庐山石韦和柔软石韦营养叶片组织化学定位研究

庐山石韦和柔软石韦营养叶片组织化学定位研究摘要:利用冰冻切片法对庐山石韦和柔软石韦营养叶片中的皂苷类化合物､蒽醌类化合物及多糖物质进行了组织化学定位研究｡结果表明,皂苷类化合物主要积累在营养叶片主脉的薄壁组织和叶片的栅栏组织中,海绵组织､厚角组织､表皮中也有少量皂苷类化合物分布;蒽醌类化合物主要分布在营养叶片主脉的薄壁组织以及叶肉同化组织中,在表皮和韧皮部含有少量的蒽醌类化合物,木质部无明显显色反应;而多糖物质普遍存在于叶肉同化组织中｡从显色程度上看,庐山石韦皂苷类化合物和多糖物质含量高于柔软石韦,而柔软石韦的蒽醌类化合物含量则高于庐山石韦｡这为石韦资源的合理利用提供了参考依据｡关键词:庐山石韦;柔软石韦;营养叶片;皂苷类化合物;蒽醌类化合物;多糖物质;组织化学定位Abstract: Frozen section methods was applied to locate saponins, anthraquinones and polysaccharides in the foliage leaves of Pyrrosia sheareri(Bak.) Ching and P. porosa(C. Presl) Hovenk. The histochemical localization showed that saponins mainly distributed in parenchyma cells of major vein transection and palisade tissue, some existed in spongy tissue, epidermis and phloem. Anthraquinones were mainly detected in parenchyma cells of major vein transection and mesophyll assimilation organization, some were tested in epidermis and phloem; no coloration was observed in xylem. Polysaccharides generally distributed in mesophyll assimilation organization of P. sheareri and P. porosa. The content of saponins and polysaccharides in P. sheareri was higher than that in P. porosa; but the content of anthraquinones was less than that of P. porosa according to color reaction. The results provided data for rational utilization of pyrrosia.Key words: Pyrrosia sheareri (Bak.) Ching; P. porosa (C. Presl) Hovenk; foliage leaves; saponins; anthraquinones; polysaccharides; histochemical localization庐山石韦[Pyrrosia sheareri(Bak.)Ching]和柔软石韦[P. porosa(C. Presl)Hovenk]为水龙骨科(Polypodiaceae)石韦属(Pyrrosia Mirbel)多年生草本植物,主要分布于我国广西､广东､贵州､云南､四川､浙江､江西､湖北､福建及台湾等省(自治区),多生于山野的岩石上或树上;外形上常按叶型大小不同,分为大叶石韦类和小叶石韦类两个类群｡庐山石韦为大叶石韦,已被《中华人民共和国药典》收藏为正品石韦;而柔软石韦为小叶石韦,为非中国药典药品｡这两类石韦在临床应用上也各有侧重点,小叶石韦主要对肾炎､尿道炎有一定的疗效[1-4],而大叶石韦则对气管炎疗效较好[5]｡石韦属植物含皂苷､延胡索酸､咖啡酸､香草酸､蒽醌苷､黄酮类､鞣质､β-谷甾醇和绿原酸等多种药用成分[6-12]｡目前在化学成分[13]､形态结构[14,15]､含量测定[16-18]和药理[19]等方面报道不少,但有关庐山石韦和柔软石韦药用成分的组织化学定位以及积累研究鲜见报道｡为了比较不同石韦类群化学成分在组织器官中的含量差异及其分布,试验通过对庐山石韦和柔软石韦主要药用部位营养叶片中皂苷类化合物､蒽醌类化合物及多糖物质进行了组织化学定位研究,以期为研究石韦中药材中的皂苷类化合物､蒽醌类化合物以及多糖物质的合成､转运和贮存的途径提供试验依据,同时为药用石韦资源的合理利用提供参考｡1 材料与方法1.1 试验材料柔软石韦于2007年7月采自广西壮族自治区靖西县安德镇;庐山石韦于2007年7月采自环江毛南族自治县爱峒乡,均取生长正常的成熟营养叶片为研究材料｡在广西大学农学院中心实验室进行测定工作,所用试剂有5%香草醛､冰醋酸､高氯酸､醋酸铅饱和溶液､38%甲醛､70%酒精､5%NaOH溶液､高碘酸酒精､席夫试剂(Schiff＇s reagent,品红亚硫酸试剂)等｡仪器主要是广西大学农学院中心实验室已具备的Leica-DMLB显微镜､植物切片机等｡1.2 试验方法1.2.1 皂苷类化合物检测(香草醛-冰醋酸和高氯酸等量混合的显色剂测定) 将新鲜营养叶片采用冰冻切片法横切制成25 μm的薄片,在醋酸铅饱和溶液中浸泡24 h后,滴加等量的5%的香草醛-冰醋酸和等量高氯酸混合的显色剂,显色5 min后,观察叶片组织有无产生从淡红色→红色→紫红色的颜色变化｡对照材料用38%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%酒精90 mL配制的FAA固定液浸泡20 d,以除去皂苷类化合物,再用上述混合剂显色,制成装片,用Leica-DMLB显微镜进行观察并照相｡1.2.2 蒽醌类化合物检测(氢氧化钠溶液显色法) ①将新鲜营养叶片采用冰冻切片法横切制成25 μm的薄片,放在载玻片上,滴上去离子水后盖上盖玻片,置显微镜下直接观察并拍照｡②在前述①的装片上滴5%NaOH溶液显色,加盖玻片后在Leica-DMLB显微镜下观察显色部位,并照相｡1.2.3 多糖物质检测采用高碘酸席夫染色法(Periodic acid-schiff stain,PAS),将新鲜营养叶片采用冰冻切片法横切制成25 μm的薄片,在高碘酸酒精溶液中处理3 min,在70%酒精中漂洗后滴加席夫试剂处理1 min,流水冲洗5 min后,封片,最后在Leica-DMLB显微镜下观察并照相｡2 结果与分析2.1 皂苷类化合物检测试验采用的皂苷类化合物显色剂是香草醛-冰醋酸和高氯酸混合剂,该显色剂能与植物中的皂苷类化合物发生化学反应,生成大分子复合物,并且出现特定的显色反应,因此是对植物所含皂苷类化合物定性的一种识别试剂｡以5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合剂作为显色剂滴加后,含有皂苷类化合物的细胞会呈现出淡红→红→紫红的颜色变化,颜色的深浅与皂苷类化合物的含量呈正相关关系[20-23]｡从镜检结果(图1)来看,石韦植物不同种及同种的营养叶片中不同组织部位,其皂苷类化合物的分布和积累情况是不同的｡在柔软石韦和庐山石韦营养叶片主脉横切面薄壁组织和维管束韧皮部均显示出红色物质(图1-1､图1-4),说明有皂苷类化合物的存在;厚角组织则显示极浅的红色(图1-1､图1-4),说明此处含少量的皂苷类化合物,而木质部显色不明显｡在营养叶片的整个横切面中均有皂苷类化合物分布,其中栅栏组织积累最多,显色最明显,并且呈紫红色(图1-2､图1-5),表明栅栏组织有较多的皂苷类化合物存在;叶表皮和海绵组织呈浅红色,反映出含皂苷类化合物相对较少(图1-2､图1-3､图1-5),并且表皮毛显色不明显｡研究发现,庐山石韦栅栏组织显色比柔软石韦栅栏组织明显,呈紫红色,表明庐山石韦营养叶片皂苷类化合物含量比柔软石韦含量高｡而经70 %的酒精配制的FAA固定液处理的对照材料与显色剂没有明显的显色反应.说明皂苷类化合物已被FAA液抽提｡2.2 蒽醌类化合物检测试验采用的蒽醌类化合物显色剂是5% NaOH溶液,该显色剂能与植物中的蒽醌类化合物发生化学反应,生成大分子复合物,并且出现特定的显色反应,因此是对植物所含蒽醌类化合物定性的一种识别试剂｡在石韦植物营养叶片横切面切片上滴加5% NaOH溶液后,会立即产生特定的显色反应,出现颜色从淡黄色至橘红色或深红色不等的变化｡从镜检结果(图2)来看,石韦植物不同种及同种的营养叶片的不同组织部位中,蒽醌类化合物的分布和积累情况也是不同的｡在柔软石韦和庐山石韦营养叶片主脉横切面上,显色部位主要集中在薄壁组织,上有较多细胞染成红色(图2-1､图2-2､图2-4),表明该组织含较多的蒽醌类化合物;而表皮部位显浅红色(图2-1､图2-2､图2-5),说明蒽醌类化合物含量少;维管束的韧皮部显色而木质部的导管不显色,厚角组织也无明显的显色反应(图2-1､图2-2､图2-4),说明它们不含蒽醌类化合物或蒽醌类化合物的含量极低｡在营养叶片的栅栏组织和海绵组织中均可看到明显的显色反应,而且有许多细胞染成了深红色(图2-3､图2-5),特别是在柔软石韦海绵组织中有较多的细胞呈深红色(图2-3),表明在柔软石韦海绵组织中分布有较多的蒽醌类化合物｡据显色的深浅判断,柔软石韦营养叶片中的蒽醌类化合物含量要比庐山石韦的高｡在未加5% NaOH溶液的石韦植物营养叶片横切面上,同化薄壁组织含有叶绿素,因而呈绿色(图3-1､图3-2､图3-4);表皮不具叶绿体,为白色(图3-2､图3-4);主脉厚角组织和维管束中含有黄色物质,呈黄色(图3-1､图3-3)｡2.3 多糖物质冰冻切片经过PAS染色后,会立即产生特定的显色反应,变色范围从淡红色至深红色或紫红｡镜检结果表明,营养叶片除了厚角组织被染成红色外,主脉薄壁细胞､维管束和栅栏组织､海绵组织以及表皮毛等部位显色较均匀,也呈红色(图4-1､图4-2､图4-3､图4-4),说明柔软石韦和庐山石韦营养叶片中都含有较多的多糖物质｡在未经PAS染色直接用显微镜观察的庐山石韦和柔软石韦营养叶片切片中,同化薄壁组织含有叶绿素,呈绿色(图3-1､图3-2､图3-4);表皮不具叶绿体,为白色(图3-2､图3-4);柔软石韦主脉厚角组织呈无色,而庐山石韦主脉厚角组织和维管束中含有淡黄色物质,呈淡黄色(图3-1､图3-3)｡3 小结与讨论1)应用组织化学定位技术来确定药用成分在中药材中的分布和积累是一种有效的研究手段｡皂苷类化合物､蒽醌类化合物､多糖物质是石韦属植物中的主要药用成分｡皂苷类化合物是一类具有较强生理活性的次生代谢产物,其在不同药材､不同植物组织器官及不同发育时期存在很大的差异[24-26]｡林如等[27]对绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Mak.]的叶片皂苷类化合物进行了定位,结果表明叶肉组织和叶脉韧皮部显紫红和红色,表皮和厚角组织显浅红色｡本试验结果也表明,庐山石韦和柔软石韦营养叶片的主脉薄壁组织､维管束韧皮部､厚角组织､表皮､栅栏组织和海绵组织中均有不同含量的皂苷类化合物分布,而表皮毛和维管束木质部显色不明显｡彭华胜等[28]研究发现,栽培太子参[Pseudostellaria heterophylla(Miq)Pax ex Pax et Hoffm.]块根在次生韧皮部与形成层中的皂苷类化合物含量明显高于次生木质部｡Nobuyuki等[29]认为,蒽醌类化合物存在于叶片表皮下方的同化薄壁组织中｡而Bruni等[30]认为中央贮水组织也是积累蒽醌类化合物的场所,Beaumont等[31]认为蒽醌类化合物可能贮存于维管束中｡从本研究的结果来看,比较支持Nobuyuki的观点,检测显示,蒽醌类化合物主要分布在石韦属植物营养叶片主脉的薄壁组织及叶肉同化组织中,维管束的韧皮部显色,而木质部不显色,据此我们推测蒽醌类化合物的运输可能是通过韧皮部进行的,当然还有待进一步研究确认｡叶片是植物进行光合作用合成糖类物质的重要器官,吕洪飞等[32]在石斛属(Dendrobium Sw.)植物叶片多糖物质的组织化学定位研究中,发现叶片里染色较深的部位在叶肉细胞､表皮细胞的细胞质及韧皮部细胞的细胞壁上｡章英才等[33]在研究了大黄(Rheum tanguticum Maxim et Balf var. liupanshanense Cheng et Kao)茎和叶中多糖贮藏分布特征后认为,叶肉栅栏组织和海绵组织细胞内分布有大量的叶绿体,糖类物质在叶肉细胞中合成,进行短暂的贮存后通过一定的途径经由叶柄和茎维管束运输至根茎或根中贮藏积累｡本研究也发现庐山石韦和柔软石韦营养叶片中含有较多的多糖物质,但是否运输至石韦叶柄和根状茎中贮藏积累及其运输途径还有待进一步确认｡2)张艺轩等[13]利用高效液相色谱技术研究大叶石韦和小叶石韦的指纹图谱,发现大叶石韦(庐山石韦)与小叶石韦[有柄石韦,Pyrrosia petiolosa (Christ)Ching]的指纹图谱有较大的差异｡我们的研究表明,庐山石韦和柔软石韦营养叶片中存在着大量的皂苷类化合物､蒽醌类化合物和多糖物质,它们在石韦植物营养叶片中的分布是多位点的,不同组织中有一定的贮藏与分布;根据不同组织中细胞的显色程度不同,庐山石韦和柔软石韦营养叶片中皂苷类化合物､蒽醌类化合物和多糖物质的含量差异也较大,庐山石韦营养叶片的皂苷类化合物和多糖物质含量比柔软石韦营养叶片的高,而柔软石韦营养叶片的蒽醌类化合物含量则高于庐山石韦的｡《中华人民共和国药典》中只收录了石韦[Pyrrosia lingua(Thunb.)Farw.]､庐山石韦､有柄石韦这3种石韦植物作为传统中药石韦的原植物[34],但据本研究发现,柔软石韦营养叶片具有较高的蒽醌类化合物含量,而蒽醌类化合物是一类具有重要药用价值的中药有效成分,具有抗菌消炎､健胃､强壮､通经､利尿､祛瘀血､抗肿瘤等作用[35-43]｡加上随着医疗事业的发展,石韦药材的用药量在不断增加,这造成野生资源的急剧减少｡不过据调查,柔软石韦的野生资源在广西壮族自治区各地还比较丰富[44],有较好的利用价值｡本研究也可为合理开发利用石韦资源提供参考依据｡3)试验对庐山石韦和柔软石韦营养叶片采用氢氧化钠溶液显色法进行了蒽醌类化合物的组织定位､采用PSA染色法对多糖物质进行了组织定位､采用香草醛-冰醋酸和高氯酸等量混合剂显色法对皂苷类化合物进行了组织定位,3种方法都成功地产生了从淡色-深色的复合显色变化,显示出庐山石韦和柔软石韦营养叶片中有皂苷类化合物､蒽醌类化合物以及多糖物质的存在,且不同组织中颜色深浅不同,其色度变化与石韦活性成分含量呈正比关系,显色反应灵敏,完全可以作为快速定性识别､定位检测石韦属植物营养叶片中的皂苷类化合物､蒽醌类化合物以及多糖物质的方法应用｡参考文献:[1] 童玉懿,李洁,王珂,等.常用中药材品种整理和质量研究[M].北京:北京医科大学出版社,2001.212.[2] 国家中医药管理局中华本草编纂委员会.中华本草(第二卷)[M].上海:上海科学技术出版社,2000.253.[3] 刘建忠,姚波,吴正启.复方石韦片治疗上尿路感染临床观察[J].湖北中医杂志,2007,29(6):32.[4] 吴金英,贾占红,孙建宁.复方石韦片主要药效的实验研究[J].浙江实用医学,2005,10(5):311-313.[5] 上海第一医学院,上海第一医学院附属中山医院,上海医药工业研究院,等.石韦治疗慢性气管炎的有效成分研究[J].医药工业,1973,3(6):1.[6] 王楠,王金辉,程杰,等.有柄石韦的化学成分[J].沈阳药科大学学报,2003,20(6):425-427.[7] 张亚宁,吴博,杨吉刚,等.HPLC法测定石韦中木犀草素的含量[J].药学实践杂志,2006,24(6):359-361.[8] 王白军,杨红兵,齐誉.正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J].时珍国医国药,2007,18(2):463-464.[9] 马辰,周圆,刘爱茹.高效液相色谱法测定中药石韦两种成分的含量[J].药学学报,2003,38(4):286-289.[10] 王瑞兰,易俗,谭新中,等.庐山石韦总黄酮的提取工艺研究[J].湘潭师范学院学报(自然科学版),2004,26(4):77-79.[11] 张兰,刘远环,何聿,等.毛细管电泳-电化学检测法用于中药石韦中绿原酸和槲皮素的同时测定[J].分析测试技术与仪器,2005,11(1):22-27.[12] 钟小群,蔡庆顺,寒勋衔.HPLC法测定石韦药材中绿原酸的含量[J].江西中医学院学报,2002,14(2):16-17.[13] 张艺轩,李开通,李秋月,等.不同产地和品种石韦药材的高效液相指纹图谱研究[J].中药材,2011,34(1):20-26.[14] 李雁群,黎颖菁,黎桦,等.广西石韦属七种植物叶片结构与孢子形态的比较研究[J].广西植物,2010,30(4):462-470.[15] 文瑞良,伍兰.相异石韦性状及显微鉴别[J].中药材,2000,23(8):446-447.[16] 李玉华, 彭敬东,郑敏,等.HPLC法同时测定石韦药材中绿原酸､芒果苷和木犀草素的质量浓度[J]. 西南师范大学学报(自然科学版),2011,36(2):104-107.[17] 陈超君,尹小红,黄敏,等.石韦孢子叶和营养叶中活性成分含量分析[J].广西植物,2010,30(1):133-136.[18] 苏静州,刘明言,董海荣.HPLC法测定复方石韦片中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].中草药,2005,36(3):383-384.[19] 贾永芳,李莉,张彤,等.石韦对小鼠免疫功能及异基因皮片移植排斥的抑制作用[J].四川动物,2011,30(2):261-264.[20] 郑友兰,李向高.吉林人参与西洋参生药学和组织化学的比较研究[J].吉林农业大学学报,1986,8(4):30-35.[21] 刘世彪,林如,胡正海.绞股蓝人参皂甙的组织化学定位及其含量的变化[J].实验生物学报,2005,38(1):54-57.[22] 苏红文,胡正海.不同年生西洋参根的解剖结构及组织化学研究[J].石河子大学学报(自然科学版),1995,13(3):1-5.[23] KU B O. Histochemistryl:Ginsenosides in ginseng (Panax ginseng) root[J]. Journal of Natural Products(Llogdia),1980,43(2):278-284.[24] 李金亭,彭励,胡正海,等.牛膝根的结构发育与三萜皂苷积累的关系[J].分子细胞生物学报,2007,40(2):121-129.[25] TAN L L, CAI X, HU Z H, et al. Localization and dynamic change of saikosaponin in the root of Bupleurum chinense[J]. Journal of Integrative Plant Biology,2008,50(8):951-957.[26] 胡正海. 药用植物的结构､发育与其主要药用成分积累关系的研究[J].中国野生植物资源,2005,24(1):8-12.[27] 林如,曹玉芳,胡正海.绞股蓝营养器官的结构及其人参皂甙的组织化学定位研究[J].西北植物学报,2002,22(4):796-800.[28] 彭华胜,刘文哲,胡正海,等. 栽培太子参块根中皂苷的组织化学定位及其含量变化[J].分子细胞生物学报,2009,42(1):1-6.[29] NOBUYUKI O, MASAMI A, HINE N, et al. High-perfomance liquid chromatographic deetermination of phenolic compounds in aloe species[J]. Journal of Chromatography A, 1996,2:225-231.[30] BRUNI A, TOSI B. A method for the pharmacognostic study of aloe species using fluorescence microscopy[J]. Int J Crude Drug Res,1982,20(3):127-131.[31] BEAUMONT J, CUTLER D F, REYNOLDS T. Secretory tissues in the East Africa shrubby aloes[J]. Botanical Journal of the Linnean Society,1986,92:399-403.[32] 吕洪飞,郭卫东,罗文姬,等. 2种石斛属植物和小叶石仙桃多糖的组织化学定位[J]. 中山大学学报(自然科学版),2007,36(3):79-83.[33] 章英才,李俐.六盘山鸡爪大黄茎和叶多糖贮藏分布特征的研究[J].植物研究,2009,29(6):753-756.[34] 中华人民共和国药典编纂委员会.2010版中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:中国医药科技出版社,2010.[35] 苟奎斌,孙立华,娄卫宁,等.大黄4种蒽醌类化合物抑制幽门螺旋杆菌效果比较[J].中国药学杂志,1997,32(5):278.[36] 郭啸华,刘志红,戴春笋,等.大黄酸抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞肥大及细胞外基质产生[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志,2001,10(2):101-105.[37] 吴立军.天然药物化学[M].第四版.北京:人民卫生出版社,2003.180.[38] 吴春玲.芦荟的药理与临床应用[J]. 海峡药学,2004,16(1):92-94.[39] 梁荣感,罗伟生,李利亚,等.大黄蒽醌类化合物体外抗流感病毒作用的研究[J].华夏医学,2006,19(3):396-398.[40] 郭兰,邓怀慈.芦荟中的活性成分——蒽醌化合物抗肿瘤的研究[J].现代肿瘤医学,2006,14(6):757-759.[41] 郭美姿,徐海荣,李孝生.大黄酸对小鼠急性肝损伤的影响[J].中医药研究,2002,18(1):37.[42] AROSIO B, GAGLIANO N , FUSARO L M, et al. Aloe-Emodin quinone prtreatment reduces acute liver injury induced by carbon tetrachloride[J]. Pharmacol Toxicol,2000,87(5):229-233.[43] 刘冠贤,叶任高,谭志明,等.大黄素对狼疮性肾炎成纤维细胞生物学行为的影响[J].中国中西医结合杂志,2000,20(3):196-198.[44] 黄永康,杜金子,钟霞军,等.广西石韦种质资源调查研究与开发利用概况[J].大众科技,2010(10):185-186.。