实验十二___土壤中产抗生素放线菌的分离纯化

实验十二土壤中产抗生素放线菌的分离纯化

实验目的：

1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。

2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。

3、掌握微生物的基本操作。

实验原理：

放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。

许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。微生物大量存在与土壤中，其中包括细菌、放线菌和真菌等，采用选择性培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌。

实验材料：

1、土壤菜园土。

2、实验菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的8h培养物。

3、培养基淀粉琼脂和淀粉液体培养基。

4、其它 10％的酚、牛津杯、灭菌生理盐水、接种环、无菌涂棒、酒精灯、无菌吸管等。

实验方法：

一、土壤中放线菌的分离

1、配制淀粉培养基

配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基）

可溶性淀粉 2克；硝酸钾 0.1克；磷酸氢二钾 0.05克；氯化钠 0.05克；硫酸镁 0.05克；硫酸亚铁 0.001克；琼脂 2克水 100毫升先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。

配方二面粉琼脂培养基

面粉 60克；琼脂 20克；水 1000毫升

把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。

2、土壤悬液梯度稀释

（1）将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。（2）用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

（3）按1：10稀释至10-3、10-4、10-5。

3、将3块灭菌平板分别标记10-3、10-

4、10-5。

4、将高氏1号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入10％的酚数滴，混合均匀。分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有酚的淀粉琼脂培养基中，轻轻旋转混合均匀。

5、平皿倒置于培养箱28℃恒温培养一周左右。

6、将平皿上的放线菌菌落挑取在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化，28℃恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。

7、涂片显微镜观察放线菌的菌丝特征。

二、抗菌谱测定

1、挑取一个放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周左右。

2、将2ml培养8h的金黄色普通球菌和大肠杆菌分别加到200ml灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混合均匀，每培养皿中到20ml，凝固后待用。

3、在上面培养皿中均匀放入4个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液。培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h。

4、测量抑菌圈的大小。

结果与讨论

1、描述从土壤中分离的放线菌菌落的形态特征，并分别描述细菌、酵母菌和霉菌的菌落特征。

2、描述所分离的放线菌所产生的抗生素的抗菌谱。

3、分离放线菌时在淀粉固体培养基中加入10％的酚的作用是什么？

[设计的内容或知识点]

1、玻璃仪器的清洗和包扎。

2、培养基的配制和消毒灭菌。

3、放线菌的菌落培养特征的观察。

4、放线菌分离纯化方法——四区划线法。

5、微生物的染色方法和显微镜观察。

6、微生物的液体发酵。

7、抑菌试验。[基本思路和方法]

A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌