免疫组织化学(荧光)方法及问题详解
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫组织化学染色过程中出现问题及对策
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
荧光免疫组织化学技术
荧光免疫组织化学技术一、概述荧光免疫组织化学技术（Fluorescent Immunohistochemistry，简称IHC）是一种用来检测组织中特定蛋白质表达及其定位的重要工具。
通过使用荧光标记的抗体与组织标本中的特定抗原相结合，荧光免疫组织化学技术能够提供可视化的结果，有助于研究人员深入了解细胞和组织中蛋白质的表达模式与定位。
本文将从多个方面介绍荧光免疫组织化学技术的原理、应用、优缺点以及对研究领域的意义。
二、原理荧光免疫组织化学技术的原理基于免疫印记反应和荧光探针的特性。
待检组织标本经过特定处理，包括固定、脱水和脱脂等步骤，以保持其形态和结构。
采用特异性的抗体与目标抗原结合，形成免疫复合物。
接下来，引入荧光标记的二抗与免疫复合物发生特异性结合，形成荧光信号。
在荧光显微镜下观察和分析荧光信号，以获得有关目标抗原在组织中表达和定位的信息。
三、应用领域荧光免疫组织化学技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
在基础研究中，荧光免疫组织化学技术被用于研究组织生物学过程、发育学、疾病发生机制等。
通过定量和定位分析蛋白质的表达和定位，可以帮助科研人员深入了解蛋白质与常见疾病之间的关系。
在临床诊断中，荧光免疫组织化学技术可以用于医学实验室中针对疾病相关标志物的检测，如癌症标记物、免疫学指标等。
荧光免疫组织化学技术的高灵敏度和高特异性使其成为现代医学诊断技术中不可或缺的工具。
四、优点与挑战1. 优点：（1）高灵敏度：荧光免疫组织化学技术具有较高的灵敏度，能够检测到很低浓度下的目标抗原。
（2）高特异性：通过选择性地使用荧光标记的抗体与目标抗原结合，可以提供高度特异的检测结果。
（3）可视化结果：荧光免疫组织化学技术能够提供清晰的可视化结果，有助于研究人员直观地观察和分析目标抗原的定位和表达情况。
2. 挑战：（1）非特异性背景信号：在使用荧光免疫组织化学技术时，可能会出现非特异性背景信号，干扰对目标抗原信号的准确分析。
免疫组织化学常见问题和解决方法
巨噬细胞吞噬各种抗原物质或 Fc 片断而出现胞浆着色 内源性生物素的着色
组织在缓冲液（如二甲苯）中 浸泡时间太长 组织变干 不适当的修复方式
较多的切片 如果制片过程中，因丙酮逐渐 挥发而胶变浓时可适当加入一 些丙酮。 加一抗前的血清封闭避免非特 异型的结合
将抗体分装在小管中，冻存于 -20 度，每次使用取一管，避 免抗体反复冻融及交叉污染。 可用过氧化氢封闭去除内源酶 导致的非特异性着色 通过形态学辨认出巨噬细胞
余的缓冲液（但防止切片干燥）
孵育时切片未放平，导致抗体 孵育时，注意切片应水平放置
流失
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过 10 分钟
不适当的标本固定方式
选择合适的固定方法
不适当的抗原修复方式
延长抗原修复时间，或者调整
抗原修复体系，建议参照生产
厂家的说明，同时结合标本的
具体情况来确定
抗体浓度过高
降低抗体滴度（一般只浓缩性
3. 非 特异 性背 景染 色
全片着色
切片边缘着色
“阴阳脸”着色 灶片状着色
少于 60 分钟
抗体孵育时间过短
抗体孵育时间不能少于 60 分
钟
标本中目的蛋白表达量低
查阅文献或数据库，确定组织
中确有目的蛋白强表达。设立
阳性对照片，以验证实验结果
操作中，切片遗留太多冲洗液， 每步滴加试剂前沥干切片中多
导致试剂稀释
免疫组织化学常见问题和解决方法
免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组 织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性和分子生物技术的敏感性等巧妙结合，借助显微镜的显像和放大作用，在 细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以 及受体等），是单一的静止的形态学描述，上升到结构、功能和代谢为一体的动 态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。
免疫组织化学、免疫荧光染色
免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。
这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。
免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。
在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。
接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。
再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。
常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。
这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。
免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。
在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。
当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。
这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。
两种技术都有其应用范围。
免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。
而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。
总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。
选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。
免疫荧光组织化学法
免疫荧光组织化学法
免疫荧光组织化学法是一种通过荧光素非同位素或荧光染料来标记物质结构的方法。
它的主要原理是利用抗体与特定抗原相互作用的特性，将标记信号输出到需要检测的组织中，从而实现对组织的检测。
1.取得试样组织，切成合适的大小并固定。
2. 在抗原取向的芯片上选择合适的抗体，将其加入到试样组织中，等待抗体与试样
组织中的抗原相互作用。
3. 将芯片经过多次洗涤，去除非特异性结合物质，保留与试样特异性结合的抗体。
4. 加入荧光素标记的二抗素，等待其与特异性抗体发生结合。
5. 经过多次洗涤，去除未结合的二抗素。
6.将芯片置于显微镜下，利用荧光显微镜观察，通过检测荧光信号，确定目标物质的
位置、含量和分布情况。
1. 荧光素非同位素或荧光染料具有较强的荧光发射度，对于极小量的试样也能形成
较强的荧光信号，提高了检测灵敏度和分辨率。
2. 免疫荧光组织化学法无需切片和染色处理，可以保留试样的原始形态和构成信息，避免了染色造成的信息丧失和误判。
3. 抗原抗体的结合方式为特异性结合，可对单一的分子或组分进行检测。
4. 可以同时对多种抗体或标记物进行检测，方便多因素检测。
5. 操作简便，检测速度快，适用于大样本、高通量的试验。
尽管在某些情况下，免疫荧光组织化学法也具有其局限性，例如存在背景荧光、抗体
的交叉反应、荧光素的褪色等问题，但其实验过程清晰简单，数据处理方便易行，目前在
医学、生物学领域得到了广泛应用。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫组织化学（荧光）方法及问题详解
免疫组织化学（荧光）⽅法及问题详解⽬录：1.常⽤于免疫荧光组织化学染⾊的荧光素 (1)2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染⾊ (2)3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,44.免疫组织化学染⾊结果评价 (4)5.免疫组织化学对照实验 (5)6.免疫组织化学技术应⽤的基本原则……………………………….5,67.SABC法与其他免疫组织化学染⾊⽅法⽐较…………………….6,78.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,89.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染⾊…………………8,910.⾮特异性荧光染⾊的消除 (9)11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,1012.补体法免疫荧光组织化学染⾊步骤……………………………11,1213.双重染⾊法免疫荧光组织化学染⾊步骤 (11)14.间接法免疫荧光组织化学染⾊步骤 (12)15.双重免疫荧光标记法 (13)16.免疫荧光组织化学直接法 (13)17.免疫荧光组织化学间接法 (14)1.常⽤于免疫荧光组织化学染⾊的荧光素常⽤于免疫荧光组织化学染⾊的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四⼄基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋⽩(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。
此外还有⼀些新型荧光染料，如量⼦点。
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于⽔和⼄醇，能与蛋⽩质结合，是检测组织细胞内蛋⽩质最常⽤的荧光探针。
它还能标记抗体，可⽤于免疫组织化学单染或多重染⾊。
缺点是在光照下易淬灭，易受⾃发荧光影响。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法，又称免疫细胞化学，是一种常用于检测生物组织或细胞中特定抗原的方法。
该方法基于抗体和抗原的特异性结合，通过标记荧光物质使抗原在显微镜下可见，从而实现对抗原的定位和分析。
免疫荧光法在医学诊断、生物研究和疾病治疗方面具有广泛的应用。
免疫荧光法主要有间接免疫荧光法和直接免疫荧光法两种常用的技术路线。
在间接免疫荧光法中，首先与待检测物质结合的主抗体通过蛋白A或其他特异性标记物结合于抗体上，然后将荧光染料标记的二抗与主抗体结合。
而在直接免疫荧光法中，待检测物质直接与荧光染料标记的主抗体结合。
免疫荧光法具有以下特点和优势。
首先，该方法可以实现高度特异性的抗原-抗体结合，提供了对生物组织或细胞中特定分子的具体定位。
其次，免疫荧光法能够同时检测多个抗原，通过使用不同的荧光染料标记不同的抗体。
这种多重染色技术为研究者提供了同时观察多种分子相互作用和定位的能力，有助于深入了解生物进程。
此外，免疫荧光法对样本的要求较低，可以应用于多种类型的样本，包括细胞培养、组织切片和体液等。
免疫荧光法在多个领域中发挥重要作用。
在医学诊断中，它常用于检测感染病原体、肿瘤标志物和自身免疫性疾病等。
例如，通过特定抗体的荧光染色，医生可以确定细菌或病毒是否存在，并根据染色的位置和强度进行病理诊断。
在生物研究中，免疫荧光法广泛应用于蛋白质定位、细胞信号传导和分子相互作用的研究。
此外，免疫荧光法还常被用于疫苗研发和疾病治疗中，通过精确定位抗原和荧光下标记药物，为新药的研发打下基础。
总之，免疫荧光法作为一种重要的实验技术，凭借其高度特异性、多重染色和样本适应性等优势，为生物学研究、医学诊断和药物开发提供了强有力的工具。
不断的技术创新和方法改进将进一步推动免疫荧光法在各个领域的应用，并为深入理解生物系统和疾病机理提供重要支持。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结１、方法操作不难,最大得难处就是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样您才敢大胆地改革先前得不对得方法步骤。
如抗体孵育条件主要就是抗体浓度、温度、时间,这三者一般就是相互成反比得(相对),其中浓度就是最重要得先决条件,温度决定反应得速度、时间决定反应得量。
就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温与,背景较浅;而３７度反应速度较快,时间较短;室温我不太提倡,除非您每次都把环境温度控制在一定得范围,否则,尽量选择前两者。
２、免疫组化最大得优势就是定位与定性。
相比于其她蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确,就是定位检测分析首选方法、尤其对于有些因子得转位研究十分有用。
３、免疫组化结果定量分析得前提就是高质量得染色切片。
免疫组化结果也能定量分析,但必须就是背景染色浅而特异性染色较深得情况下,分析最为准确,这种原则可能也4、免疫组化实验一定要设置阳就是我们日常审稿时判定研究结果得必备条件。
ﻫ性对照与阴性对照。
阳性对照一般就是用肯定表达这种抗原得切片来做;阴性对照一般就是用ＰＢS或非一抗替代一抗来进行反应,其余步骤均一致。
前者就是排除方法与实验系统有无问题;后者就是排除有无一抗外得非特异性染色、5、免疫组化得应用广泛,就是当前实验研究得最重要方法之一、如今发SCI论文时,明显感觉仅靠量化得数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎,可能就是怕您学术造假吧、当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否得鉴定标准就是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良得染色切片、我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟得反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质得切片与同一种抗体,做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗得种属来源都拿错了。
免疫荧光组织(细胞)化学技术：如何设置对照(直接法、间接法和
免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和
为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，
必须在初次试验时设置对照：
1、直接法
（1）标本自发荧光对照
标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称
为自发荧光。
（2）抑制试验
可分为一步方法和二步方法。
一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，
再加在标本上染色，结果应为阴性。
二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光
抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
（3）阳性对照
用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。
如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
2、间接法
（1）自发荧光对照：同直接法。
（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
（3）抑制试验：同直接法。
（4）阳性对照：同直接法。
结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。
3、补体法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释
液，结果应为阴性。
（6）阳性对照。
（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。
免疫荧光组织化学技术.doc
免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述二、免疫荧光组织化学的原理（一）直接方法1.检查抗原方法2.检查抗体方法（二）间接方法1.检查抗体夹心法方法2 .检查抗体方法 3 .检查抗原法（三）补体法1.直接检查组织内免疫复合物方法2.间接检查组织内抗原方法（四）双重免疫荧光组织化学标记方法（五）对照试验1.直接方法2.间接方法3.补体方法三、荧光抗体的制备（一）荧光素1.异硫氰酸荧光素2.四甲基异硫氰酸罗达明3.得克萨斯红Texas red4.其它荧光素（二）荧光素标记抗体的方法1. FITC标记抗体的方法 2 .四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法3 .藻红蛋白标记抗体方法4 .蓝色荧光素标记抗体方法（三）荧光抗体的质量控制 1 .染色特异性和敏感性的测定方法2. F/P比值的测定方法3.荧光抗体的保存四、免疫荧光组织化学染色方法（一）荧光抗体染色方法1.直接方法2.间接方法双层法3.间接方法夹心法4.补体方法5 .膜抗原荧光抗体染色方法6.双重染色方法7.荧光抗体再染色方法（二）荧光抗原染色方法五、荧光显微镜检查方法（一）荧光和荧光显微镜（二）荧光显微镜标本制作要求 1 .载玻片2 .盖玻片3 .标本4.封裱剂5.镜油（三）使用荧光显微镜注意事项（四）荧光图像的记录方法六、非特异性染色的消除方法（一）非特异性染色的主要因素（二）消除非特异性染色的方法 1.葡聚糖凝胶G-50柱层析法2 . DEAE纤维素柱层析法 3 .荧光抗体稀释法4.纯化抗原方法5.纯化抗体方法免疫吸收方法 6 .伊文氏蓝Evans blue衬染色方法七、现状与展望免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事1941建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞或组织化学。
它与葡萄球菌A蛋白SPA、生物素与卵白素、植物血凝素ConA等相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter FACS的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化对照和质量控制
阳性对照 阴性对照 免疫组化的标准化 外部质量控制体系
脱水、透明、封片、拍照
脱水、透明要彻底 封片时尽量避免留有气泡 拍照尽量在两周内 拍照尽量选择干净、清晰的视野，无杂质
无破碎组织 所拍照片尽量在同一种状态下，使背景保
持一致 照片标识清楚
背景染色较深的原因
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见 的原因之一。解决办法是，每次使用新抗 体前应当对其工作浓度进行测试，使每一 抗体个体化，找到适合自己实验室的理想 工作浓度
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决 办法是，严格执行操作规程，避免因遗忘 而造成时间延长。时间和温度要根据染色 结果进行调整
DAB染色后切片着色呈阴性结果
抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错 误
抗原修复不全或者不充分 组织切片本身这种抗原含量低 血清封闭时间过长 DAB孵育时间过短 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参
与反应
DAB显色时间的把握
（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下 控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗
Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查 组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法， 与免疫组化技术相比，定量可能更加准确； 也可定性和定位，但敏感性远远低于免疫 组化技术
ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或 组织匀浆中蛋白含量的检测，与免疫组化 技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检 测首选方法之一
脱片产生的原因和如何防止脱片
多聚赖氨酸玻片的质量问题 切片问题：切片较厚或者不均匀 组织本身的问题：癌症组织中坏死组织越
多越容易脱片 烤片的时间短、温度不够 操作的时候甩的过猛，有脱片嫌疑的片子
免疫组化技术及注意事项
4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部 分是免疫组化染 色的阳性表达成 分。处理目标是 通过测量图片中 黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋 白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其 灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定， 易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白 蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防 腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3， 否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天， 超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织 固定
脱水 透明 封片
冰冻 切片
阻断内 源性酶
显色 复染
二抗 处理
封闭 处理
一抗 处理
3.2 注意事项
组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。 不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差 异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的 固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片 以水性封片剂为主，染色切片不能久存。
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目录：1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1)2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2)3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,44.免疫组织化学染色结果评价 (4)5.免疫组织化学对照实验 (5)6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,67.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,78.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,89.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,910.非特异性荧光染色的消除 (9)11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,1012.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,1213.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11)14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12)15.双重免疫荧光标记法 (13)16.免疫荧光组织化学直接法 (13)17.免疫荧光组织化学间接法 (14)1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。
此外还有一些新型荧光染料，如量子点。
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。
它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。
缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。
最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。
(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。
最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。
(3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。
最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。
(4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。
这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。
常用于多重染色。
Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。
但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。
Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。
由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。
通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。
(5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。
其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。
最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。
(6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。
无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。
最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。
(7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。
量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。
当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。
量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。
2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色免疫荧光组织化学(immunofluorescence histochemistry)或免疫荧光细胞化学(immunofluorescence cytochemistry)是将荧光作为标记物的免疫组织化学技术。
1942年，Coons等首次报道用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，从此开创了免疫荧光组织化学技术的先河。
随着荧光标记技术和单克隆抗体技术的不断发展和激光扫描共聚焦显微镜的应用，使免疫荧光组织化学的特异性、快速性和在细胞、分子水平定位的敏感性与准确性大大提高。
它能将生物样品形态、功能和代谢密切结合，在细胞、亚细胞水平原位检测抗原分子，这是其他任何生物技术难以取而代之的。
故目前免疫荧光组织化学技术已成为生物学、基础医学和临床医学各学科领域常用研究方法之一。
免疫荧光组织化学技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。
根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体(或抗原)标记荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原(或抗体)反应，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物，这种复合物上的荧光素受激发光照射而发出各种颜色荧光，利用荧光显微镜观察，即可对组织细胞中的抗原或抗体进行定性、定位乃至定量研究。
蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光组织化学技术检出。
若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。
有时存档蜡块不能再用以切片，可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再进行免疫荧光或其他免疫细胞化学染色。
3.免疫荧光组织化学技术的荧光荧光(fluorescence)是某些物质被一定波长的光(如紫外光)照射后能发射出一种比激发光更长的光。
光的吸收具有高度选择性，即一定能量的光量子辐射，只能被一定结构的物贡分子或原子所吸收，如石英玻璃几乎不吸收可见光，但有较强的吸收红外光作用。
利用物质对光吸收的高度选择性，可制成各种滤片(如荧光显微镜中的激发滤片和阻断滤片)，吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颈色的荧光。
茧光产生示意圈荧先显微镜中常用光的波长与颜色的关系4.免疫组织化学染色结果评价对免疫组织化学染色所得结果的判断要持科学态度，根据对照实验准确判断阳性和阴性结果，排除假阳性和假阴性结果。
为使实验结果准确无误，应多次重复进行实验。
最后得出科学的结论。
为达此目的，首先应学会区别特异性和非特异性染色结果。
非特异性染色的特点是：细胞和间质染色无区别或间质染色更强；染色无特定部位，无结构性；染色五分布规律，某一部位均匀着色；染色出现在切片的干燥部位、边缘、刀痕或组织折叠处。
排除非特异性染色之后，应确定特异性染色在组织细胞中的部位和程度，并且考虑是否有必要进行半定量测定。
《一》以抗原表达模式定位1．细胞质内弥散性分布，多数免疫组织化学染色为胞质型阳性反应，如细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和波形蛋白(Vimentin)等。
免疫组织化学染色(SP法。
AEC显色)胚胎12天人员端脑背侧脑室区司见波形蛋L(Vimentin)免疫反应阳性细胞：其胞体位于脑室区。
一端伸出长突起到达软脑膜2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色。
3．胞浆内局限性点状阳性反应，如CDI$抗体的染色。
4．细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞标志物的染色均如此，如CD20。
5．细胞核阳性反应，如BrdU、Ki-67及雌、孕激素受体蛋白等。
有些抗原的阳性表达可同时出现在细胞的不同部位，如细胞质和细胞膜等。
《二》阳性染色结果定量1．计算免疫反应阳性细胞数方法是选择每个样品中10个非重叠视野，计算每个视野中的阳性细胞与总细胞数的百分比，取平均数，连续观察和计算至少二个条件相同的样品。
得出数据经统计学处理后可在计算机Microsoft Excel中作出柱形图。
2．另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0～25为阴性，25～50为+，50～75为++，75以上为+++。
此种判定方法容易出现人为误差，现已很少在论文中出现。
3．图像分析系统检测阳性结果。
5.免疫组织化学对照实验由于影响免疫组织化学染色结果的因素甚多，染色中必须有对照实验，否则不可能正确评价染色结果。
对照实验包括阴性对照、阳性对照和自身对照。
在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照．而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自身对照具有节约的意义。
观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞具有可信性。
免疫组织化学染色中对照片的设置非常重要．它是判断染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准。
常设的对照实验如下。
对照实验方法和结果分析6.免疫组织化学技术应用的基本原则免疫组织化学染色在生物医学研究中具有十分广泛的作用。
并且涉及许多研究领域。
但是，免疫组织化学技术也有其局限性，例如，组织细胞内的待测物质要有抗原性，而且需要有一定浓度方可检出；检出的免疫反应阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白，因此，在实验设计中应充分考虑这些特点。
如果实验需要证明已知蛋白为何种细胞合成，需采用分子原位杂交技术解决。
为引导初学者在实验设计中合理巧妙地运用免疫组织化学技术，将其应用的基本原则简述如下：1．确定细胞类型和形态组织细胞内有些蛋白具有组织特异性，如胶质原纤维酸性蛋白(gial fibrillary acidic protein，GFAP)只存在于星形胶质细胞内．神经丝蛋白(Neurofilament，NF)只存在于神经细胞内。
通常把这些具有组织特异性的蛋白称为标记性蛋白(Proteiniliaker)。