枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化

采用改进的Spizizen法进行，详述如下：

A，试剂

SPI-A Salts Solution：

% 硫酸铵（NH4）2SO4 132

% K2HPO4·3H2O 228

% KH2PO4 136

% Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2-水）即二水合柠檬酸三钠 210

121° 20min灭菌（每次用完要灭菌）

SPI-B Salts Solution：%MgSO4*7H2O 120

121° 20min灭菌（每次用完要灭菌）

100×CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物）

10% Yeast Extract

121° 20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）

100×EGTA solution：10mMol/L EGTA (NaOH调pH 至

B 感受态细胞的制备和转化

1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37°摇床过夜

2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37°摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中， 37°100rpm

3. 加20ul100×EGTA溶液，37°100rpm 10min，用离心管分装成500ul每管

4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37°100rpm 30min

5. 将离心管转移到250rpm，37°，

6. 以4000rpm离心收集菌体。弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37°过夜。

离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。

感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用

大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan）

枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化

（1）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体LB培养基中，37℃过夜培养

（2）取100ul过夜培养物，接种于5 ml SPI培养基中，37℃，200rpm 震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII 培养基， 37℃，100rpm震荡培养，培养

（3）加入20ul100×EGTA溶液，37℃，100r/min震荡10min（分500ul/管）

（4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37℃，100r/min，震荡30min。（5）调整摇床转速，250r/min继续培养1-2h

（6）取适量体积的细胞，涂布在含有相应抗生素的LB平板上，过夜培养

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备（可保存的）

1.LB平板上，37℃过夜培养

2.挑单菌落，接种于5 ml GM Ⅰ溶液，30℃ 125rpm，

摇床过夜培养

3.次日，取2ml转接到18ml GM Ⅰ中，37℃， 250rpm，

4.再取10mL上一步骤的培养液转接到90mL GM Ⅱ中，

37℃，125rpm，， 5000rpm 10min

5.用10mL原培养液上清液轻轻旋复浮菌体，即为感受

态细胞

6.加30% 的灭菌甘油至终浓度10%（500ul/管）

10×最低盐溶液（100mL）

K2HPO4 14g

KH2PO4 6g

（NH4）2SO4 2g

Na3C6H5O7·2H2O 1g（二水合柠檬酸三钠）

MgSO4·7H2O

氨基酸溶液 2mg/ml，贮存于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法

1. 挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°过夜培养；接种量1%至growth medium（LB含有山梨醇），37°培养至OD600nm为；

2.冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，4℃，5000rpm 离心5min；用冰冷的EM（electroporation medium, 山梨醇；甘露醇；10%甘油），洗四次，将培养液中的成分全部去除；

3.将沉淀悬于1/40体积冰冷的EM中，使细胞终浓度为×1010cfu/ul，即得到感受态细胞（无需液氮处理，可直接存储于-70℃）

4.将80ul感受态细胞与1ul整合质粒（浓度1-5ug/ul），以不加质粒的感受态细胞作为阴性对照。

5.转至预冷的电转杯中，冰上放置5min

6. 1mm电转化杯，采用2000v/mm，电击；2mm电转杯，采用2500V/mm，电击一次

7.立即加入500ul Recovery medium(LB含有山梨醇，甘露醇)

8.转移至无菌的离心管中，37℃，100rpm，预培养3h

9.将培养液涂布在含相应抗性抗生素的LB平板上，正面放2h后，带转化液被培养基完全吸收后，倒置培养。

挑单菌落，提质粒验证。加溶菌酶