普通生物学实验(细胞与分子)_4 感受态细胞制备及转化_大肠杆菌感受态细胞的制备及转化_
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告范文
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
2、质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒 、质粒的质量和浓度: DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转 DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转 化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成 化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成 正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积 正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积 过大时,转化效率就会降低。1ng的 过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA 即可使50µl 即可使50µl 的感受态细胞达到饱和。一般情 况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞 况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞 体积的5 体积的5％。
【思考题】 思考题】 1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？ 其意义何在？ 2、如何提高连接和转化的效率？
【设备、材料与试剂】 一、 设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离 心机，无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴 锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。 二、 材料 E. coli DH5α菌株: R¯,M¯,Amp¯；pUCmT质 DH5α菌株: R¯,M¯,Amp¯；pUCmT质 粒DNA: 购自上海生工生物工程有限公司。
三、试剂 1. LB固体和液体培养基 LB固体和液体培养基 2. Amp母液 Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液 CaCl2溶液
【实验步骤】
一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α LB平板上挑取新活化的E. 单菌落,接种于20 LB液体培养基中,37℃ 单菌落,接种于20 ml LB液体培养基中,37℃ 下振荡培养12小时左右, 下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养1 LB液体培养基中,37℃振荡培养1-2小时至 OD600 ＝0.5左右。 0.5左右。
实验四感受态细胞的制备和连接产物的转化
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化一、实验原理与目的法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；学习CaCl2掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发处展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。
用CaCl2理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。
冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
二、材料与试剂0.1mol/L CaCl2溶液:称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
含15%甘油的0.1mol/L CaCl2: 称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
1.5ml EP管、灭菌枪头、移液枪、冰盒、低温离心机、涂布棒、大肠杆菌DH5a、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、氨苄青霉素三、实验方法1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl法）21）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌DH5a菌液30μl（过夜菌液约16小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过夜。
2）将过夜培养的菌液1ml移入100ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm），至OD=0.4—0.6（约2小时）；冰上30min。
3）取10ml培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000g离心10分钟。
4）弃去上清,用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下4000g离心10分钟。
5）弃去上清,加入2ml预冷的含20%甘油的0.1mol/L的CaCl2 溶液重悬,即成感受态细胞悬液。
实验一 感受态制备及转化
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
实验八实验九大肠杆菌感受态细胞制备与转化
实验八实验九大肠杆菌感受态细胞制备与转化一、实验目的1. 学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法；2. 掌握大肠杆菌感受态细胞的质粒转化实验。
二、实验原理在大肠杆菌的分泌途径中，感受态细胞用于感知环境信号，并调控下游基因表达。
大肠杆菌感受态细胞通过感受胞外分子信号，使得胞内信号通路被触发，从而改变基因表达水平。
感受态细胞的制备需要温和条件和合适培养基的选择。
2. 大肠杆菌质粒转化大肠杆菌质粒转化技术是基因工程中应用广泛的技术。
将目的DNA（一般为质粒）转化到大肠杆菌中，目的DNA在大肠杆菌中能够被稳定复制并且表达。
常用的转化方法有化学转化法和电转化法。
三、实验步骤①在LB培养基中培养感受态细胞至对数生长期，收集细胞；②用感受态诱导液对收集的细胞进行感受态诱导；③收集诱导后的感受态细胞，用80%甘油置于-80℃冰盒中保存。
①在LB平板上分别涂抹野生型大肠杆菌菌落和转化素质粒（如pUC18）大肠杆菌菌落；②接种待转化的细胞于10ml LB培养液（含抗生素），在37℃振荡培养至OD600=0.4±0.1；③收集菌落，用LB缓冲液洗涤；④将菌落再悬于25mM CaCl2，转化素质粒；在微量水平下，用蒸馏水稀释菌落以便于操作；⑤恒流电极制备，用电解质转换液将转化后的菌落转移到LB培养基固体培养基上，加入抗生素；⑥在37℃下培养16~20小时。
可以制成固体培养基快速筛选。
四、实验注意事项1.在大肠杆菌感受态细胞制备过程中，需要注意细胞生长的温度和培养基的种类；2.大肠杆菌质粒转化时，需要注意细胞的生长状态和转化电压的设置；3.操作过程中应注意无菌操作，避免受到细菌感染。
五、实验结果分析检测感受态细胞能够感知胞外分子信号，并且响应相应基因表达水平的变化。
通过筛选获得含有目的质粒的大肠杆菌细胞，检测目的基因能否被稳定表达。
实验九：大肠杆菌质粒转化1. 了解大肠杆菌质粒转化技术的基本原理；2. 熟悉大肠杆菌质粒转化实验的操作步骤。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
专业技能训练（分子生物学部分）实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E. coli JM 109菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
分子生物学：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞的实验技术。 2、掌握热激转化实验技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指外 源DNA导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗 溶液中，菌体细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择 性培养基中保温复苏一段时间，促使在转化过程中获得的新的 表型（如Amp）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨 苄青霉素的选择性培养基上，进行转化结果的筛选。
然后观察结果
实验步骤
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它 操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
实验步骤
转化率统计 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据
此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/
涂板菌液体积 转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）＝转化子总数/质粒
DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体
积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数/感受态细胞总数
养基平板表面划线，于37℃培养16小时 ➢ 挑取一个单菌落，转到3～5mlLB培养基中，于
37℃培养3～5小时 ➢ 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2～3
小时，到OD600＝0.3－0.4
实验四 感受态细胞的制备
分子生物学实验
思考题
1. 在制备感受态细胞的实验中要注意哪 些细节？
1、感受态细胞制备原理：受体细胞经过一些特 殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)处 理后，细菌会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为允许外源DNA分子进入的 感受态细胞(Compenent cells)。
（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞 外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域）
抗Amp
宿主细菌
含Amp培养基
实验仪器
超 净 工 作 台
离心设备 台式高速冷冻离心机
制冰机
实验试剂
分子生物学实验
1、实验材料：E. coli JM109。
2、实验试剂：
(1) LB液体培养基：称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 10 g，加双蒸水至总体积1L，高压下蒸气灭菌。
分子生物学实验
2. 感受态细胞的制备 (CaCl2 法，超净台内)
① 取2个1.5mL离心管，分别转入1mL菌液4℃ 12000 rpm，离心2 min。 ② 弃去上清，每管加入1mL预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶 液，悬浮细胞，冰上放置 30 min。 ③ 4℃ ，12000 rpm，离心2 min。
分子生物学实验
每人2管感受态细胞
注意事项
分子生物学实验
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４
℃的培养菌，最好从 -80℃甘油保存的菌种中直接转 接用于制备感受态细胞的菌液。
2. 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。
在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。
大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞制备与转化
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
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1970年
1944年
1972年
O. T. Avery 转化因子是DNA
S. N. Cohen 质粒DNA转化
1 实验背景
化学试剂法 几乎所有大肠杆菌
转化方法
原生质体 转化法
G+细菌，特别是 芽胞杆菌、酵母
电转化
几乎对所有含细胞壁 结构的受体细胞
1 实验背景
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
0℃ 二价阳离子 Ca2+、Mg2+
大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化
尹燕霞 北京师范大学
1 实验背景
1 实验背景
受体细胞具备的 条件
限制缺陷型 重组整合缺陷型 较高的转化效率
遗传互补性 感染缺陷型
1 实验背景
类型
原核细胞
受体细胞
真核细胞
大肠杆菌
哺乳动物 细胞
酵母细胞
昆虫细胞
1 实验背景
pETBlue-2适用于克隆的受体细胞 受体细胞
NovaBlue JM109
lacZ△M15
DH5a
1 实验背景
蓝白斑筛选（α-互补）
ω片段（无活性，宿主） +
α片段（无活性，载体）
X-gal
β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶（活性）
+
+ 半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
X-gal：5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 IPTG： 异丙基硫代β-D-半乳糖苷
6 实验试剂
0.1 mol/L CaCl2溶液 LB液体培养基
配制1 L培养基，应在950 mL去离子水中加入：
胰蛋白胨(typtone)
10 g
酵母提取物(yeast extract)
5g
NaCl
10 g
摇动容器直至溶质完全溶解，加入200 µL 5 mol/L NaOH调节pH至
7.0，定容至总体积为1 L，121℃高压灭菌20 min。
预冷的0.1 mol/L
离心5 min
CaCl2 2 mL
分装
充分去上清
轻轻吹散 悬浮细胞
细胞沉淀
感受态细胞
感受态 细胞制备
注意：无菌！动作轻！冰浴！
2 实验设计
实验组：
1
2
200 µL感受态细胞+pETBlue-2-AKP连接产物10 µL 轻柔
阳性对照：
混匀
200 µL感受态细胞+pETBlue-2质粒DNA 2 µL （5—50 ng)
37℃, <150 r/mi苏
2 实验设计
浓缩，涂布
正向30 min
50 µg/mL Carb 12.5 µg/mL Tet 70 µg/ml X-gal 80 µmol/L IPTG
选择性平板
倒置培养 37℃，12∽16 h
筛选
3 实验步骤
细胞 扩增
扩增 筛选
Text
制备 感受态
1 实验背景
细菌处于容易吸收外源DNA的状态
感受态
细菌表面正电荷增加 细胞壁和膜的通透性增加
大肠杆菌感受态摄取DNA是非选择性的 敏感细胞
1 实验背景
转化: 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程 转化发展
F. Griffith 肺炎双球菌转化
M. Mandel与A. Higa CaCl2，大肠杆菌转化
1928年
冰浴 30 min
阴性对照： 200 µL感受态细胞+2 µL无菌水
3
4
阴性对照：
200 µL 0.1 mol/L CaCl2 +连接产物2 µL
吸附DNA
转化
注意：无菌！动作轻！冰浴！
2 实验设计
42℃水浴热激90 s 冰浴2 min
1
2
3
4
转化
摄入DNA
注意：无菌！高温！冰浴！
2 实验设计
800 µL LB液体培养基
LB培养基
细胞 扩增
37℃ 250 r/min 2∽3 h
至OD600nm为0.4左右
2 实验设计
冰浴10 min
预冷的0.1 mol/L的CaCl210 mL
离心收集菌体细胞
吸头轻轻吹散菌体细胞 冰浴30 min
细胞沉淀
细胞悬液
感受态 细胞制备
注意：无菌！动作轻！冰浴！
2 实验设计
4℃
4000 r/min
7 实验设备
恒温摇床 台式离心机 超净工作台 恒温水浴 恒温培养箱 高压灭菌锅
8 实验步骤
1）感受态细胞的制备
1. 预培养：接NovaBlue单菌落到含12.5 µg/mL Tet的3 mL LB培养基中 2. 37℃、190 rpm振荡培养过夜 3. 取 0.4 mL预培养菌液转移到含12.5 µg/mL Tet 的40 mL LB液体培养基 4. 37℃、250 rpm振荡培养2.5-3 h 6. 超净台中取样至比色皿，分光光度计测定OD600=0.3-0.4 7. 将菌液转移到50 mL离心管中，冰上放置10 min 8. 4℃，4000 rpm，离心10 min
LB固体培养基
1 L LB液体培养基中加入15 g琼脂，121℃高压灭菌20 min。待
培养基降温至60℃，加入终浓度为50 µg/mL Carb、12.5 µg/mL
Tet、70 µg/mL X-gal和80 µmol/L IPTG，摇匀，倒入90 mm培养
皿中，待其完全凝固。
6 实验试剂
50 mg/mL Carb：用灭菌水配制成，无菌滤器过滤，-20℃冰 箱保存。 5 mg/mL Tet：溶于乙醇，-20℃冰箱保存。 10 mg/mL X-gal： 溶于二甲基甲酰胺，不需过滤灭菌，分装 成小包装，避光贮存于-20℃。 200 mg/mL IPTG： 取2g IPTG溶于8mL双蒸去离子水中， 再用水补至10 mL，用0.22 µm滤膜过滤除菌，每份1 mL， 贮存于-20℃。
DNA分子 42℃
细菌
感受态
LB 选择性 培养基
2 实验设计
感受态细胞制备及转化的基本步骤
细胞 扩增
感受态细 胞制备
转化
复苏
筛选
2 实验设计
细胞 扩增
挑取大肠杆菌 NovaBlue单克隆
12.5 µg/mL Tet
预培养
37℃ 12∽16 h 190 r/min
2 实验设计
扩大培养
12.5 µg/mL Tet 过夜菌:LB按 1:30∽1:100接种
浓缩 涂布
转化 复苏
4 实验结果与分析
阴性对照 受体菌对照
阴性对照 污染对照
阳性对照
实验组
5 实验材料
大肠杆菌（NovaBlue） 质粒DNA (pETBlue－2） 氯化钙（CaCl2） 胰蛋白胨 (Typtone)、酵母提取物 (Yeast extract) 氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH） 琼脂 羧苄青霉素(Carb) 四环素（Tet） 异丙基硫代β-D-半乳糖苷 (IPTG) 5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal) 50 mL离心管、试管、培养皿、三角瓶、小指管、吸头等