免疫组织化学SABC法

免疫组化原理、步骤及要注意的事项

免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。

直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。

免疫组化sabc法原理

免疫组化sabc法原理免疫组化SABC法原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体和免疫反应来检测组织样本中特定蛋白质的方法。

免疫组化技术的发展为研究细胞和组织中蛋白质的表达和定位提供了一种有效的手段。

在免疫组化技术中，SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是一种常用的放大方法，用于增强目标抗原的检测信号。

SABC法的原理是通过将抗原特异性的一抗与生物素化的二抗结合，再利用亲和力很强的鸡蛋白素-链霉亲和素（Streptavidin-biotin）结合系统，将生物素与酶或荧光染料等标记物连接起来，从而使目标抗原能够被可视化。

具体而言，SABC法分为四个步骤：抗原修复、阻断、一抗孵育和二抗孵育。

首先是抗原修复，组织样本通常需要进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫活性。

抗原修复的方法包括热处理、酶解和酸性处理等。

接下来是阻断步骤，目的是阻止非特异性结合。

通常使用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）、小鼠血清、马血清和羊血清等。

然后是一抗孵育，将具有特异性的一抗与待检测的抗原结合。

一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择取决于实验的需求。

最后是二抗孵育，将生物素化的二抗与一抗结合。

二抗通常是兔源抗小鼠IgG的抗体，也可以是其他动物源的抗体。

生物素化的二抗通过亲和力结合到一抗上，形成免疫复合物。

在SABC法中，生物素与酶或荧光染料等标记物结合，常用的酶标记有辣根过氧化物酶（HRP），荧光标记有荧光素酶（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等。

这些标记物能够使抗原产生可见的颜色或荧光信号。

在目标抗原上添加底物，使酶催化底物产生可见的颜色反应，或者直接观察荧光信号。

通过显微镜观察或图像分析系统，可以定量分析目标抗原的表达和定位。

免疫组化SABC法具有高度特异性和敏感性，能够定量检测目标抗原在组织中的表达水平和定位。

它在研究细胞生物学、病理学和分子生物学等领域发挥了重要作用。

应用SABC法进行免疫组化染色的体会

应用SABC法进行免疫组化染色的体会SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。

由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。

它的步骤与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。

尽管SABC法操作简便，敏感性强，但是，在操作中仍然要遵循一定的原则，才能得到可信度高的结果。

我所做的是《……》（题目略去，是2003年获国家自然科学基金专项基金项目，批准号：302400**）的动物实验部分。

其中，需要利用抗β1-integrin观察深Ⅱ度烫伤大鼠局部在微电流治疗后β1-integrin的分布情况。

应用的方法就是SABC法，试剂盒（即用型）来自博士德公司（不是为该公司做广告）。

下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。

1、载玻片防脱片剂处理：应用多聚赖氨酸涂片时，应使用塑料容器稀释多聚赖氨酸，防止多聚赖氨酸过多吸附于容器上，在染色时出现脱片现象。

2、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。

乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。

3、灭活内源性酶：博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。

4、抗原修复：由于β1-integrin在细胞膜上表达，因此没有必要进行热修复抗原或者微波修复抗原，只用到了抗原修复液。

5、正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。

室温低，时间就要长一些，反之亦然。

另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。

后面的步骤也是如此。

6、一抗（抗β1-integrin）反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。

一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。

一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是在自讨苦吃。

sabc免疫组化法

sabc免疫组化法SABC免疫组织化学法（Streptavidin-Biotin Complex Immunohistochemistry）是一种常用的免疫组织化学技术，于1980年由Hsu等人首次提出，其基本原理是利用亲合素-生物素结合系统来增强免疫反应的信号和灵敏性。

该技术广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域，用于检测和定位各种细胞和组织中的抗原或分子标记物，具有高灵敏度和高特异性的特点。

SABC免疫组织化学法的基本步骤如下：1. 样本固定：将待检测的细胞或组织固定在载玻片上。

常用的固定方法包括冰乙酸法、乙醇法和甲醛法等。

2. 抗原修复：由于组织样本在固定过程中可能导致抗原受损或掩盖，所以需要进行抗原修复。

抗原修复的方法有热处理、酶消化和酸碱处理等。

3. 阻断非特异性结合：添加合适的蛋白质阻断液，防止非特异性结合。

4. 一抗孵育：将第一抗体孵育在样本上，第一抗体可以是多种来源，如小鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体等，与目标抗原结合。

5. 二抗孵育：将牛、羊或马等动物来源的生物素化的二抗孵育在样本上，二抗的特异性是由于其与人样本中免疫球蛋白的Fc区域结合而实现。

6. ABC复合物孵育：加入经过某种方式标记的ABC复合物，ABC复合物是指由Streptavidin（链霉亲和素A）和生物素化的过氧化物酶（HRP）构成的复合物，通过亲合素与生物素之间的高亲和力实现复合。

7. 标色显色：通过添加染色剂(如DAB)和过氧化氢等试剂，使得过氧化物酶催化反应产生沉积的有色产物。

8. 反应停止：用蒸馏水冲洗玻片，停止显色反应。

9. 后处理及封片：将玻片脱水，用透明剂固定标本，然后盖上封片剂，最后用显微镜观察和分析结果。

SABC免疫组织化学法的优点是具有高灵敏度和高特异性，对于目标抗原的检测和定位有较好的效果。

通过使用链霉亲和素A和生物素结合系统，可以增强免疫反应的信号，提高检测和定位的灵敏性。

此外，该方法简单易行，结果易于解释和分析，广泛应用于组织病理学和细胞生物学领域。

神经实验5 小鼠脑片免疫组织化学

实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法）实验一、实验目的了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验操作步骤。

二、实验原理免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。

一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。

在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。

免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。

如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。

只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。

定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。

免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。

三、实验器材略四、实验步骤1. 载玻片准备将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。

免疫组化sabc法原理

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的组织学技术，用于检测组织切片中特定蛋白质的表达和定位。

SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是免疫组化中常用的一种放大方法，用于增强目标物抗原与抗体之间的相互作用信号。

SABC法的原理如下：
1. 标本处理：组织切片首先经过脱脂、脱水和抗原修复等预处理步骤，以恢复抗原的免疫表位和提高抗体的渗透性。

2. 抗体结合：将特异性一抗体（primary antibody）加入组织样本中，一抗体会与目标蛋白质的表位结合。

3. 生物素化二抗：加入经过生物素化的二抗体（biotinylated secondary antibody）。

这种二抗体能够识别并结合在一抗体上，产生一抗体-二抗体复合物。

4. 孵育期间的缓冲洗涤：经过一定周期的孵育，使一抗体-二抗体复合物与目标物结合，并去除未结合的二抗体。

5. 锚定生物素化二抗体：加入链霉亲和素（streptavidin）与复合物中的生物素化二抗体结合，形成一抗体-二抗体-链霉亲和素复合物。

6. 辐射性表记物：加入辐射性或发光性标记的链霉亲和素。

这些标记物能够与链霉亲和素结合。

7. 显色/可视化：使用辐射性或发光性探针，对标记的链霉亲和素进行可视化分析，通过显色或成像技术观察标记物的分布。

通过SABC法，可以增强目标蛋白质与抗体之间的相互作用信号，提高免疫组化的敏感性。

链霉亲和素和生物素的高度特异性结合是SABC法的关键步骤，这一复合体结合使得目标蛋白质能够更好地被可视化和检测。

IF实验步骤

免疫荧光组织化学实验步骤（石蜡切片，SABC法，博士德）第一天：1. 二甲苯Ⅰ脱蜡 20min2. 二甲苯Ⅱ脱蜡 15min3. 二甲苯Ⅲ脱蜡 10min（二甲苯脱蜡时间视温度而定，温度高时间就短，温度低则时间就长）4. 无水乙醇Ⅰ 5min5. 无水乙醇Ⅱ 4min6. 95％酒精 2min7. 90％酒精 1min8. 80％酒精 1min9. 70％酒精 1min10. 石蜡切片过完酒精后，将其浸入蒸馏水中2min。

11.我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用中高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。

到时间后将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。

（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）12. 甩干玻片，用免疫组画笔在组织周围画圈，然后滴加稀释的正常血清封闭，室温30min，以减少非特异性染色。

13. 甩去封闭液，不洗。

每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒，4℃过夜；第二天：14. 37℃复温30min（根据具体情况确定），PBS冲洗3次，每次3min；15. 在玻片上滴加稀释的生物素化二抗，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗去二抗，3min×3次；16. 在玻片上滴加稀释的SABC-FITC(或SABC-CY3)，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗5min×4次；17. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育5min，可对标本进行染核，PBS 3min×4次洗去多余的Hoechst 33342（或DAPI），用滤纸擦去标本外的PBS；（选做）18. 用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察。

免疫组织化学实验SABC-HRPPOD法的标准操作规程(SOP)

免疫组织化学实验SABC-HRPPOD法的标准操作规程（SOP）SOP编号：SOP-YK-QT-013-1 页数：3制定人：审核人：批准人：（签名、日期）（签名、日期）（签名、日期）生效日期：颁发日期：修订登记：审查登记：一、目的对细胞中的某种蛋白质或多肽进行定位、定量。

二、准备：1.材料：新鲜组织细胞2.试剂：2.1蒸馏水；PBS（PH7.2-7.6）；30%H2O2；树脂；丙酮；TritonX-1002.2一抗2.3 SABC-HRP试剂盒（SABC-HRPkit）正常血清：与二抗同种的动物血清。

生物素化二抗：亲和纯化抗体，标记长臂生物素SABC液：Strept Avidin-Bioton-Horseradish Peroxidase Complex2.4 3，3-二氨基苯联胺（DAB）2.5苏木精2.6二甲苯，透明Ⅰ、Ⅱ2.7乙醇，上行梯度（100%Ⅰ、Ⅱ，95%，90%，80%，70%）3.器材：盖玻片、微量移液器、移液器吸头、湿盒、染色缸、温箱、免疫组化笔、冰箱、EP管、搅拌器三、操作方法：1.将新鲜组织切片或细胞涂片在4℃丙酮中固定20-30min，晾干。

2.加1% TritonX-100，室温下5-15 min，PBS冲洗2min×3次。

3.0.3% H2O2-甲醛室温下处理标本15-30 min，灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗2min×3次。

4.滴加二抗同种动物来源正常血清封闭液20цl , ( 1:10蒸馏水, 封闭组织上带电荷基团,去除其与一抗的非特异性结合)，室温20 min.甩去多余液体,不洗。

5.滴加一抗( 1:100PBS) 20цl , 4℃过夜。

0.01MPBS洗2min ×3次。

6.滴加二抗(1:100PBS) 20цl , 37℃，20 min。

0.01MPBS洗2min×3 次。

7.SABC液20цl与0.01MPBS 1ml混匀，30 min后取20цl，37℃孵育20 min。

免疫组织化学常用技术方法大全

ABC法特点：法特点：法特点敏感性强， ■ 敏感性强，具有放大作用特异性强， ■ 特异性强，背景染色淡 ■ 方法简便，节约时间方法简便， ■ 由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，踪物结合的能力，可用于双重或多重染色
注意事项内源性生物素活性及其消除： ● 内源性生物素活性及其消除：肝、肾、白细胞、乳腺预先以白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和抗生物素和 0.01%生物素溶液分别作用 min，以消除生物素溶液分别作用20 生物素溶液分别作用，内源性生物素。内源性生物素。试剂的差异，应进行预实验。 ● 试剂的差异，应进行预实验。试剂盒保存以4℃为佳。 ● ABC试剂盒保存以 ℃为佳。试剂盒保存以
一、基本原理抗生物素（卵白素）抗生物素（卵白素） avidin
分子量68 分子量68 000 糖蛋白维生素H）生物素（维生素） biotin 分子量 244
biotin
biotin
avidin
biotin
biotin
生物素-过氧化酶复合物技术二、抗生物素-生物素过氧化酶复合物技术抗生物素生物素
免疫组织化学常用方法大全
基本原理与操作步骤
第一节
免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，最常用方法，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学手段，检测某种物质（抗原／抗体）学手段，检测某种物质（抗原／抗体）在组织细胞内的存在部位。在组织细胞内的存在部位。即预先将抗体与酶连结（酶标抗体），再使其与组体与酶连结（酶标抗体），再使其与组），织内特异性抗原反应，织内特异性抗原反应，经细胞化学染色后，在光镜或电镜下观察分析。在光镜或电镜下观察分析。

免疫组织化学技术操作流程

免疫组化的流程多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）Cat.No.: SGP8920 Size: 10mlConc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃Thimerosal, 0.01%, added as preservative多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。

也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

[使用说明]免疫学操作步骤（可直接在玻片上涂布）1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

2．用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃3．将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。

注意增加时间不会提高包被效果。

4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

[注意]1．每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。

2．用之前的玻片必须保持清洁。

必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

4．释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

5．用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

[订货信息]￥100 / 10ml免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

免疫组化SP法与SABC

免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组织化学的方法有多种,其实都大同小异,不同点只是在于显色基团！
SP法
1）脱蜡、水化;
2)ＰBS洗2～３次各5分钟；ﻫ3）３%H2Ｏ2(80%甲醇）滴加在TMA上,室温静置10分钟;
8）PＢS洗三次每次2分钟。ﻫ9）滴加生物素化二抗，２０℃～3７℃２０分钟。
10）PBC洗３次每次2分钟。
11）滴加试剂SABC,20℃～３7℃20分钟。
1２)PBS洗4次每次5分钟。ﻫ１3)DＡB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
14）蒸馏水洗。苏木素复染２分钟、盐酸酒精分化。ﻫ1５)脱水、透明、封片、镜检。
(A★为ＨRP标记的卵白素)Ａ★与2抗的生物素结合,aｖiｄｉn起桥联作用。如将该法中的卵白素（ａvｉdｉｎ)变换成链霉卵白素（stｒｅｐtａvidin）,LＡB法即成LsAＢ法,或称SP法。
据认为LAB法比ABC法敏感2~４倍，而ＬsＡB法因strｅptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。
免疫组化ＳP法与SABC
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ABＣ法:ABC代表的是亲和素－生物素-过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。
SＰ法
1脱蜡水化
2蒸馏水中5分钟
3用蒸馏水或PＢS配置新鲜的3%H2Ｏ2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次ﻫ4抗原修复

SABC法

一、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。

2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。

3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。

自然冷却，再用3分钟×3次.5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。

倾去，勿洗。

6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最好复温）。

PBS冲洗，3分钟×5次。

7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。

8）PBS冲洗，3分钟×5次。

9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。

10）PBS冲洗，3分钟×5次。

11）显色剂显色（DAB等）。

12）自来水充分冲洗。

13）可进行复染，脱水，透明。

14）选择适当的封片剂封片。

二、即用型二步法1）脱蜡、水化组织切片。

2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。

3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS 冲洗。

4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。

5）滴加enhangcer增强剂，37度30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。

6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。

7）应用DAB溶液显色。

8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

细胞免疫组化(SABC法)

细胞免疫组化（SABC法）步步看：细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！实验准备：实验用品：移液枪：1ml、200ul、10ul枪头：1ml、200ul、10ul枪头盒：1ml、200ul、10ulEP管：1.5ml湿盒需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。

试剂：细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒操作步骤：一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。

二、组化前处理1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；3、PBS漂洗，3x2min；4、0.5%Txiton X-100处理（室温）20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、3%H2O2处理（室温）15min；7、PBS漂洗，3x2min；三、组化1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；3、PBS漂洗，3x2min；4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；7、PBS漂洗，3x4min；8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。

SABC法免疫组化操作步骤(精)

SABC 法免疫组化操作步骤
1. 脱蜡至水:
a 二甲苯Ⅰ 20min
b 二甲苯Ⅱ 20min
c3-8号酒精各 2min
2. 自来水冲洗 5min (水流要小
3.3%双氧水修复内源性过氧化氢酶 (30%的双氧水 1:9配置 100ml 室温 30min 注意避光;
4. 单蒸水洗 5min*2次, PBS 缓冲液洗 5min*1次
5. 热修复抗原,将切片浸入 0.01M 的枸橼酸盐缓冲液中,微波炉处理高火 5min , 低火 20min ,然后自然冷却;
6. 取出切片放入染色缸中, PBS 缓冲液洗 5min*1次
7. 取出切片放入湿盒中,滴加 5%BSA封闭液(以盖满组织为宜 ,室温 30min
8. 甩去封闭液滴加一抗 (盖满组织为宜阴性对照滴加等量 PBS 缓冲液, 最后放入 37℃烘箱中 2h
9. 放入染色缸中, PBS 缓冲液洗 5min*3次
10. 却出切片放入湿盒滴加二抗(覆盖满组织为宜室温 30min
11. 取出放染色缸中, PBS 缓冲液洗 5min*3次
12. 再放入湿盒中加 SABC (覆盖满组织为宜室温 30min
13. 取出放入染色缸中, PBS 缓冲液洗 5min*3次
14.DAB 显色; (取粉状 DAB 0.02g充分溶于 100ml 单蒸水中后加100μl 双氧水混匀,倒入染色缸中显色 14-15min ,镜下控制显色时间
15. 中止显色用单蒸水洗 5min*2次,自来水洗 5min
16. 苏木素复染 2min ,后自来水冲洗 2min ,然后盐酸分化 5s ,最后自来水冲洗10min
17.9-16号酒精各 2min ,最后二甲苯Ⅰ 8min ,二甲苯Ⅱ 5min
18最后中性树胶封片。

免疫组化SABC法操作流程

免疫组化SABC法操作流程1、洗载玻片将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37 ℃温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2、包埋组织先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3、切片将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 ℃温水中。

4、捞组织当组织载玻片置于40 ℃温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3 或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37 ℃温箱中烘干。

5、脱蜡依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15 min.6、抗原修复脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

结果判断标准
一些原则必须掌握：阳性细胞定位要在5%以上，才能定为阳性。参考评价： <5% - ， 5%-25% + ， 25%-50% ++， >50% +++ ～++++
P53

雌激素受体β在乳腺癌的表达
免疫组织化学SABC染色法
原理：
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度
亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过
氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后
与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。
用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗— ABC。最后用底物显色剂显色。
(3) 3%过氧化氢溶液，10min；
(4) PBS浸洗，×3次； (5) 使用封闭剂：每张切片滴加非免疫动物（羊）血清(与二抗同源)室温 10min；倾去血清，不洗！ (6) 每张切片滴加小鼠抗人CEA单抗（1:100）， 37℃ ，30min，或4℃过夜； (7) PBS浸洗，3次；
(8) 每张切片滴加第二抗体(1:100)，37℃，
⑴ lgG (anti-Mouse)
⑵ lgG (anti-Rabbit)

Straptived- HRP 复合物（SABC） A液（avidin）：亲和素 B液（biotin）：生物素-HRP

显色剂：浓缩DAB H 2O 2 Buffer
实验步骤:
(1) 结肠癌石蜡切片脱蜡下行酒精入水； (2) PBS浸洗，×3次；
20min； (9) PBS冲洗，×3次； (10)每张切片加100lSABC溶液(1:100)，37℃， 20min； (11)PBS冲洗，×3次； (12)新鲜配制的底物 DAB溶液，3～5min； (13)自来水冲洗，脱水，透明，中性树胶封固。

免疫组化SABC法操作流程表

免疫组化SABC法操作流程注意事项1.片子着色不均匀的原因如下：1.脱蜡不充分。

可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；2.水化不全。

应经常配制新鲜的梯度乙醇；3.抗体没混匀。

用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；4.抗体孵育时，切片放倾斜；5.抗体孵育后PBS冲洗不充分。

6.制片厚薄不均匀等问题。

染片盒不平，切片倾斜。

2.切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？o抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；o一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；o内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；o非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；o DAB显色时间过长或浓度过高；o PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；o标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。

试剂配制3%过氧化氢甲醇：30% H2O2 10ml + 纯甲醇90ml→充分混匀0.3%过氧化氢甲醇：30% H2O2 1ml + 纯甲醇99ml→充分混匀免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：Na Cl 8.5g+磷酸氢二钠（无水）2.8g+磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。

然后测pH值使之在7.2—7.6。

如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。

0.3%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。

它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。

贮存液：30% Triton X-100：Triton X-100 28.2ml + 0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml，37℃水浴中2～3h工作液：0.3%Triton X-100 ：30% Triton X-100 2ml用0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4)定容至200ml。

免疫组化SP法与SABC

ABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。

利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。

但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。

SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。

PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。

最大的优点是不受种属的特异性限制。

此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。

两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC 复合物即链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。

SABC步骤：切片常规脱蜡、脱水；30％H2O2＋蒸馏水10份混合，室温5－10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加5％BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，37℃1小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下20分钟，PBS（PH7.2－7.6）洗；滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS洗5分钟×4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中 A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。

显微镜下观察。

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同点只是在于显色基团！SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。

神经实验5 小鼠脑片免疫组织化学

实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法）实验一、实验目的了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验操作步骤。

二、实验原理免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。

一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。

在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。

免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。

如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。

只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。

定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。

免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。

三、实验器材略四、实验步骤1. 载玻片准备将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。

简便快速极敏感的一种免疫组化染色法──SABC法

简便快速极敏感的一种免疫组化染色法──SABC法
孙幼芳;余景瑞;王凡英
【期刊名称】《铁道医学》
【年(卷),期】1995(23)4
【摘要】简便快速极敏感的一种免疫组化染色法──ＳＡＢＣ法孙幼芳，余景瑞武汉铁路中心医院病理科４３００６４王凡英武汉铁路成人卫校４３００６４ＡＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＣｏｎｖｅｎｉｅｎｔＲａｐｉｄａｎｄＥｘｔｒｅｍｅｌｙＳｅｎｓｉｔｉｖｅ－...
【总页数】2页(P197-198)
【关键词】SABC染色;免疫组化染色法
【作者】孙幼芳;余景瑞;王凡英
【作者单位】武汉铁路中心医院病理科,武汉铁路成人卫校
【正文语种】中文
【中图分类】R446.61
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