丹参多酚酸盐抑制库普弗细胞活化减轻肝脏再灌注损伤

ａｎｄ ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ ｇｒｏｕｐ．Ｍｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｅｆｏｒｅ ＩＲ，ｔｈｏｓｅ ｉｎ
ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ６０ ｍｇ／ｋｇ ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ ｖｉａ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ １ ｈ
ｇｉｖｅｎ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ｇｒｏｕｐ
【关键词】缺血再灌注；肝脏；丹参多酚酸盐；库普弗细胞
Ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ＧＵ０
ｗａｒｍ ｈｅｐａｔｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
Ｏｒｇａｎ
Ｗｅｎｙｕａｎ，ＴＥＮＧ Ｆ台，，ＳｏＮＧ Ｓｌ记ｏｈｕａ，ＬＩＵ Ｆａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎｇｘｉｎ，ＤＩＮＧ Ｇｕｏｓｈｏｎ，ＦＵ Ｚｈｉｒｅｎ．
ｔｅｓｔ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ＴＮＦ－：ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ Ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ
ｃａｎ
ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｃｏｍｐａｒｅｄ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗａｓ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｂｙ
ｍｅａｓｕｒｉｎｇ
ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ａ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ
ｓａｌｉｎｅ
ｇｒｏｕｐ。６
ｈ ａｆｔｅｒ
基金项目：上海市卫生局青年科研项目资助（２００８Ｙ０８５） 作者单位：２００００３上海，第二军医大学附属长征医院器官移植科 通信作者：傅志仁，电子邮箱为ｚｈｉｒｅｎｆｕ＠１６３．ｃｏｒｎ 滕飞为共同第一作者
验（ＥＵＳＡ）的试剂盒购自美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司。
１．２ １．２．１
上游引物为５ ＬＡＴＧ ＧＡＣ ＧｃＴ ＧＡＴ Ｃ×２ａ２ ＡＡＴ
Ａ盼３’，下游引物为５ＬＴＣＣ ＣＣＡ
ＣＣＣ ＣＴＣ ＣＡＴ
１ｖｒＣ ＡｃＧ ＴＣＴ
ＣＣＣ Ａ－３’；伊ａｃｔｉｎ上游引物为５’－ＧＧＣ ＴＧＴ Ａ１Ｔ
ＣＧ３’，下游引物为５’一ＣＣＡ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ。Ｃｈｏｎｇｚｈｅｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００００３，Ｃｈｉｎｏ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＦＵ
Ｚｈｉｒｅｎ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｉｒｅｎｆｕ＠１６３．ｃｏｎｌ
肝脏标本内库普弗细胞特异性抗原Ｆ４／８０的表达情况，采用荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测库普弗细胞表面分子
ＣＤｌｌｂ
ｍＲＮＡ的表达水平。分离小鼠腹腔巨噬细胞，以脂多糖（ＬＰＳ）作为活化剂，ＴＮＦ－ａ作为巨噬细胞活化指
与ＮＳ组相比，ＳＶ组再灌注６ ｈ的血清ＡＬＴ、
标，检测体外培养体系中ＳＶ能否抑制巨噬细胞活化。结果
ＡＳＴ水平显著降低（Ｐ值均＜ｏ．０１），血清ＴＮＦ—ａ和ＩＬ－６表达水平显著降低（Ｐ值分别＜ｏ．０５、０．０１），肝组织内
ＴＮＦ－ａ
ｍＲＮＡ和ＩＬ－６ ｔｕＲＮＡ表达水平亦显著降低（Ｐ值均ｄ０．０５），肝组织内Ｆ４／８０阳性库普弗细胞的浸润
显著减少（Ｐ＜０．０５），肝组织内库普弗细胞表面分子ＣＤｌｌｂ ｍＲＮＡ的相对表达水平显著降低（Ｐ＜ｏ．０５）。ＳＶ 体外抑制腹腔巨噬细胞活化实验显示，ＳＶ组的上清液内ＴＮＦ－ａ水平显著低于ＮＳ组（Ｐ＜０．０５）。结论ＳＶ 对肝脏ＩＲ损伤具有保护作用，其机制可能与抑制肝脏再灌注后库普弗细胞的活化有关。
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ）．Ｔｈｅ
Ｆ４／８０ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｉｌｓ ｉｎ
ｗｅｒｅ
ｌｉｖｅｒ
ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ
ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎａｌｙｓｅｓ，ａｎｄ
ＲＮＡ
１弘ｇ、随机引物０．５ ｐｇ、２５
ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ
０．４“Ｉ。及反转录酶１００ Ｕ。引物序列：ＩＬ－６上游引 物为５’一ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＣＴ ＡＣＴ Ｔ－ ３’，下游引物为５’一ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ｏＣＡ ＧＡＧ ＡＡＣ
实验动物及试剂
８～１０周龄的健康雄性
ＡｒＧ
ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ
ｔｈｅ
ｗａｒｍ
ｈｅｐａｔｉｃ ＩＲ
ｉｎｊｕｒｙ。ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄ Ｊ，２０１０，３３：６４４．６４８）
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ
ｔｈｅ
ｓａｍｅ ｍａｎｎｅｒ，ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｉｎ
ｔｈｅ
ｓｈａｍ
ｇｒｏｕｐ ｏｎｌｙ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ａｔ ６ ｈ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＡＳＴ）ｗｅｒｅ
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ｔｈｅ
ａｎｄ
ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｉｍｉｎａｓｅ（ＡＬＴ）ａｎｄ ｔｈａｎｇｅｓ
６０
ｍｇ／ｋｇ，ＮＳ组小鼠注射等量ＮＳ。再灌注６ ｈ，检测血清丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）、天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）水平，
并观察肝组织形态学的变化。采用酶联免疫吸附试验（ＥＬｌＳＡ）及荧光定量反转录一聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检
测血清及肝组织内肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）－ａ和白细胞介素（ＩＬ）一６的表达水平；应用免疫组织化学技术检测各组
１材料与方法
１．１
完成后，对标本进行集中检测。
１．２．３
肝细胞损伤情况
应用自动化分析仪检测
血清丙氨酸转氨酶（ＡＩＪ）、天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）。
１．２．４ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ荧光定量反转录一聚合酶链
反应（ＲＴ－ＰＣＲ）取冻存的组织标本约１０ ｍｇ，经 研磨器研磨后，应用ＴＲＩｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ。 建立ＲＴ—ＰＣＲ反应体系，总量为１０扯Ｌ，包括总
冲液内，检测时切成５肛ｍ薄片，行苏木精一伊红 （Ｈ～Ｅ）染色，采用Ｓｕｚｕｋｉ方法分析肝组织ＩＲ损伤 的程度［３］。将包埋于Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｋ的冷冻标本切 成４肛ｍ的薄片并用多聚甲醛固定。以１０％牛血
６０
ＥＬＩＳＡ检测
血清ＴＮＦ～ａ、ＩＬ－６浓度选
用相应的ＥＬＩＳＡ试剂盒并按说明书进行操作。 １．２．６病理学检测
获取组织标本并切成体积
ｍｉｎ后，撤离无损伤血管夹以恢复血流（可见缺
为１ ｃｍ×１ ｃｍ×１ ｃｍ的小块，保存于ｌｏ％甲醛缓
血肝叶颜色由暗灰色变为暗红色），开始再灌注， 并逐层关腹。再灌注６ ｈ，收集血清及肝左叶、肝 中叶标本。将血清置于一７０℃冻存；组织标本经 液氮迅速冷冻后，亦冻存于一７０℃。各组实验均
・６４４・
Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｍｅｄ Ｊ，２０１０，Ｖ０１．３３，Ｎｏ．７
●
论著
●
丹参多酚酸盐抑制库普弗细胞活化 减轻肝脏再灌注损伤
郭闻渊
滕
飞
宋少华
刘
芳
王正昕
丁国善
傅志仁
【摘要】
目的研究丹参多酚酸盐（ＳＶ）对肝脏缺血再灌注（ＩＲ）损伤的保护作用及其机制。方法
选择
健康、雄性的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠２４只，随机分为假手术组、０．９％氯化钠溶液（ＮＳ）组和ＳＶ组，每组８只。假手术组 小鼠仅接受开腹及关腹操作，ＮＳ组和ＳＶ组小鼠建立ｌＲ模型。ＩＲ术前１ ｈ，ＳＶ组小鼠经尾静脉注射ＳＶ
ｍｇ／ｋｇ，ＮＳ组小鼠注射等量ＮＳ。
肝脏ＩＲ损伤模型制备
１．２．２
以戊巴比妥钠腹
腔注射（４０ ｍｇ／ｋｇ）麻醉小鼠，取中线开腹，以无损
伤血管夹夹闭通往肝左叶及肝中叶（约占整个肝 脏质量的７０ ｏＡ）的肝蒂，包括门静脉、肝动脉和胆 道（此时可见肝左叶及肝中叶的颜色变为暗灰色， 注意不要影响肝右叶及尾状叶的血流）。缺血
Ｔｏ
ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｔｏ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ
ａｇａｉｎｓｔ ｗａｒｍ ｈｅｐａｔｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ
ｒｅｐｅｄｕｓｉｏｎ（ＩＲ）ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ
ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＴＧ３’；ＴＮＦ－旺上游引物为５’－ＡＡＧ
ＣＣＴ
Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（Ｈ一２ ６）２４只，体重为２３～２５ ｇ，购 自上海必凯实验动物有限公司，均在无特殊病原
ＧＴＡ ＧＣＣ ＣＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ一３’，下游引物为５’－ＧＧＣ ＡＣＣＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＣＴＴ
Ｔｐ３’：ＣＤｌｌｂ
体（ＳＰＦ）的环境中饲养，自由进食、饮水。ＳＶ购 自上海绿谷制药有限公司，以０．９％氯化钠溶液 （ＮＳ）配制成７。５ ｇ／Ｌ溶液备用；小鼠肿瘤坏死因 子（ＴＮＦ）一ａ和白细胞介素（ＩＬ）一１６酶联免疫吸附试
ＧＴＴ
ຫໍສະໝຸດ Baidu
ＧＧＴ ＡＡＣＡＡＴ ＧＣＣＡＴＧ Ｔ－３’。所有引物均由上
方法 实验分组
海生工生物有限公司合成。ＰＣＲ反应条件：预变 将实验动物随机分为假手术
性，５０℃×２ ｍｉｎ，９５℃×３０ ｓ；ＰＣＲ循环（４０个），
９５℃×１５ Ｓ，６０℃×３０ Ｓ。所用仪器为ＡＢＩ ｔｉｍｅ
组、ＮＳ组和ＳＶ组，每组８只。假手术组小鼠仅接 受开腹及关腹操作，ＮＳ组和ＳＶ组小鼠均建立ＩＲ 模型。ＩＲ术前１ ｈ，ＳＶ组小鼠经尾静脉注射ＳＶ
ｏｒ
０．０１）ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｉｉｖｅｒ
ｓａｍｐｌｅｓ（Ｐ＜０．０５），ｌｅｓｓ Ｆ４／８０ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌＩ
ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ Ｉｏｗｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤｌ １ ｂ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
６０
ＳｔｅｐＯｎｅＴＭ ｒｅａｌ
ＲＴ－ＰＣＲ仪（美国Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司）。目的基因ｍＲＮＡ的表达水平以 相应标本内ｐ－ａｅｔｉｎ ｍＲＮＡ为基准，采用２一必‘方法 计算［２］，将假手术组标本内的目的基因表达水平设 为１，对ＮＳ组和ＳＶ组标本内的目的基因表达水平 进行标准化。
１．２．５
万方数据
上海医学２０１０年第３３卷第７期
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｉｃｅ ｉｎ ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ ｇｒｏｕｐ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＡＬＴ ａｎｄ ｏｆ ＴＮＦ．ａ ａｎｄ
ＡＳＴ（Ｐ＜０．０１），ｌｏｗｅｒ ｌｅｖｅｌｓ
ＩＬ．６（Ｐ＜０．０５
ｃｏ－ｏｕｌｔｕｒｅｄ
ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＣＤｌ １ｂ ｗｉｔｈ ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ
ｏｒ
ａｌｓｏ ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ。ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ
ｓａｌｉｎｅ．Ａｆｔｅｒ
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＬＰＳ）ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅ
Ｌｉｖｅｒ；Ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ；Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ
丹参多酚酸盐（ＳＶ）是采用现代工艺技术从传 统中药丹参中提取的水溶性有效成分，既往研究 发现其具有抗氧化、抗氧自由基、抗血小板聚集、 扩张冠状动脉、改善心肌血流量及减少心肌缺血 再灌注（ＩＲ）损伤等作用ｎ］。与传统丹参注射液相 比，ＳＶ具有有效成分明确、质量容易监控、毒副反 应小及疗效稳定等优点，其作为活血化瘀的中药 已被广泛应用于临床。本实验主要研究ＳＶ对肝 脏ＩＲ损伤的保护作用及其可能的机制。
ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｈｅｐａｔｉｃ
ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ
ｗｅｒｅ
ａｌｓｏ
ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ
ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）－ａ ａｎｄ ＩＬ－６ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ ｂａｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ａｎｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｏｕｒ ｈｅａｌｔｈｙ ｍａｌｅ
Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ
ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｉｔｈ ｅｉｇｈｔ ｍｉｃｅ ｉｎ ｅａｃｈ
ｓａｌｖｉａｎｏｌａｔｅ ｗｅｒｅ ａｆｔｅｒ
ｇｒｏｕｐ：ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ｇｒｏｕｐ