超氧阴离子清除实验

·O2ˉ自由基清除实验

(1) 实验原理

黄嘌呤氧化酶

黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯

即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂

Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)

实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用

Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)

0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)

NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,

黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)

实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用

PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,

800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上

Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度

实际配制见记录本！

HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)

实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱

(3) 测定方法

超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。

Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.

LWT, 40:955-962.

A）在96孔板孔中依次加入100μL 黄嘌呤(0.4mmol/l)和NBT(0.24mmol/l)的混合液(每种各50μL，溶于0.01mol/l的PBS，pH=8.0)，100μL黄嘌呤氧化酶(0.049units/ml), 50μL 样品溶液

B）混匀后37℃孵育30min, 酶标仪测OD560值(扣除OD800值)。不加样品溶液作为空白对照，Vc(维生素C)为阳性对照，每个浓度的样品平行测定三次，分别计算清除率及样品的IC50。IC50的计算，运用NDST 软件包进行。

(4) 样品清除率=（OD空白-OD样品）/OD空白×100%.

PS：某些样品在水中溶解度不好的可在聚四氟乙烯管内水浴孵育，再取反应液到96孔板中测试。所加反应试剂按比例增加。

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