细菌生理检查法

灭菌和消毒
－－物理方法
• 影响灭菌的因素 a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营 养体和病毒在50~65°C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热， 其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121°C，12分钟才被杀死。对同种 微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感; b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长;
灭菌和消毒
－－物理方法
d. 加压蒸汽灭菌法：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的， 以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽 压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121°C。在这种情况 下，微生物（包括芽孢）在15~20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对 象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。 在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅 中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低 灭菌效果。
c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在， 则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的 盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。
• 灭菌对培养基成分的影响 a.pH值普遍下降; b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例 如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀; c.不少培养基颜色加深; d.体积和浓度有所变化; e.营养成分有时受到破坏。
附：高压锅的使用 打开锅盖，取出内锅，观察水量，补充水量至比墩子略高，将需灭菌的物品放入内锅， 盖 上盖子，对称旋紧螺栓，关闭放气阀，打开电源，待压力表上指针指向0.05时打开放 气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，待压力表上指针指向0.05时 再次打开 放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀；冷气放完后，待压力表上指 针指向 0.10时打开放气阀，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，反复放气2-3次，最后拨 下电
(2)鉴别培养基：是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而 达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红－美蓝琼 脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基） (3)选择性培养基：根据某微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基， 具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌。（马丁氏培养基、Ashby无氮培养基） • 有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含 有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红 （指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙 门氏菌和志贺氏菌）。
Inoculating an agar plate to obtain single colonies
划线接种，分离纯化
灼烧
微生物的分离、纯化与接种技术
斜面接种技术
微生物的分离、纯化与接种技术
－－细菌的涂布分离技术
微生物的分离、纯化与接种技术
液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都 可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要 求无菌操作。
微生物的分离、纯化与接种技术
接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖 刀
微生物的分离、纯化与接种技术 划线接种： 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，
就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划 线中就常用此法。
附：电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）的使用 把待灭菌的物品均匀地放入烤箱中，关上箱门，调节温度至160°C，打开电源， 待温度上升至160°C时计时，维持该温度0.5-1小时。注意：多观察几次温度，防 止温度失控。用量较少的实验室可以做几个铁皮筒，盖子侧面带孔，灭菌时将孔打 开，灭菌冷却过后将孔关闭。可以将吸管每支单独用白纸包裹用脱水粘上（防止纸 散开来），装入铁皮筒灭菌，使用时可以单独拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可 以单独用白纸包裹用脱水粘上，装入铁皮筒灭菌。无菌瓶可以盖上盖子，用用白纸 包起盖子，用棉线扎起来，不可以用尼龙线，因为尼龙线不耐高温，易断。
第二章 细菌生理学检查法
• 第一节 细菌的培养 一、培养基及种类 二、细菌培养的条件 三、细菌的接种与培养 第二节 常用培养基的制备 一、生化试验培养基和试剂 二、一般培养基和专用培养基
一、培养基及种类
根据培养基的用途来区分：
(1)通用培养基：培养异氧细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌生长 的培养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸来降 低培养基的氧化还原电位，以利于厌氧菌的生长。
于体表、器械、排泄物和周围环境的消毒。常用的化学消毒剂有：石
碳酸、来苏水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。
接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方 法的 不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也 可作 为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
•
过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。 通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子 上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积 小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中 各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内， 有时会给实验带来一定的麻烦。
• 根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： １）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料， 其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、 蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。 用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲， 营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以 较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性 常受生产厂或批号等因素的影响。 ２）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养 基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精 确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做 一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 ３）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或 者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培 养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使 用最多。
培养基制备技术
－－培养基制备的基本方法和注意事项 • 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅， 以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长; • 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后， 应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会 有显著的升高。 • 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器 内:液体分装至试管1/4左右 为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固 体培养基，则分装至试管的1/2~1/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应 不超过容积的一半为宜；Φ＝9cm的培养皿可倒入15ml培养基。 • 一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制 备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类， 应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌 操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、 体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的 培养基中。
a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物 品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验 动物的尸体等的灭菌。
b.干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘 箱中，升温至160°C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。
－－液体接种法、穿刺接种
微生物的培养
－－微生物培养中的氧气条件
• 培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发 酵——摇床、厌氧培养罐等。 • 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振 荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 • 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、 化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气， 创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用 的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原 条件，一般实验室中常用的如葡萄糖——美兰指示剂。
• 根据培养基的物理状态来区分： １）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中 的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养 基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状 态。 ２）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固 剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明 胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中 用得十分广泛。 ３）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液 体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例， 它的用量在0.2~1%之间。这种培养基有时可用来观察 微生物的动力，有时用来保藏菌种。
灭菌和消毒
－－化学方法
• 一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能杀死其中的病原微生物，
所以是起消毒剂的作用，而不是灭菌剂。 • 能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂。能抑制或阻止微生物生 长繁殖的药物，称为防腐剂。但是一种化学药物是杀菌还是抑菌，常 不易严格区分。消毒剂在低浓度时也能杀菌（如1：1000硫柳汞）。由 于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死 或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用