（氯化硝基四唑氮蓝） VC
2.3试验方法

吸取不同质量浓度样品液1mL 于试管中，依次加入1mL 0.078mol/LNBT，1mL 0.468mol/L NADH，最后加入0.4mL 的0.06mol/L PMS 溶液，室温摇匀，后静置5min，于560nm波长处测定吸光度，调零组用不同质量浓度样品液1mL，0.4mL 蒸馏水代替PMS 溶液调零，用蒸馏水作阴性对照，VC 作阳性对照，清除率计算
1.2试剂

Tris-HCl 缓冲溶液（三羟甲基氨基甲烷）邻苯三酚 HCl 溶液
1.3仪器

紫外-可见分光光度计真空干燥箱电热恒温水浴锅旋转蒸发仪
1.4试验方法：
【1】取4.5 mL 50mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH 8.2）， 4.2 mL 蒸馏水，混匀后在25 ℃水浴中保温20 min，取出，立即加入在25 ℃预热的3 mmol/L 邻苯三酚0.3 mL，迅速摇匀后倒入比色杯，于325 nm 处每隔30 s 测定吸光度，计算线性范围内每分钟内吸光度的增加值，以10mmol/L HCl 溶液配制空白为对照。加入晒青毛茶不同溶剂提取物后，邻苯三酚自氧化速率的测定方法：按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入0.1 mL 不同浓度的样品液，蒸馏水减少。同样以10 mmol/L HCl 溶液配制空白管并作为对照。计算清除超氧阴离子清除率。清除率:
【2】邻苯三酚自氧化法测定按参照文献[11]的方法并略有改动，按照表3进行加样，在325 nm波长下，每隔0.5 min记录一次值，连续记录3 min。样品在同样条件下测定吸光值，每个处理试样均做3 个平行试验，取平均值。多糖对超氧阴离子的清除作用按下列公式计算：

超氧阴离子自由基清除实验

超氧阴离子自由基清除实验
超氧阴离子自由基清除实验是一种用于测量超氧阴离子自由基（O2-）在发射光谱中的吸收程度的实验方法。

该实验需要设备有发射光谱仪、恒
定光源和荧光检测器。

实验步骤如下：1、将要测量的样品置于发射光谱
仪中，并调节恒定光源；2、将荧光检测器置于样品前，并开启荧光检测器；3、使用发射光谱仪测量样品发射光谱；4、计算发射光谱的吸收程度；
5、根据发射光谱的吸收程度和超氧阴离子自由基（O2-）的濃度，得出超
氧阴离子自由基（O2-）的清除量。

以上就是超氧阴离子自由基清除实验的实验过程，通过这个实验，可
以测量超氧阴离子自由基（O2-）的清除量，这对于环境中污染物的控制
有着非常重要的意义。

细胞内超氧阴离子产生及清除机制的研究

细胞内超氧阴离子产生及清除机制的研究细胞内超氧阴离子的产生及清除机制一直是细胞生物学领域的一个热门研究方向。

超氧阴离子是氧分子还原后的一种活性氧自由基，它在人体内的大量积累会引起多种疾病和衰老过程。

在这篇文章中，我们将探讨细胞内超氧阴离子产生及清除的相关机制。

细胞内产生超氧阴离子的途径细胞内产生超氧阴离子的途径有多种，包括线粒体呼吸链、NADPH氧化酶、xanthine氧化酶等。

其中，线粒体呼吸链是超氧阴离子产生的主要来源之一。

当线粒体内电子转运链出现故障或者过载时，就会导致线粒体内链中的电子被还原成超氧阴离子。

此外，线粒体外膜和内膜之间的通道贡献了细胞内大约30%的超氧阴离子产生量。

另一种超氧阴离子产生的途径是NADPH氧化酶，在炎症反应和细胞功能活性中发挥着关键作用。

NADPH氧化酶是细胞膜上的一种酶类，能够将细胞内的氧分子和NADPH还原成超氧阴离子和NADP+。

此外，xanthine氧化酶也是产生超氧阴离子的一种途径。

当细胞内的某些物质被分解成xanthine时，xanthine氧化酶就会将其还原成尿酸和超氧阴离子。

细胞内清除超氧阴离子的途径由于超氧阴离子具有强氧化性，会对细胞内分子结构、DNA、蛋白质等造成损伤。

因此，细胞内必须有一套完备的清除机制来调节超氧阴离子的产生和积累。

这些机制包含了多种酶类、分子和细胞器。

其中，超氧化物歧化酶是细胞内最主要的超氧阴离子清除酶。

它可以将两个超氧阴离子逐步转化成氧分子和氢氧离子，并在此过程中释放能量。

此外，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶也可以参与清除超氧阴离子。

细胞内一些小分子物质也能够清除超氧阴离子。

其中，维生素C和维生素E被广泛应用于细胞的氧化应激修复，它们可以直接参与清除细胞内的超氧阴离子，从而起到抗氧化的作用。

此外，一些微小RNA（miRNA）还被发现可以介导超氧阴离子的清除。

例如，miR-143被证明可以降低细胞内的超氧阴离子含量，从而保护细胞功能和健康。

抗氧化实验

抗氧化实验：,1，熊果酸对超氧阴离子自由基（O-2·）的清除实验本实验采用邻苯三酚自氧化法，即采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。

但是加入抗氧化性物质后会对其产生清除作用，从而对其进行抗氧化性能的评价。

取试管，加入不同浓度的熊果酸溶液（5mg/10mL）各50、100、200uL以及200uL Vc 进行阳性对照，同时分别取相同体积的甲醇做对照。

在试管中分别加入50mmol/L，pH8.3K2HPO4-KH2PO4缓冲液4.5mL.在25℃水浴锅保温10min，加入预热至25℃的50mmol/L邻苯三酚的盐酸溶液10uL迅速摇匀，倾入1cm的比色杯中，以缓冲液调零，在325nm处，每隔30s测吸光度1次，连续测定15min。

2熊果酸对羟自由基（·OH）的清除实验(1) 本实验采用Feton体系法产生羟自由基，即:H2O2+Fe2+ OH +H2O+Fe3+。

然后在体系中加入水杨酸捕捉羟自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收，可以利用该吸光度值来表示羟自由基的含量。

取不同的试管分别加入0.5mg/mL熊果酸标准品各50、100、200uL以及200uL甘露醇作为阳性对照。

再分别加入1mL9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL9mmol/L FeSO4，1mL8.8mmol/L H2O2, 用双蒸水补齐至5mL，充分摇匀，迅速倒入1cm的比色杯中，于510nm处测定其吸光度值，以甲醇调零。

可以根据吸光度值判断样品对羟自由基的清除作用。

（2）羟基自由基清除能力的测定。

量取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml样品溶液于试管中，用蒸馏水补齐至1ml，依次加入0.15mol/L FeSO41ml、2mmol/L水杨酸1ml，最后加6mmol/L H2O2 1ml启动反应，37℃反应1h，测510nm的吸光度。

SOD测定

SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.320μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

SOD 测定方法

SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

sod测定方法

SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. L 磷酸缓冲液（）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷酸缓冲液定容至100ml；μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L 磷酸缓冲液L Met溶液L 750μmol/L NBT溶液μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液μmol/L 20μmol/L 核黄素μmol/L 酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

超氧自由基清除

超氧自由基清除
超氧自由基在细胞内可以通过超氧化物歧化酶（SOD）被清除。

此外，人体摄入的抗氧化剂也可以清除超氧自由基，其清除能力常用连苯三酚法进行检测。

抗氧化剂分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类，其中酶类清除剂主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等。

目前最常用的自由基清除测定方法包括ABTS法、DPPH法、ORAC法、羟自由基清除能力和超氧自由基清除能力。

这些方法可以用于评价样品清除超氧阴离子自由基的能力。

例如，邻苯三酚法是在弱碱性条件下，通过邻苯三酚的自氧化反应来测定超氧阴离子自由基的清除能力。

此外，芥子碱硫氰酸盐也被研究用于清除超氧阴离子自由基，并通过化学发光法进行了测定。

因此，超氧自由基的清除主要依赖于体内自身的抗氧化酶系统以及通过摄入抗氧化剂来实现。

tiron清除超氧阴离子的原理

Tiron清除超氧阴离子的原理超氧阴离子是一种高度反应性的自由基物质，在生物体内可以产生氧化应激，损害细胞结构和功能，导致多种疾病。

Tiron是一种有效的超氧阴离子清除剂，具有保护细胞免受氧化损伤的作用。

本文将从Tiron 清除超氧阴离子的原理入手，深入探讨其在生物体内的作用机制。

1. Tiron的结构和性质Tiron，化学名为4，5-二羟基苯磺酸，是一种含有羟基和磺酸基团的有机化合物。

这种结构使得Tiron具有较高的亲电性，能够与超氧阴离子快速结合而形成稳定的产物，从而减少其对细胞的损害。

2. Tiron清除超氧阴离子的原理Tiron清除超氧阴离子的原理主要有两个方面：化学反应和生物作用。

Tiron与超氧阴离子发生化学反应。

超氧阴离子是一种强氧化剂，具有较强的氧化能力，能够与生物分子相互作用，造成氧化损伤。

Tiron的羟基和磺酸基团能够与超氧阴离子发生加成反应，形成稳定的产物，从而中和了超氧阴离子的氧化能力，减轻了其对细胞的损害。

Tiron能够作为抗氧化剂进入细胞内，清除细胞内的自由基，并参与细胞内的抗氧化反应。

在有氧呼吸的过程中，细胞内会产生一定量的超氧阴离子，如果不能及时清除，会导致氧化应激，造成细胞损伤。

Tiron能够进入细胞内，清除细胞内的超氧阴离子，调节氧化还原平衡，保护细胞免受氧化损害。

3. Tiron在生物体内的作用Tiron作为超氧阴离子清除剂，在生物体内发挥着重要的保护作用。

在许多疾病模型中，Tiron都能够减轻疾病的严重程度，延缓疾病的进展。

Tiron可以保护心血管系统免受氧化应激的损害，降低心脏病和动脉粥样硬化的风险；Tiron还可以减轻神经退行性疾病的病理进展，延缓细胞的氧化损伤和逝去。

这些研究表明，Tiron在生物体内具有广泛的应用前景，可以作为一种新型的抗氧化治疗剂。

4. 个人观点和总结作为一种有效的超氧阴离子清除剂，Tiron在生物体内的作用机制值得我们深入探讨。

清除超氧阴离子自出基能力的测定

清除超氧阴离子自出基能力的测定清除超氧阴离子自出基能力的测定？听起来好像高深莫测，但其实它就像是一次科学“侦探”游戏，目标是找到并消除体内的坏小子——超氧阴离子。

我们平时说的自由基，大家都知道吧？它们就像街头上的“坏蛋”，能引发一连串的麻烦，比如加速衰老、引发疾病等等。

超氧阴离子就是这种坏蛋的亲戚之一，它活跃得很，又特别“调皮”，一不小心就能对我们的细胞造成伤害。

所以，清除它的能力如何测定，关系着我们如何守护自己的健康，简直是生活中不可忽视的小细节！究竟该怎么测定这种能力呢？其实嘛，不是像侦探小说里的那种大案子，直接一上来就有个明确的线索。

而是得通过一系列的实验，逐步寻找蛛丝马迹。

最常见的一个方法，就是通过特定的化学试剂来“捉拿”这些超氧阴离子。

它们就像犯罪现场的指纹一样，只要你用对了方法，就能准确找到它们藏身的地方。

实验中，我们通常会使用一种叫做NBT的化学物质，超氧阴离子一旦和它接触，就会发生颜色变化。

这就好比是超氧阴离子自己暴露了行踪，白白地站在那儿，成了显眼的“嫌疑犯”。

这样一来，实验人员只需要观察颜色变化的程度，就能判断体内清除超氧阴离子自出基的能力强不强。

这时候你可能会想，为什么要通过NBT来测量呢？其实是因为NBT反应得很灵敏，它能迅速与超氧阴离子反应，形成一种沉淀物，产生蓝色的变化。

想象一下就像我们在画画时，画布突然冒出了几滴颜料，整个画面一下子就不一样了。

颜色越深，就说明超氧阴离子的清除能力越弱，反之，如果颜色很淡或者没有什么变化，那就说明清除能力比较强，毕竟超氧阴离子在实验中被清除得差不多了。

不过，话说回来，实验的结果就像打麻将，得靠点运气。

因为很多时候，清除超氧阴离子自出基能力不仅受化学反应影响，还和实验条件密切相关。

比如温度、时间、试剂浓度等等，都可能让实验结果出现偏差。

每个小细节都很重要，有时候稍不注意，实验结果就像那种“莫名其妙”的失败，怎么做都不对劲。

所以，这个测定的过程既考验技巧，也考验耐心，真的是需要一点点时间去琢磨。

超氧阴离子清除能力邻苯三酚法

超氧阴离子清除能力邻苯三酚法1 超氧阴离子的来源超氧阴离子(O2•-)是一种高活性自由基，是氧气分子失去一个电子后产生的。

在生物体内，超氧阴离子通常由线粒体电子传递链产生，同时也可以由细胞质中的NADPH氧化酶生成。

2 超氧阴离子的损害超氧阴离子是一种极其活泼的氧化剂，可以与细胞内的脂质、蛋白质和核酸等大分子发生氧化反应，并引起细胞的损害。

长期以来，科学家们一直在研究如何有效地清除超氧阴离子，以保护细胞免受其损害。

3 邻苯三酚法的原理邻苯三酚法是一种用于清除超氧阴离子的方法，该方法利用邻苯三酚的还原能力，将超氧阴离子还原成氧气分子，以达到清除超氧阴离子的目的。

邻苯三酚法的原理如下：① 邻苯三酚在氧气存在下被氧化成半醌，1C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O2 →C6H5-1C(O)2-2C6H4+H2O2② 半醌进一步被氧化成互相联结的二聚体，1C6H5-1C(O)2-2C6H4+C6H5-1C(O)2-2C6H4→(C6H5-1C(O)2-2C6H4)22③ 该反应同时产生超氧阴离子，1O2 +e-→O2•-2导致增加超氧阴离子的浓度。

④ 当邻苯三酚浓度超过一定程度时，它具有还原能力，可以将超氧阴离子还原为氧气分子，1O2•- + 2C6H5-1C(O)2-2C6H4→2C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O24 邻苯三酚法的应用邻苯三酚法已被广泛用于生物学、医学和环境科学等领域。

在生物学中，这种方法被用于研究超氧阴离子在细胞中的作用。

在医学中，邻苯三酚法被应用于治疗一些慢性气道疾病，如支气管哮喘。

在环境科学中，邻苯三酚法也被用于去除环境中的有害物质，如重金属离子。

5 邻苯三酚法的不足虽然邻苯三酚法是一种有效清除超氧阴离子的方法，但它也存在一些不足之处。

一方面，邻苯三酚的使用受到其毒性和生物可降解性的限制；另一方面，邻苯三酚的还原能力相对较弱，反应速度较慢，因此需要较长时间来消除超氧阴离子。

[资料]超氧阴离子消除试验

·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。

·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。

高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。