农用抗生素分离纯化的研究进展

农用抗生素分离纯化的研究进展商瑞１，２，曾会才１，毛佳２，３（１．中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口５７１１０１；２．海南大学环境与植物保护学院，海南儋州５７１７３７；３．中国热带农业科学院分析测试中心，海南海口５７１１０１）摘要：目前我国农用抗生素大规模生产的品种主要有井冈霉素、阿维菌素和赤霉素，而未能大规模生产的抗生素共同存在的问题是技术不成熟，生产成本较高，进而限制了其在生产实践中的应用；另外我国农用抗生素研究的人力、物力过于分散，对一些优良品种投入太少，也是造成大规模生产的农用抗生素品种少的主要因素。

阐述了国内外农用抗生素有效成分分离、提取、纯化技术特点与发展趋势。

关键词：农用抗生素；分离；纯化中图分类号：Ｓ４８２．２＋８文献标识码：Ａ文章编号：１００４－８７４Ｘ（２００８）０２－０１２４－０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳＨＡＮＧＲｕｉ１，２，ＺＥＮＧＨｕｉ－ｃａｉ１，ＨａｏＪｉａ２，３（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ５７１１０１，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｎｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；３ＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＣｅｎｔｅｒ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ，５７１１０１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｔｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｍａｓｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｒｅｍｏｓｔｌｙＶａｌｉｄａｍｙｃｉｎ、ＡｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓａｎｄＧｉｂｂｅｒｌｌｉｎｕｍ．Ｔｈｅｃｏｍｍｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｏｔｈｅｒａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｒｅｔｈａｔｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓｎｏｔｍａｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｏｓｔｉｓｔｏｏｈｉｇｈ，ｗｈｉｃｈｒｅｓｔｒｉｃｔｔｈｅｉｒａｐｐｌｉａｎｃｅｓｉｎｐｒｏｄｕｃｅｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｃｅｓｓｉｖｅｄｅｃｅｎｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｍａｎｐｏｗｅｒａｎｄｍａｔｅｒｉａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｌｅｓｓｄｅｖｏｔｉｏｎｔｏｅｘｃｅｌｌｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｒｅｓｕｌｔｉｎｒａｒｅｌｙａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｍａｓｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｗｅｒｅｖｉｅｗｔｈｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｒｅｎｄｉｎｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｏｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｂｉｏｌｏｇｙｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｆｕｔｕｒｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ农用抗生素种类繁多，结构复杂，在寻找针对其性质的差异建立的分离纯化方法也各不相同。

因此针对一种新型的活性物质，如何在研究的基础阶段建立合理的分离纯化方法，以及快速、准确的分析检测手段一直是研究人员工作的重点。

１农用抗生素研究概况从２０世纪５０年代起，就有不少国家致力于农用抗生素的研究。

由于当时的经济环境条件的限制，在新农用抗生素的筛选过程中，曾走了不少弯路［１］。

７０年代初，美国、意大利、丹麦等国家把农用抗生素的研究列入国家重点规划。

日本农用抗生素的研究与应用走在世界的前列，主要应用的抗生素有９种，如杀菌剂有春日霉素（Ｋａｓｕｇａｍｙｃｉｎ）、链霉素、多氧霉素（Ｐｏｌｙｏｘｉｎｓ）、有效霉素（Ｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎ）、灰黄霉素（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、灭瘟素（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、灭胞素（Ｃｅｌｌｏｃｉｄｉｎ）；杀蜗剂有杀蜻素（Ｉ＇ｅｔｒａｎａｃｔｉｎ）；除草剂有双丙胺麟（Ｂｉｌａｎａｆｏｓ）等，其年产量约５万ｔ［２－３］。

我国从５０年代开始对农用抗生素开展研究以来，６０年代研制成功了放线菌酮和灭瘟素，并成功投入了生产［４－５］；７０年代研制成功了春雷霉素、庆丰霉素、井冈霉素、多抗霉素；８０年代研制成功了公主岭霉素（Ｇｏｎｇｚｈｕｌｉｎｇｍｙｃｉｎ）、多效霉素、农抗１２０、浏阳霉素、莫能霉素（（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）等抗生素；９０年代研制成功了阿维菌素、中生菌素（Ｚｈｏｎｇｓｈｅｎｇｍｙｃｉｎ）、宁南霉素（Ｎｉｎｇｎａｎｍｙｃｉｎ）和华光霉素（Ｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ）等农用抗生素品种［６］；目前尚在研究的农用抗生素还有杀枯肤、波拉霉素（Ｐｏｌａｒａｍｙｃｉｎ）、戒台霉素（Ｊｉｅｔａｃｉｎ）、双丙胺麟、麟氮霉素（Ｐｈｏｓｐｈａｚｏｍｙｃｉｎ）等。

但到目前为止真正具备大规收稿日期：２００７－１１－０６作者简介：商瑞（１９８２－），女，在读硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｒ８２０２０５＠ｔｏｍ．ｃｏｍ通讯作者：曾会才（１９６４－）男，副研究员，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｃ０８１＠１２６．ｃｏｍ广东农业科学２００８年第２期１２４模生产的品种不多，主要有井冈霉素、阿维菌素和赤霉素。

而未能大批量生产的农用抗生素共同存在的问题是技术不成熟，生产成本较高；另外我国农用抗生素研究的人力、物力过于分散，分离、提取、纯化技术有待进一步改善，对一些优良品种投入太少，也是造成大规模生产的农用抗生素品种少的主要因素。

２农用抗生素分离纯化的特点随着生物技术成果的不断积累和生物技术产业化进程的不断推进，生化工程技术在现代生活中正扮演越来越重要的角色。

作为生化工程技术的重要内容之一，分离纯化技术的研究开发也随之得到重视。

生化分离纯化技术已经成为生物技术产业化过程中的一项关键技术。

生化产品的分离和纯化具有生物学的特点，因此有其特殊的要求。

例如，生物合成的发酵液（或反应液）是很复杂的多相体系。

它含有微生物细胞、代谢产物、末用完的培养基等，杂质含量较高；有的还具有非常相似的化学结构及理化性能；有的具有生理活性物质，极不稳定，遇热或遇某些化学试剂极易失活或分解等。

因此，从发酵液中提取、分离、纯化抗生素是一项极其复杂的工艺，主要有以下几个特点［７］：（１）原料液中常存在可降解目标产物的杂质，如可水解目标产物的蛋白酶，因此要采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质；（２）生物物质的生理活性大多是在体内的温度和条件下发挥作用的，对温度、ｐＨ值和化学试剂非常敏感，常因环境条件的变化而降低活性或失活，因此对分离纯化提出了较为苛刻的要求；（３）生物大分子常存在着分子式或分子结构相同、理化性质极其相似的分子及异构体，造成了常用方法难于分离的混合物，因此要用特殊的高效分离技术纯化目标产物；（４）生物产品———农用抗生素一般与人类生命息息相关，因此要求分离纯化的过程必须除去原料中含有的热源及具有免疫性的异源蛋白等对人体有害的物质，并防止这类物质在操作过程中从外界混入，但允许无害的少量杂质存在，要根据目标产物的使用目的，完全除去妨碍其性能发挥的杂质，但不像电子材料和无机材料要求得非常高的纯度；（５）原料中目标产物的浓度一般都很低，有时甚至是极其微量的，这样就有必要对原料进行高度浓缩，因此下游加工过程的成本显著增大，如酒精的浓度最高为１０％，氨基酸为１％￣５％，抗生素为０．１％￣３％，工业酶为０．０１％￣０．１％，单克隆抗体为０．０００１％￣０．０１％，而医疗用酶只有１０－９左右，通常产品的成本和售价同产品的原始浓度成反比，资料表明，生物产品分离纯化费用通常占制造总成本的４０％￣６０％；（６）分离纯化困难，不少生物产品，由于没有开发出技术上先进、经济上可行的提取方法或提取收率太低、成本过高而不能投产，事实上，分离纯化技术已成为生物技术产品能否符合质量标准并且产业化进入市场的关键技术环节，生化产品的分离纯化步骤很多，也非常繁杂，通常包括细胞工程：细胞收集→细胞破碎→产品粗分离→产品精制等，发酵工程：发酵液→细胞破碎→液固分离→浓缩液→粗分离→大规模色谱精制→结晶等。

根据产品的质和量的显著差别，生物分离过程从总体上分为两类：一类是大宗的小分子物质的分离，其特点是处理量大，对分离条件的要求较低，过程中借鉴化学工业的手段较多，如沉淀、过滤、蒸发、萃取、离子交换等；另一类是生物大分子，特别是蛋白质类物质的分离，其特点是处理量小（年产量常不足１ｋｇ），产值大，具有生物活性，对分离条件要求苛刻，常用生物化学的特殊手段，如亲和层析、膜过滤、凝胶过滤、电泳等进行分离［８］。

３农用抗生素分离纯化技术与上游过程相比，目前作为下游过程的生化分离和纯化手段往往步骤繁琐、处理时间长、收率低且重复性差［９］。

下游过程的分离、纯化技术，按生产过程一般分为以下４个阶段：（１）预处理和固液分离：主要技术有过滤和离心，目的是去除高价无机离子和蛋白质以及发酵液中的不溶性固形物杂质和菌体细胞。

过滤和离心相比，无论是投资费用还是运转费用，前者都要小得多，因而首选方法应是过滤。

但因发酵液中的不溶性固形物和菌体细胞均是柔性体，细胞个体很小，特别是细菌，过滤时形成的滤饼均是高度可压缩性的，所以造成过滤困难［１０］。

絮凝技术［１１－１２］、助滤剂和合适的过滤设备是技术关键，近年来菌体细胞过滤技术进展较大。

离心有离心沉降和离心过滤之分。

如果产物在细胞内，收集细胞后就还要进行细胞的破碎和细胞碎片的分离，细胞碎片比细胞更难分离。

（２）提取（初步分离）：提取的目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件。

提取操作中，通常是目的产物要求有较大浓缩比的过程，根据原理不同抗生素的提取方法一般分为沉淀法、溶媒萃取法、柱层析法、吸附法等。

（３）精制（高度纯化）：目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质。

发酵滤液经粗提后，须进一步精制。

上述的萃取、吸附、离子交换法当然也能用于精制，但技术上有所发展。

目前抗生素精制还主要是借助色谱技术。

按照分离机理，色谱法可分为吸附色谱（液固色谱）、分配色谱、离子交换色谱和排阻色谱（凝胶色谱、分子筛色谱）［１３－１５］。

除了这几种主要的色谱精制方法外，还有盐析法、分子筛法、中间盐转移法、结晶和重结晶和晶体洗涤法等。