免疫组织化学(荧光)方法及问题详解

目录：

1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1)

2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2)

3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4

4.免疫组织化学染色结果评价 (4)

5.免疫组织化学对照实验 (5)

6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6

7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7

8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8

9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9

10.非特异性荧光染色的消除 (9)

11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10

12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12

13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11)

14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12)

15.双重免疫荧光标记法 (13)

16.免疫荧光组织化学直接法 (13)

17.免疫荧光组织化学间接法 (14)

1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素

常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。

(1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。

(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为

620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。

(3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。

(4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素

类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。

(5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。

(6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。

(7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。

2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色

免疫荧光组织化学(immunofluorescence histochemistry)或免疫荧光细胞化学(immunofluorescence cytochemistry)是将荧光作为标记物的免疫组织化学技术。1942年，Coons等首次报道用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，从此开创了免疫荧光组织化学技术的先河。随着荧光标记技术和单克隆抗体技术的不断发展和激光扫描共聚焦显微镜的应用，使免疫荧光组织化学的特异性、快速性和在细胞、分子水平定位的敏感性与准确性大大提高。它能将生物样品形态、功能和代谢密切结合，在细胞、亚细胞水平原位检测抗原分子，这是其他任何生物技术难以取而代之的。故目前免疫荧光组织化学技术已成为生物学、基础医学和临床医学各学科领域常用研究方法之一。

免疫荧光组织化学技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体(或抗原)标记荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原(或抗体)反应，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物，这种复合物上的荧光素受激发光照射而发出各种颜色荧光，利用荧光显微镜观察，即可对组织细胞中的抗原或抗体进行定性、定位乃至定量研究。蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光组织化学技术检出。

若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。

有时存档蜡块不能再用以切片，可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再进行免疫荧光或其他免疫细胞化学染色。

3.免疫荧光组织化学技术的荧光

荧光(fluorescence)是某些物质被一定波长的光(如紫外光)照射后能发射出一种比激发光更长的光。光的吸收具有高度选择性，即一定能量的光量子辐射，只能被一定结构的物贡分子或原子所吸收，如石英玻璃几乎不吸收可见光，但有较强的吸收红外光作用。利用物质对光吸收的高度选择性，可制成各种滤片(如荧光显微镜中的激发滤片和阻断滤片)，吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颈色的荧光。

茧光产生示意圈