AA 的免疫组织化学定位
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学染色技术
03 免疫组织化学染色技术的 操作流程
样本的收集与处理
01Βιβλιοθήκη 0203样本类型
免疫组织化学染色技术可 应用于各种组织样本，如 石蜡切片、冰冻切片、细 胞涂片和组织块等。
样本处理
在染色前，需要对样本进 行适当的固定、脱水、包 埋和切片等处理，以确保 抗原的完整性和活性。
样本标记
在切片过程中，需对组织 进行标记，以便后续的定 位和观察。
04 免疫组织化学染色技术的 优化与改进
抗体选择与优化
总结词
抗体选择是免疫组织化学染色技术的关键步骤，直接影响到染色结果的特异性和敏感性。
详细描述
在选择抗体时，应考虑抗体的来源和生产过程，以确保其质量和可靠性。同时，应选择针对目标抗原具有高亲和 力的抗体，以提高染色结果的特异性。此外，可通过实验验证抗体的最佳工作浓度，以实现最佳的染色效果。
染色结果的检测与评估
染色结果的检测与评估是免疫组织化学染色技术的最后步 骤，也是最为关键的一步。检测方法包括显微镜观察、图 像分析等。评估染色结果时，需要综合考虑染色强度、阳 性细胞的数量和分布等因素，以得出准确的结论。
染色结果的检测与评估对于病理诊断、肿瘤研究等领域具 有重要意义。通过免疫组织化学染色技术，可以检测组织 中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断和治疗提供 有力支持。
抗原修复与阻断
抗原修复
通过加热或化学方法使抗原从组织中 暴露出来，以便抗体能够与其结合。
阻断
为了防止非特异性染色，需要用阻断 剂对组织进行阻断，以消除内源性过 氧化物酶和生物素等物质的干扰。
抗体孵育与洗涤
抗体选择
根据研究目的选择特异性抗体，确保其能够与目 标抗原特异性结合。
抗体孵育
免 疫 组 织 化 学
核酸分子探针-杂交-免疫组织化学 放大和显示杂交信号 杂交免疫组织化学
基因重组技术 免疫组织化学 图像分析
单抗技术
技术
流式细胞术
激光共聚焦显微术
免疫组织化学的全过程： 抗原的提取和纯化 免疫动物或细胞交融〔单克隆抗体〕 抗体效价检测和提取、纯化 标志抗体 细胞、组织切片标本的制备 免疫组织化学反响和显色 察看和记录结果
● 切片边缘、刀痕或皱折区域 、坏 死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等， 常表现为一样的阳性染色强度，不能 用于判别阳性。
第三章 免疫组织化学常用方法引见
第一节 免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，它 是在抗原抗体特异反响存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质〔抗原／抗体〕在组织细胞内的存在 部位。即预先将抗体与酶连结〔酶标抗体〕，再使其与组织 内特异性抗原反响，经细胞化学染色后，在光镜或电镜下察 看分析。
后再用显微镜察看〔免疫酶〕
1. 加强特异性染色的方法 ● 蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 ● 适宜的抗体稀释度 第一抗体 ● 温育时间 37℃ 30-60 min, 4℃ 过夜 ● 多层染色法〔双层、三层〕
2. 减少或消除非特异性染色的方法 加二抗 显色剂的浓度、温育时间
二抗 1
一抗
1:50
1:100
1:200
1:400
_____________________________________ ___________
1:50
+++
+++
◆ 以中等阳性稀释度为佳 ◆ 抗体稀释液的配制
0.01mol/L pH7.4 PBS or TBS
六种神经递质在纽虫脑神经节的免疫组织化学定位
类动物 ， 其神经系统包括位于身体前端的一对
１ 材 料 与 方 法
１ １ 实验 动物 ．
脑神 经节 、 围绕 吻 道 的环 神 经 和 向后 发 出的一 对 侧神 经索 ． 与环 节动 物相 比 ， 纽形 动物 缺乏 明显 的 体神 经节 ， 是研 究 神 经 系统 进 化 和动 物 系 统演 化 的一种重 要 材料 ¨ ４． 于其 神 经 系 统 的结 构 已 ＿ 关
收 稿 日期 ：０ １１－２； 回 日期 ：０ １１—８ ２ １ －２１ 修 ２ １ —２２
作者简介 ： 田雪娇 （９ ７ ） 女 ， Ｊ １ ８一 ， Ｉ东淄博人。硕士研究生 ， 』 研究方向为动物学 。Ｅｍａ ： ｊ１２ ６ ．ｏ — ｉ ｔ ０ ０ ＠１３ ｅｍ。 ｌｘ 通讯作者 ： 王晓安 （９４ ， ， １６一）男 陕西南郑人。教授 ， 硕士研究生导师， 博士， 研究方 向为比较神经生物学。Ｅｍ ｉｗ ｎｘａａ＠１３ｃｒ。 －ａｌ ａｇｉ ｎ ６．ｏ ： ｏ ｎ
参考 文献 ：
［１］ Ａ ｕｎｌｏＡ Ｍ Ｌｋ ． ｖｌｔ ｎｏ ｅｍ ｈ— ｇｉａ Ａ， ａｅＪＡ Ｅ ｏｕ ｏ ｆｔ ｕ ｉ ｄ ｉ ｈ
阳性 反应 产物 所掩 盖 ． 外 在 神经 节 外 周 的组 织 另 中还 有广 泛 的阳性 颗 粒 分 布． 神经 节 中央纤 维 脑 网 中未见 明显 阳性 反应纤 维存在 （ １Ｌ ． 图 ）
一
抗 （ 汉 博 士 德 产 品 ） 盒 孵 育 ２ ４Ｃ） 武 湿 ４ ｈ（ ￣ ，
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免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
免疫组化原理-2012.4.2
– 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）
•
优点：
– 亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更 敏感，也超过PAP法。 – 能用于常规石蜡切片。
亲和素—生物素复合物（ ABC ）
• 亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和 辣根过氧化酶或荧光素等结合
中性及弱碱性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则 有利于分解；低离子强度有利于免疫 复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。，其主要的不同点在于显色系统的差 异： 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： ABC法： 利用PAP复合物 利用AB复合物
LSAB法:
利用直接标记于亲和素的酶
EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性
免疫组化原理及流程介绍
三 免疫组化的基本流程
1.脱蜡与水化 2. 封闭内源性过 2. 封闭内源性过 氧化物酶 氧化物酶 5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应 3.抗原修复、暴 露抗原决定簇 4.封闭非特异性 蛋白 8.显色 9.复染、脱水、 透明、封片
免疫组化原理及流程介绍
1.脱蜡与水化
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其 它试剂能够充分与组织中抗原等结合发 生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶 性反应和浸洗不全，而产生非特异性背 景着色。
免疫组化原理及流程介绍
2. 封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧 化物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。
免疫组化的原理
张斌 天津医科大学
免疫组化(新)
3、抗体纯化：除去抗血清中的其他白蛋白，α、β 球蛋白以及纤维蛋白。（目的：Ab标记时，免 受其他蛋白的干扰） 4、标记抗体：Marrack于1934年提出了在Ab分子 上结合适当的标记物，用以识别其相应抗原的设 想。
5、细胞和组织切片标本的制备。 Marker 种类：荧光色素、酶、金、铁 6、免疫组化反应和显色。 蛋白、放射性同位素、血浆蛋白、多聚 7、观察和分析结果。 微球蛋白、RBC、 病毒、噬菌体。
中 心 母 细 胞
中 心 细 胞
B1：套细胞 B2：记忆细胞
T细胞的分化演变过程
骨髓 胸腺 外周淋巴组织及血液
NK（细胞毒）
抗 原 免疫母细胞
细胞毒、抑制、辅助
T2 抗原
T1 曲核细胞
T-LBL/T-ALL 母细胞NK淋巴瘤
肝脾T细胞 T-PLL/T-CLL
细胞毒： 皮下脂膜炎样、肠病型、T-LGL、ALCL（皮）、 ALCL（系统）、（肝脾T） NK细胞：侵袭性NK白血病、NK/T鼻型、（母细胞NK淋巴瘤） T细胞： 非特殊类型外周T、成人T、蕈样霉菌病、 血管免疫母细胞、（T-PLL/T-CLL）
3.全B细胞单克隆抗体：CD19（B4）、CD20（B1）、
CD22（Leu14）、L26；
4.全T细胞单克隆抗体：CD2（OKT11,Leu5）、CD3
（OLT3,Leu4）、CD5（OKT1,Leu1）、CD7 （Leu9）、UCHL1;
淋巴造血组织标记物
5.T细胞亚群单克隆抗体：CD4（OKT4,Leu3）、
HE + 免疫组化：95% HE + 免疫组化 + 分子生物学：98%
五 免疫组化技术全过程
1、抗原提取（纯化）（粉碎、沉淀、层析、 离心、电泳） 2、抗体制备：
蛋白a标记-概述说明以及解释
蛋白a标记-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白A标记是一种常用的生物学实验技术，被广泛应用于生物科学研究领域。
通过将蛋白A标记与目标蛋白结合，可以实现对目标蛋白的检测、定位和纯化。
蛋白A是一种来源于金黄色葡萄球菌的蛋白质，具有特异性地与免疫球蛋白的Fc区结合的能力。
基于这一特性，科研人员将蛋白A 与荧光染料、酶或其他探针结合，用于在细胞水平或分子水平上研究目标蛋白的功能和定位。
蛋白A标记在生物科学中的应用非常广泛。
在细胞生物学领域，蛋白A标记可以用于检测和追踪特定蛋白在细胞内的定位。
科研人员可以将荧光染料或其他可见性标记物与蛋白A结合，通过显微镜观察标记物的分布情况，进一步研究目标蛋白在不同细胞器中的位置和功能。
此外，蛋白A 标记还可以用于蛋白质纯化。
通过将蛋白A与某一目标蛋白结合，可以利用蛋白A的亲和层析纯化方法来纯化目标蛋白，从而实现对蛋白质的高效纯化。
这种方法在生物医药领域中具有重要的意义，可以为疾病治疗和其他生物学研究提供有力的支持。
然而，蛋白A标记也存在一些局限性。
首先，蛋白A只能与哺乳动物免疫球蛋白的Fc区结合，对于其他类型的抗体可能无法有效结合。
此外，在某些特定的实验条件下，蛋白A标记可能会对目标蛋白的结构和功能产生影响，需要谨慎使用。
此外，蛋白A标记的选择性较差，对于多克隆抗体的结合可能不够特异。
因此，在进行蛋白A标记实验时，需要根据具体的实验需求进行选择合适的标记方法。
随着科学技术的不断发展，蛋白A标记的应用前景也越来越广阔。
未来，研究人员可以尝试将蛋白A标记与其他新型的探针结合，如纳米材料、荧光蛋白等，以提高标记的灵敏度和分辨率。
此外，结合高通量技术，可以开展更加精确和全面的蛋白A标记实验，为生物学研究提供更多有效的工具和方法。
尽管蛋白A标记仍然存在一些限制，但相信随着科学研究的不断深入，蛋白A标记必将在生物科学领域发挥更加重要的作用。
1.2 文章结构文章结构包括引言、正文和结论三个部分。
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
免疫组化试题参考答案
免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。
注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。
免疫标记：四大免疫标记原理介绍
免疫标记：四大免疫标记原理介绍免疫标记：四大免疫标记原理介绍！为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。
常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。
这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。
免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。
免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。
另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。
一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique)最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。
目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。
主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。
ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。
ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。
由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。
因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。
免疫组织化学技术
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（ 1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔 包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞 ，固定2－4小时。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
荧光标记免疫组织化学
直接法
间接法
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内 可保存半年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶
的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态
光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
免疫组织化学技术
免疫细胞化学或称免疫组织化学（Immunochistochemistry）是通过特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。
此方法可以识别定位各种细胞组织成分，发现蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等，一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。
在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。
知识点导航一免疫荧光法免疫荧光细胞化学是利用荧光色素标记抗体与组织切片或细胞涂片中的相应抗原反应，形成抗原与标记抗体的复合物，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素；在显微镜下呈现特异性荧光反应，从而定位抗原的技术。
1．免疫荧光染色原理免疫荧光染色是根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，再与其相对应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，检测出抗原或抗体，并进行定位及定量。
最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescien isothiocyanate，FITC)。
2．染色方法免疫荧光法分为直接法、夹心法、间接法和补体法(1）直接法用荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原结合，检查出相应的抗原成分。
操作方法①冷冻切片、涂片、印片或细胞培养物按要求固定，石蜡切片按常规脱蜡至水。
②用PBS(pH值7.4)充分水洗标本。
③滴加相应的荧光抗体，将标本放入湿盒中，在室温或37℃染色30min，倾去作用液。
④用PBS洗2次，每次5min。
蒸馏水洗1min。
⑤用50％甘油缓冲液封片。
镜检查。
对照染色：可作阴性、阳性、抑制法等对照试验。
2．间接法此法是将荧光素标记到第二抗体上。
先使第一抗体作用于组织切片与抗原反应，用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再与荧光素标记的抗体（第二抗体）作用。
细胞角蛋白(广谱)抗体试剂(免疫组织化学)说明书
1. 供专业人员使用。 2. 该产品中含有叠氮钠 (NaN3)，纯品具有高度的化学毒性。产品中叠氮钠的浓度虽然不能被认定为危险
性浓度，但是叠氮钠可以与铅、铜发生化学反应，形成具有爆炸性危险的叠氮化金属物质。处理时需 要用大量清水冲洗，防止管道中形成金属叠氮化物质。 3. 与所有生物来源的产品相同，必须遵循相关操作步骤。 4. 穿戴合适的个人防护装置，避免皮肤和眼睛接触。 5. 请按照当地、地区以及国家的相关法规，处理未使用的溶液。
【主要组成成份】
1． 提供的试剂 即用型单克隆小鼠抗体以液体形式提供，缓冲液中含有稳定蛋白和0.015 mol/L NaN3。 克隆：AE1/AE3 同型：IgG1，kappa 2．免疫原 人体表皮细胞愈伤组织 (1)。 3．特异性 AE1/AE3 包括两种单克隆抗体，采用人愈伤组织细胞角蛋白免疫小鼠的方法得到 (2)。研究显示， AE1/AE3 能够识别大部分人细胞角蛋白，因此可以作为 IHC 中单层和复层上皮来源的判定工具 (1,2,4)。 抗体 AE1 能够与大部分亚组 A 细胞角蛋白的抗原决定簇发生反应，包括 Moll 分型(4) 中的 10、13、14、 15、16 和 19（分子量分别为 56.5、54'、50、50'、48 和 40 kDa），但是不包括编号为 12、17 和 18（分 子量分别为 55、47 和 45 kDa）的细胞角蛋白(4)。抗体 AE3 能够与亚组 B 细胞角蛋白的抗原决定簇发生 反应，包括编号为 1 和 2、3、4、5、6、7 和 8（分子量分别为 65、67、64、59、58、56、54 和 52 kDa） 的细胞角蛋白(5)。
5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388
免 疫 组 织 化 学
免疫组织化学常用酶
———————————————————
名称 分子量
内源性 商品
———————————————————
HRP (POD) 40-50 kD
+kD ++
有
———————————————————
免疫组织化学技术的突出优点： ● 高度的特异性 ● 敏感性高 ● 方法步骤统一 ● 机能和代谢密切结合， 定性、定位、定量的统一
免疫组织化学技术在细胞、染色 体或亚细胞水平原位检测抗原分子， 是其它任何生物技术难以达到和代替 的。它能在细胞、基因和分子水平同 时原位显示基因及其表达产物，形成 了新的检测系统，为生物学、医学和 各个领域分子水平的研究与诊断，开 拓了广阔的前景。
12. 细胞核复染（甲基绿或苏木素）；
13. 封片、观察、记录。
亲和组织化学（affinity histochemistry） 植物凝集素与糖类 生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素、维生素、糖类与受体
第二节
抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法
一、基本原理 抗生物素（卵白素） avidin
◆ 以中等阳性稀释度为佳 ◆ 抗体稀释液的配制
0.01mol/L pH7.4 PBS or TBS
3．抗体的选择
(1) 多抗：虽然存在交叉反应的问题， 但由于识别多个抗原表位，所以即使有少 数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实 验结果，这是多抗的优点之一。
(2) 单抗：识别单个抗原表位，所以特 异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏， 则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之 一。
1. 增强特异性染色的方法 ● 蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 ● 合适的抗体稀释度 第一抗体 ● 温育时间 37℃ 30-60 min, 4℃ 过夜 ● 多层染色法（双层、三层）
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植物激素调控嫁接体发育 , [2,3] 参与接穗和砧木间愈伤组织产生和维管束桥分化等多个方 面, 其中作为嫁接成功标志的维管束桥的分化就要求较高的 IAA 水平[4]. 本实验为此提供了 直接证据. 在诱导维管束桥分化时 IAA 很可能起关键作用. 嫁接初期, 接穗和砧木间失去共 质体联络, 负责 IAA 长距离运输的维管束也被切断, 生长素的极性运输在嫁接面受阻, 在接 穗一侧累积(图 2(a))或通过扩散, 穿过隔离层进入砧木一侧(图 2(b)), 刺激嫁接双方产生愈伤 组织. 随着嫁接时间的延长, 累积的 IAA 逐渐增加(图 2(d)和(e)), 刺激维管组织分化, 形成贯 通接穗和砧木的维管束桥(图 2(c)). 由于接穗和砧木间维管束的联结, 运输通畅, 接合部 IAA 含量逐渐下降. 培养基无激素的对照中 IAA 不足是难以分化维管束桥的重要原因.
切片按常规脱蜡和复水后, 用 PBST (0.01 mol L-1 磷酸缓冲液, 9 g L-1 NaCl, 0.1 Triton X-100, pH = 7.2)洗涤 3 次, 每次 3 min. PBSTG(PBST 内含 0.1 明胶和 5 脱脂奶粉)室温下 封闭 30 min 后, 在经 PBSTG 稀释 50 倍的兔抗 IAA 抗体(购于中国农业大学)中 4 静置反 应 16~24 h. 材料用 PBSTG 洗涤 3 次, 每次 5 min. 在经 PBSTG 稀释 50 倍的胶体金(10 nm)标 记的羊抗兔 IgG 抗体中 4 静置反应过夜后, 先用 PBST 洗涤 3 次, 每次 5 min, 再用重蒸水 洗涤. 切片在银染色液(0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液, 1.7 % 对苯二酚, 0.1% AgNO3, pH = 3.5)中避
甲醛和戊二醛气体将 IAA 和其周围最邻近的蛋白质等生物大分子交联起来, 既较好地保持了
植物的组织结构, 又使 IAA 的原位性得以保证, 实验取得较为满意的结果. 因急速冻结生成
的冰晶会破坏细胞的微细结构, 真空干燥和气体固定处理还会导致植物材料特别是幼嫩材料
一定程度的变形, 该法目前还难以应用于免疫细胞化学研究. 如何进一步提高组织结构的完
木培养基中培养 6 d 后, 经溶液化学固定法固定 正常染色(图 1(a))或经冰冻干燥-气体固定 法固定 以正常兔 IgG 代替 IAA 抗体染色(图 1(b)), 银颗粒标记均极少. 和经冰冻干燥-气体 固定并正常染色的处理相比(图 2(c) (e)), 其银颗粒标记基本可以忽略. 说明溶液化学固定法 固定植物激素的效率低, 而冰冻干燥-气体固定法的固定效率高 免疫染色的特异性强. 2.2 嫁接体 IAA 的免疫组织化学定位
致谢 本工作为国家自然科学基金资助项目(批准号 39700011).
参考文献
1 Parkinson M, Yeoman M M. Graft formation in cultured, explanted internodes. New Phytol, 1982, 107: 489~498 2 卢善发, 唐定台, 宋经元, 等. 利用植物激素调控嫁接形成的初步研究. 植物学报, 1996, 38: 307~311 3 卢善发, 宋艳茹. 嫁接接合部维管组织分化的激素调节. 云南植物研究, 1999, 21: 483~490 4 卢善发, 宋艳茹. 激素水平与试管苗离体茎段嫁接体维管束桥分化的关系. 科学通报, 1999, 44: 1422~1425 5 张 军, 韩碧文. 植物激素细胞和组织化学定位的研究进展. 植物学通报, 1995, 12(增刊): 131~142
8பைடு நூலகம்7
第 45 卷 第 8 期 2000 年 4 月
简报
图 2 在含 IAA 1.0 mg L−1 和 ZT 0.25 mg L−1 的接穗培养基及含 ZT 0.25 mg L−1 的砧木培养基中 培养 3 d ((a)和(b)), 6 d ((c) (e))和 15 d (f) 的嫁接接合部 IAA 的动态变化
8 Ohmiya A, Hayashi T, Kakiuchi N. Immuno-gold localization of indole-3-acetic acid in peach seedings. Plant Cell Physiol,
1990, 31: 711~715
9 Ohmiya A, Hayashi T. Immuno-gold localization of IAA in leaf cells of Prunus persica at different stages of development.
关键词 离体茎段嫁接 生长素 免疫组织化学定位 黄瓜
嫁接是一项在农业生产和基础理论研究中广泛应用的技术. 嫁接体发育是异种植物或同 种植物的器官 组织或细胞相互影响 相互作用结合成为一个有机整体的过程. 对这一过程 开展深入细致的研究, 不仅有重要的理论意义, 还具广泛的应用前景. 为此我们在前人[1]工作 的基础上, 建立了试管苗离体茎段嫁接系统 , [2,3] 分析了嫁接体发育期接合部及嫁接体各部分 激素水平的动态变化[4]. 为进一步阐明激素的作用机理, 开展接合部激素分布及其动态变化研 究十分必要, 然而至今未见相关报道, 主要原因是缺乏准确和灵敏的定位手段.
2 结果
2.1 溶液化学固定法固定效率及免疫染色的特异性 嫁接体在含 IAA 1.0 mg L−1 和 ZT 0.25 mg L−1 的接穗培养基及含 ZT 0.25 mg L−1 的砧
图 1 溶液化学固定法固定效率及免疫染色的特异性检测
(a) 溶液化学固定法固定 正常染色; (b) 冰冻干燥-气体固定法固定 以正常兔 IgG 代替 IAA 抗体染色. sc 示接穗, st 示 砧木, gu 示接合部, 箭头示银颗粒. 80
sc 示接穗, st 示砧木, gu 示接合部, 箭头示银颗粒. ×80
差别不明显(图 2(c)).嫁接后 9 d, 接合部银颗 粒明显减少. 嫁接后 15 d, 嫁接体发育基本 完成, 接合部银颗粒进一步减少(图 2(f)).
3 讨论
3.1 关于固定方法
黄瓜下胚轴内 IAA 这一小分子化合物
含量极低且流动性强, 免疫定位难度较大.
由于植物激素是一些小分子物质, 制备切片时容易流失或移位, 给定位研究带来很大困 难. 目前普遍采用的溶液化学固定法 低温置换化学固定法等都难以避免上述问题, 因此近 来有人提出冰冻干燥-气体固定法 , [5,6] 该法的建立将为解决定位研究中激素流失或移位问题提 供有效途径. 本文在建立较为完善的冰冻干燥-气体固定法的基础上, 对嫁接体发育期接合部 生长素进行免疫组织化学定位研究, 为阐明嫁接体发育机理提供理论依据.
1 材料与方法
实验材料为长春密刺黄瓜. 种子剥去种皮后常规消毒, 接种于不含激素的 MS 培养基中. 在光强约 100 µmol m-2 s-1, 每天光照 24 h 和温度(28 2) 的条件下培养 5 d. 无菌条件下, 取 6~7 cm 高的植株, 切取子叶下 0.5~3.0 cm 之间的下胚轴, 从中间横切为两段后嫁接, 套上塑 料管, 放入培养基中培养. 采用 MS 培养基 + 2 蔗糖 + 1.4 琼脂. 处理接穗培养基中加 IAA 1.0 mg L-1 和 ZT 0.25 mg L-1, 砧木培养基中加 ZT 0.25 mg L-1. 对照接穗和砧木培养基中 不加激素[3].
整性值得深入研究.
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简报
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图 4 无激素培养基中培养 3 d((a)和(b)), 6 d(c), 9 d(d)和 15 d(e)的嫁接接合部 IAA 的动态变化
sc 示接穗, st 示砧木, gu 示接合部, 箭头示银颗粒. 80
3.2 IAA 在嫁接体发育过程中的作用 IAA 在植物体内广泛分布[7 10], 参与细胞伸长 分裂和分化. 本实验发现 IAA 在表皮分
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简报
第 45 卷 第 8 期 2000 年 4 月
光显色 6 8 min, 用自来水冲洗以终止反应. 显微镜下观察并照相. 为保证定位结果的可靠性, 设置两种对照 (1) 溶液化学固定法固定生长素 切取嫁接
接合部并立即投入固定液(0.2 mol L−1 磷酸盐缓冲液, 4 多聚甲醛, 1 戊二醛, pH = 7.2)中, 迅速抽气至无气泡冒出 材料沉底为止(约 3~4 h), 经磷酸盐缓冲液充分洗涤后, 按常规制成 石蜡切片, 再用于正常的免疫染色 (2) 材料经冰冻干燥和气体固定, 染色时以正常兔 IgG 代 替 IAA 抗体, 其余过程与正常染色相同.
由图 3 可见, 当接穗培养基中加 IAA 1.0 mg L−1 和 ZT 0.25 mg L−1, 砧木培养基中加 ZT 0.25 mg L−1 时, 嫁接后第 3 天, 接穗中距接合部约 30 层细胞处 IAA 主要分布在维管组织和 表皮.
培养基中不含激素时, 接合部难以形成贯通接穗和砧木的维管束桥[2,3], 嫁接体发育过程 中接合部银颗粒较少, 动态变化不明显(图 4). 当接穗培养基中加 IAA 1.0 mg L-1 和 ZT 0.25 mg L-1, 砧木培养基中加 ZT 0.25 mg L-1 时, 实验时间内银颗粒明显多于培养基中不含激素 的对照, 颗粒数随嫁接体的发育呈动态变化(图 2). 嫁接后 3 d, 接合部已有愈伤组织细胞分化, 嫁接面接穗一侧(图 2(a))银颗粒略多于砧木一侧(图 2(b)). 嫁接后 6 d, 贯通接穗和砧木的维管 束桥开始分化形成, 银颗粒在嫁接面大量分布, 其中在维管束桥及周围一些分裂旺盛的薄壁 细胞(图 2(c)) 维管束切割部位及其周围(图 2(d)和(e))含许多银颗粒, 接穗和砧木银颗粒分布