方法开发报告： 2012-APP-RLC-018 2D-UHPLC 分析苦荞麦

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HPLC方法开发基础知识

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参照文献方法时的注意事项
采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…),否则不能重现文献结果注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重现文献的梯度方法注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和浓度…) 注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新, 尽可能采用HPLC新技术
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选择性工具 pH
溶剂
选择性
色谱柱化学
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流动相 pH的影响
只对有可离子化官能团的被分析物有影响胺羧酸酚有些组分包含一个或是更多的可离子化官能团 pH值的变化可能引起很强的选择性变化
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评价液相色谱方法的标准
问题∶什么样的分离结果是好的?分离度?
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什么是液相色谱的分离度？
分离度的定义：
v 2 − v1 R= 1 (w 2 + w1 )
2
R: 分离程度的量度
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③ ①
① ④
① ③
④ ③
1.如用PIC-B7，在②③分开的情况下，保留时间太长

我国苦荞麦的开发利用及存在的问题与对策

２苦荞麦的开发应用
苦荞麦既是一种很好的营养源可作为纯天然无污染的绿色食品又可用于开发保健食品的基料近年来随着人民文化生活水平的提高人们对保健食品及其食疗作用非常重视苦荞麦这一传统食物越来越受到人们的青睐作为防病治病的食药两用的新型食物可从多方面进行开发利用［４］２．１苦荞麦加工产品
ＡｂｓｔｒａｃｔＢｕｃｋｗｈｅａｔｈａｖｅａｂｕｎｄａｎｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｖａｌｕｅａｎｄｐｏｗｅｒｆｕｌｈｅａｌｔｈｃａｒｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍａｎｙｋｉｎｄｓｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｏｏｄａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅｃａｎｂｅｍａｄｅｆｒｏｍｂｕｃｋｗｈｅａｔ．Ｂｕｃｋｗｈｅａｔａｓｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｆｏｏｄｃａｎｈｅｌｐｐｒｏｖｅｎｔｉｎｇａｎｄｃｕｒｅｉｎｇｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｇｏｏｄｃｈａｎｃｅｓａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｕｃｋｗｈｅａｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｂｕｃｋｗｈｅａｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｖａｌｕｅｈｅａｌｔｈｆｕｎｃｔｉｏｎｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ中图分类号ＴＳ２１０文献标识码Ａ文章编号１００２－６６３０（２００４）１１－０３６１－０３

HPLC实验步骤和方法开发

2）可用于梯度洗脱 3）灵敏度较高，ng级检测缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质
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吸光度（ UV/Vis）检测的应用
大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检测器，25%是PDA）
➢ 在公安、刑警破案工作需要投毒药物、毒品分析等
➢ 在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测
➢ 在无机离子分析中应用 –饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
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二.方法开发的过程
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求
➢ 一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图 ➢ 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息
在收集色谱图的同时，得到光谱图 ➢ 提供许多有用的功能
-色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合
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荧光（Fluorescence）检测原理
• 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） • 梯度还是等度 • 灵敏度需求 • 是否有双检测的需求

HPLC实验步骤和方法开发

分配色谱
分配色谱分为：正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多，约占60-70% 相对应的色谱柱：反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等
正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基，
-NH2氨基等
一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息在收集色谱图的同时，得到光谱图提供许多有用的功能 -色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合
荧光（Fluorescence）检测原理
O H
3C
2 现在现在初始 2 初始初始
多环芳烃（PAH）
NH
O O CH
3
维生素
CH
3
No Image
黄曲霉毒素
氨基甲酸酯类杀虫剂
示差折光（Refractive Index）检测
示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质－非特异性
第一步干什么?
想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---

苦荞中D-手性肌醇的纯化及其抗氧化活性研究

Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｄｕｃｉｎｇｐｏｗｅｒｏｆＤ－ｃｈｉｒｏ —ｉｎｏｓｉｔｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｎＤＰＰＨ，ｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌｓａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄ．ＲｅｓｕｈｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｒｕｄｅＤ —ｃｈｉｒｏ—ｉｎｏｓｉｔｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｔａｒｔａｒｙｂｕｃｋｗｈｅａｔｏｎｌｙａｔｔａｉｎｅｄＯ．１２９％．ｈｏｗｅｖｅｒ．ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｕｒｉｉｅｆｄｂｕｃｋｗｈｅａｔＤ—ｃｈｉｒｏ—ｉｎｏｓｉｔｏｌｂｙａｃｔｉｖｅｄｅａｒｂｏｎｃｏｌｕｍｎｃｏｕｌｄｂｅａｃｈｉｅｖｅｄ２７．２６％．ＴｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＤ —ｃｈｉｒｏ— ｉｎｏｓｉｔｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｈａｄｈｉｇｈｅｒＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌａｎｄｈｙｄｒｏｘｙｌｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓａｓｗｅｌｌａｓｇｏｏｄｒｅｄｕｃｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｕｒｉｉｅｆｄｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｃｕｄｒｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｒｏｆｍｔａｒｔａｒｙｂｕｃｋｗｈｅａｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔａｒｔａｒｙｂｕｃｋｗｈｅａｔ；Ｄ－ｃｈｉｒｏ—ｉｎｏｓｉｔｏｌ；ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎ；ＨＰＬＣ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ

荞麦和商品苦荞茶中总黄酮的含量测定

一、背景介绍

荞麦是一种传统的粮食作物，也是一种天然的保健食品。荞麦中含有

丰富的总黄酮，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂等多种保健功效。商品苦荞茶是以苦荞为原料加工而成的茶类产品，同样富含总黄酮。

因此，测定荞麦和商品苦荞茶中总黄酮的含量对于了解其保健功效具

有重要意义。

二、测定方法

测定荞麦和商品苦荞茶中总黄酮的含量通常采用高效液相色谱法（HPLC）。

1. 样品制备

将干燥的荞麦粉或商品苦荞茶粉称取5g左右，加入50ml乙腈-水（80:20）混合溶液中，在常温下超声提取30min，离心10min后收

集上清液备用。

2. 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm）

流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（15:30:55）

流速：1.0ml/min

检测波长：360nm

3. 标准曲线绘制

取总黄酮标准品，分别加入不同浓度的乙腈-水混合溶液中制成一系列浓度不同的标准溶液。以每个浓度的标准溶液为样品进行HPLC测定，并绘制出标准曲线。

4. 样品检测

将样品提取液过滤，取适量注入色谱柱中进行HPLC检测。根据标准

曲线计算出样品中总黄酮的含量。

三、结果分析

经过HPLC检测，荞麦和商品苦荞茶中总黄酮的含量均较高。其中，

荞麦中总黄酮的含量一般在100-150mg/100g左右，而商品苦荞茶中总黄酮的含量则更高，一般在300-500mg/100g左右。

四、结论

荞麦和商品苦荞茶均富含总黄酮，具有多种保健功效。通过HPLC法

可以快速、准确地测定其总黄酮含量，为进一步研究其保健功效提供

苦荞黄酮的生理功能及其作用机制的研究进展

谭平艳;郭皖北

【摘要】Tartary buckwheat is a kind of dicotyledonous polygonaceae annual plants,and flavonoid is the bioactive sub-stance in the tartary buckwheat which has many functions such as lowering the blood sugar and lipids,lowering the blood pressure,antioxidant,eliminating oxygen free radical and antiatherosclerotic etc.,which can be developed for the prevention and treatment of metabolic diseases and cardiovascular diseases such as type 2 diabetes,hypertension and hyperlipidemia and so on.In traditional Chinese medicine,tartary buckwheat is bitter in taste and cold-natured,and it has functions of alle-viating pain,nourishing spleen and disinhibiting dampness,degenerating wide bowel.What's more,tartary buckwheat is nutritious and contains amino acids,vitamins,trace elements and various dietary fibers that are necessary for human body.It can be used for diet food,special food for diabetes and special nutrition products.Tartary buckwheat,as a green pure natural functional food,has a wide prospect of applications.%苦荞属于一年生双子叶蓼科植物,苦荞中的生物活性成分苦荞黄酮对人体有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、清除氧自由基及抗动脉粥样硬化等作用,可开发用于防治代谢性疾病及心脑血管疾病,如2型糖尿病、高血压及高脂血症等;中医方面,苦荞性味苦、平、寒,有理气止痛,健脾利湿,降气宽肠的功效.同时,苦荞麦营养丰富,含有人体所必需的氨基酸、维生素、微量元素及多种膳食纤维,可加工用于减肥食品、糖尿病专用食品及特殊营养品等.苦荞麦作为一种绿色纯天然功能性食品,具有广泛的应用前景.

HPLC方法开发

Peaks
1.去甲肾腺上素 ( 5 ppb) 2. 肾腺上素 (5 ppb) 3. 多巴胺 (5 ppb)
LCMS 大气压离子化
电喷雾(ESI)
iqui Samples Nebulizing gas
+++-
+-+-+++---
High Voltage
+
++-+-++-
+
+
+
++-+-++-
3
1: 壬二酸 2: 安息香酸 3: 硝基安息香酸
乙腈浓度
15%
min
洗提顺序 Peak 1
光谱鉴定
乙腈
30%
15%
Azelaic acid
Peak 2
Benzoic acid
Peak 3
Nitrobenzoic acid
光谱3点比较法
乙酰水杨酸 up slope, 峰顶点
down slope
荧光检测器
激发波长
*
+ hn1
*
hn2+
A*
Emission Wavelength
hn1
hn2 荧光
A
A
荧光检测池的设计

高效液相分析方法开发分享

（3）用于外部校正：Supersil ODS2 5.0μm 4.6mm*250mm
（依利特）
（4）新柱子： Symmetry300 C18 5.0μm 4.6mm*250mm
（Waters）
专柱专用
6
精选版ppt
Βιβλιοθήκη Baidu
二.检测波长的选择
紫外扫描：将样品配制成一定浓度，在紫外分光光度计上扫描，最大吸收处的波长作为检测波长。
目录
3
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一.色谱柱的选择
基本要求：有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度。色谱柱的基本要素：填料，柱长，粒径，直径。例如：5μm填料的色谱柱长要250mm；3.5μm填料的柱长要
150mm等等。柱长和粒径小了，流速增加很多，能节约分析时间，提高工作效率。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测需要。
流动相调整小秘诀
秘诀一：由强到弱秘诀二：三倍规则（每减少10%的有机溶剂，保留因子约
增加3倍）秘诀三：粗调转微调
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四.梯度的优化
梯度的优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度。
有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯度的变化，样品出峰的先后顺序也有可能改变。

HPLC分析方法开发与验证

分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。一、分析方法开发

分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。 1.色谱柱的选择

原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。一般选用直径为4.6mm或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。

三种类型包括:

1)普通的C18或相应的C8色谱柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱; 2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters的Symmetry Shield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱;

方法开发报告201APPLC024

方法开发报告2015-APP-LC-024 2015版中国药典色素快速分析（LC-DAD）赛默飞世尔科技色谱产品应用中心

进样量 5 µL，2uL

波长全扫描

1、前言

色素一般分为天然色素和人工合成色素。药品生产中色素的使用应符合国家药品管理部门的有关规定。中药材和中药饮片不应使用色素，如测定苏丹红Ⅰ等脂溶性色素时，以甲醇为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱20分钟；测定孔雀石绿等偏碱性水溶性色素时，梯度洗脱32分钟；测定金橙Ⅱ等偏酸性水溶性色素时，以甲醇为流动相A，20mmol/L乙酸铵为流动相B，梯度洗脱32分钟。多种色素测定时可适当采用流动相梯度洗脱，可根据情况选择小粒径或柱长较长的色谱柱以提高分离度。——《中国药典》2015年版。

2、样品制备

15种水溶性色素测定：

称取苋菜红、赤藓红、柠檬黄、亮蓝、日落黄、亮蓝G、橙黄I、酸性黑I、酸性橙10、酸性红18、金胺O、孔雀石绿、亮黄、金橙II、罗丹明B对照品，用水溶解并稀释制成0.1 mg/mL的溶液作为对照液（赤藓红8.8 ug/mL，金橙II 25ug/mL，罗丹明B 53ug/mL）；各取100uL混合作为混标对照液。

6种脂溶性色素测定：

称取苏丹红1，苏丹红2，苏丹红3，苏丹红4，苏丹红G，猩红808对照品，加乙腈-氯仿（2:1）溶解并稀释制成0.1 mg/mL溶液作为对照液。各取200uL混合并稀释到4mL作为混标对照液。

红花水提样品测定：

取红花300g，用水超声加热提取1小时。经离心、过滤等前处理操作得红花供试液。

苦荞麦黄酮含量的测定

概述

苦荞麦是一种优质的谷物，其种子中含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。因此，测定苦荞麦黄酮含量对研究与应用苦荞麦具有重要意义。本文将介绍苦荞麦黄酮含量的测定方法及其应用。

测定方法

UV-Vis分光光度法

1.准备样品：将苦荞麦样品研磨成粉末，称取适量样品备用。

2.提取黄酮：将样品加入乙醇中，超声处理30分钟，然后过滤得到提取液。

3.分光光度法测定：将提取液取一定体积，根据黄酮的最大吸收波长（通常为

350nm），使用分光光度计测定吸光度。

4.绘制标准曲线：取不同浓度的黄酮标准溶液，进行相同测定步骤，得到吸光

度与浓度的关系曲线。

5.计算黄酮含量：根据标准曲线，计算样品中黄酮的含量。

高效液相色谱法（HPLC）

1.准备样品：将苦荞麦样品研磨成粉末，称取适量样品备用。

2.提取黄酮：将样品加入乙醇中，超声处理30分钟，然后过滤得到提取液。

3.色谱条件设置：选择适当的色谱柱和移动相，设置流速和梯度条件。

4.进样和检测：将提取液注入色谱仪中，通过检测器检测黄酮成分。

5.计算黄酮含量：根据标准品的峰面积和样品的峰面积，计算黄酮的含量。

比色法

1.准备样品：将苦荞麦样品研磨成粉末，称取适量样品备用。

2.提取黄酮：将样品加入乙醇中，超声处理30分钟，然后过滤得到提取液。

3.获取吸收光谱：将提取液置于分光光度计中，获取100-500nm范围内的吸收

谱。

4.分析计算：根据吸收峰的位置和强度，计算黄酮的含量。

应用

苦荞麦黄酮具有多种生物活性，因此其含量的测定在食品、保健品、药品等领域具有广泛的应用。

HPLC试验步骤和方法开发

二）色谱基本分类
? 色谱基本分类：按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：
1.分配色谱—分配系数 *** 2.亲和色谱—亲和力 3.吸附色谱--吸附力 4.离子交换色谱—离子交换能力 5.凝胶色谱（体积排阻色谱）--分子大小引起的体积排阻
分配色谱
分配色谱分为：正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多，约占60-70%
反相色谱的方法开发
? 开发过程实例
– 色谱条件∶
? 色谱柱：C18，4.6mm×15mm ? 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走
梯度）举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、 40/60，由强渐弱 ? 流速：1ml/min
– 样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)
用于HPLC的检测器
? 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！
HPLC检测器可以分为： ? 溶质性质检测器（选择型）
– 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）
? 整体性质检测器（通用型）
– 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）
理想的HPLC检测器
? 在精细化工分析中的应用

苦荞中总黄酮的含量测定

苦荞又称鞑靼荞麦（Tartary buckwheat），为双子叶蓼科荞麦属植物，在我国西南、北方种植广泛，资源丰富。苦荞含有黄酮类化合物、多种氨基酸、多糖、不饱和脂肪酸等许多化学成分。药理和化学成分的研究表明，苦荞具有较明显的降血糖、降血脂、增强免疫功能等作用，其有效成分主要是芦丁、槲皮素等黄酮类化合物。民间亦以食用苦荞防治糖尿病、高血压、高血脂等病。

目前，荞麦黄酮的测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法。本实验采用芦丁法直接测定黄酮含量，并与另外两种显色后的分光光度法进行比较，期望为苦荞中总黄酮含量的测定提供参考。

1、材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂材料：苦荞样品分别取自会泽火红、云南大山包、罗平牛街。芦丁对照品（批号：09072231，上海同田生物技术XX 公司），试剂均为分析纯。

1.2仪器紫外可见分光光度计（北京普析，TU1810）,超声提取器（上海仪器制造厂，SK3200H）,电子天平（德国赛多利斯CP-224S）。

2、方法与结果

2.1 对照品和样品溶液制备

2.1.1对照品溶液的配制精密称取芦丁对照品9.5mg置于

25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液浓度为0.38mg/mL。

2.1.2 供试品溶液的配制分别取苦荞粉末(过60 目筛)约100mg 精密称定，置于25mL容量瓶中，加入60%乙醇2mL在常温下超声(59KHz)提取20min，用乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线的制定

hplc方法学开发和验证 -回复

hplc方法学开发和验证-回复

HPLC方法学开发和验证是化学分析领域中常用的技术之一。HPLC（高效液相色谱）是一种基于液相色谱原理的分析方法，其通过流动相的流动速度和静相的特性分离和测定复杂混合物中的化合物。在本文中，我们将一步步回答关于HPLC方法学开发和验证的问题。

第一步：方法开发

在HPLC方法开发的初期，首先需要明确分析目标和要求。我们需要确定所要分析的样品类型、目标化合物的特征，并制定分析目标和要求。例如，我们可能需要确定目标化合物的浓度范围、分离度要求、分离时间和检测灵敏度等。

第二步：样品预处理

在样品进入HPLC仪器之前，通常需要进行某些预处理步骤。这些步骤可以包括样品提取、样品净化、样品稀释等。这些预处理步骤可以帮助去除干扰物、提高分离效果和检测灵敏度。

第三步：柱的选择

选择合适的柱是成功分析的重要因素。柱的选择应该根据目标化合物的特性、分析目标和样品类型来进行。一般来说，柱的选择应该包括柱材料、柱尺寸、柱填料和柱温等方面。

第四步：流动相的选择

流动相的选择是HPLC方法开发中的关键步骤之一。在选择流动相时，我们需要考虑目标化合物的极性、溶解度、分离度要求和分离时间等方面。通常，流动相是由溶剂和缓冲剂等组成的混合物。

第五步：分离条件的优化

优化分离条件是使分析目标物分离出来的关键。在此过程中，我们可以调整流速、温度、柱温、流动相浓度梯度等参数，以获得更好的分离效果。同时，还可以通过试验不同的柱和流动相组合来优化分离条件。

第六步：检测方法的选择和优化

在HPLC方法开发中，检测方法的选择和优化也是重要的一步。常用的检测方法包括紫外光吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等。根据目标化合物的特性和分析目标，选择合适的检测方法，并进行方法的优化，以提高检测灵敏度和选择性。

比色法测定苦荞中黄酮含量的方法改进

朱友春,田世龙,王东晖

(甘肃省农科院测试中心,甘肃兰州　730070)

摘　要:通过大量的实验,本文对比色法测定苦荞中黄酮含量的方法进行了改进。改进后的方法简化了操作步骤,缩短了测定时间;其线性关系良好,灵敏度有所提高,方法的回收率也较好,是测定苦荞中黄酮含量的理想方法,值得推广应用。

关键词:比色法;黄酮含量;改进

中图分类号:R285.5

苦荞中黄酮类物质具有降低毛细血管脆性,改善微循环,增强人体免疫功能的作用,在食品、医药行业有着广泛的应用。因此,分析测定苦荞中黄酮含量具有重要的现实意义。本文依据文献[1]报道的测定方法,通过大量的实验,将显色试剂和介质的加入方法进行了改进。改进后的方法不仅简化了操作步骤,缩短了测定时间;而且线性关系良好,灵敏度有所提高,方法的回收率较好,是测定苦荞中黄酮含量的理想方法,值得推广。

1　方法原理

黄酮类(flavo m)物质是广泛存在于植物中的一类黄色素,在植物中多数与糖结合为黄酮甙[2]。苦荞中含有丰富的黄酮类物质,主要以芸香甙(芦丁rutin)形式存在,它在氧化剂亚硝酸盐存在的情况下,与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合物(碱性环境下显红色),在碱性乙醇介质中,该络合物在500nm 波长处有吸收峰,且符合定量分析的比尔定律。

2　实验部分

2.1　主要仪器与试剂

UV—120紫外/可见分光光度计(日本岛津公司);全自动电子天平(瑞典梅勒公司);索氏提取装置。

芦丁标准品(中国药品生物制品检定所提供),准确称取芦丁标准试剂0.1520g,少量甲醇溶解后,用30%乙醇定容到500ml容量瓶中,浓度为0.304mg/ml。