免疫组织化学技术
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抗原时
• 内源性生物素/亲和素：有些组织如肾脏、肝脏、脾
脏含有很高的内源性生物素，如使用SP或者ABC试 剂盒需要进行封闭
• 封闭条件：室温 30-120mins • 如是HRP系统，则同时需要使用3% H2O2室温10-
30mins淬灭内源性HRP的活性
5、一抗孵育
• 选择验证过待测种属和实验方法的一抗 • 根据说明书上推荐的固定和修复方法处理标本 • 说明书推荐的稀释比例仅作参考，需要根据标
本类型来摸索最佳稀释比例
• 一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如
PBS(T) /TBS(T)中4℃过夜
6、二抗及酶标记物孵育
➢根据一抗的来源和Ig亚型选择合适的二抗 ➢根据说明书推荐的稀释比例和标本类型摸索
最佳稀释比例
➢一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如
PBS(T) /TBS(T)中室温(RT) 30-60mins
免疫组织/细胞化学
IHC/ICC
主要内容
• 免疫组织化学概况 • 免疫组化实验步骤和试剂 • 常见问题及处理方法 • 多色标记
免疫组织/细胞学简介
免疫组织学
是一种把分子水平的物质在组织原位通过 抗原抗体反应和组织化学的呈色反应进行定性、 定位测定，准确具体表达出来的一种方法。这 些分子水平的物质可能与癌细胞、蛋白质、多 肽、酶、激素、病原体以及受体等等有关
酶免疫组织化学（IHC）常用方法
❖ PAP/APAAP：二抗-HRP/AP + HRP-抗HRP/AP； ❖ LAB/LSAB：二抗 – 生物素(Biotin) + HRP-亲和素； ❖ S-P/SAP： 二抗 – 生物素 + 链酶亲和素-HRP/AP； ❖ ABC/SABC：亲和素/链酶亲和素-生物素化HRP/AP复合物； ❖非Biotin/Avidin方法/Envision两步法：二抗直接偶联酶
➢荧光免疫组织染色（IF）
• 多用于冰冻组织切片或者细胞爬片
➢胶体金免疫组织染色（GIHC）
根据标本类型分类
• 石蜡切片：用酶免疫组织染色 • 冰冻切片：多用荧光免疫染色 • 细胞爬片：多用荧光免疫染色
免疫组化相关名称
简写 ICC ICC/IF IHC-P IHC-Fr
IF IHC IHC (Methanol fixed) IHC (PFA fixed) IHC-FoFr IHC-FrFl IHC-G IHC-Glut IHC-M
590nm
• Texas Red：红色，激发波长589nm；发射波长570-
615nm
• Cy3：橙色，激发波长512/550nm；发射波长570nm • Cy5：红色，激发波长625/650nm；发射波长670nm
免疫组化实验注意事项
➢正确选配抗体
• 一抗必须是说明书上经过验证(tested application)可以用 于IHC(IHC-P;IHC-Fr)检测的
基本原理
• ABC法：先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成ABC复
合物，抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合， 形成巨大复合物（网络大量酶分子），最后显色。
二抗直接偶联酶的Polymer
俗称两步法
基本原理
• Envision两步法：抗原与抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚
中文名称 免疫细胞化学 免疫荧光（细胞标本） 免疫组织化学 (石蜡切片) 免疫组织化学 (冰冻切片)
免疫荧光 免疫组织化学
免疫组织化学 (甲醇固定) 免疫组织化学 (PFA 固定标本) 免疫组织化学 (灌注固定冰冻切片) 免疫组织化学 - Free Floating 免疫组织化学 (Glycolmethacrylate sections) 免疫组织化学 (PFA-glutharaldehyde fixed) 免疫组织化学 (Methylmethacrylate sections)
• 人肾脏，石蜡切片
Human卵巢 GATA-4 核染色
细胞质、细胞膜染色
• 骨组织 β-catenin 免疫组化
不同的酶，不同底物 荧光检测
• 适用于中性福尔马林固定的石蜡切片、冰冻
切片、细胞爬片
多色检测操作程序
第一个抗原检测 第二个抗原检测
多色标记抗体选择
• 一抗最好是不同动物来源的 • 选择验证过实验种属和方法的抗体 • 根据染色顺序选配合适的酶和底物
dopamine D1 receptor 免疫组化
化合物酶复合物（EnVision复合物），与第一抗体结合，进而由酶 作用底物进行显色定位。
荧光免疫组织染色方法
• 使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组
织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵 敏度高、操作简单的优点。
• 缺点是染色组织片不能长期保存
IF常用荧光素
• FITC：绿色，激发波长488nm；发射波长515nm • Rhodamine：橙色，激发波长570nm；发射波长570-
S-P/LAB方法
复合物:链酶亲和素-HRP/AP
基本原理
• S-P/LAB方法:一个亲和素和多个标记酶（HRP）结合，多个生
物素与抗体（一抗或二抗）结合，细胞的抗原（或一抗）先与 生物素化的抗体结合，既而将酶标记的亲和素结合在生物素上， 最后进行显色反应定位。
ABC方法
ABC复合物:亲和素-生物素化HRP/AP A－亲和素，B－生物素，C－复合物
➢也可以选择商业化的试剂盒：SP,ABC或者
两步法
7、显色
根据所用酶类型选择合适的显色底物
HRP
AP
AEC（red)
Fast Red(pink)
DAB(brown/gray)
BCIP/NBT(blue/violet)
8、复染
苏木素(染核,蓝色)
甲基绿(染核,Biblioteka Baidu绿色)
核固红(染核, 红色)
AEC,DAB,AP
技术平台
➢组织切片或细胞爬片 ➢纯化的一抗（单克隆或多克隆） ➢标记的二抗(酶、金颗粒或者荧光） ➢显色系统（DAB、AEC、BCIP/NBT、FAST RED等） ➢ 检测系统（普通或荧光显微镜）
免疫组织学方法分类
➢酶免疫组织化学染色（IHC）
• IHC-Fr：冰冻切片 • IHC-P：石蜡切片
➢非加热修复技术
• 胃蛋白酶(细胞内抗原): 0.4%,37℃,30mins • 胰酶(细胞间抗原): 0.05-0.25%,37℃,10-15mins • Proteinase K : 20ug/ml
4、封闭
• 正常血清(5-10%)：阻断组织内源IgG、Fc-R • BSA (5%) ：阻断组织内源IgG、Fc-R • 特殊封闭试剂：当使用小鼠源性抗体检测小鼠组织
1、载玻片处理
• 重酪酸钾浓硫酸浸泡24h－ddH2O漂洗—95%乙醇
浸泡12h
• 防脱粘片剂处理：
Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent
• 可直接购买处理好的载玻片
2、组织固定
标本类型及常用固定液
石蜡切片
冰冻切片
组织固定液 特点
10%中性福尔马林 冷丙酮，4%多聚甲
免疫组化基本操作步骤 及需要的试剂
免疫组化基本操作步骤
Envision二步法操作步骤
• 1、组织切片60℃预热 • 2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水） • 3、抗原修复 • 4、PBS/T洗3次，5min/次 • 5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP） • 6、PBS/T洗3次，5min/次 • 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R） • 8、一抗4 ℃孵育过夜 • 9、PBS/T洗3次，5min/次 • 10、二抗RT 30min • 11、PBS/T洗3次，5min/次 • 12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度 • 13、充分水洗 • 14、苏木素复染核 • 15、1%盐酸酒精分化 • 16、充分水洗返蓝 • 17、脱水、透明，中性树胶封片
• 抗体浓度过高：降低抗体浓度、建议4℃过夜 • 选择纯化的抗体 • 设置阳性对照
➢ 试剂污染：重新配置新的缓冲液和试剂
染色弱常见原因
• 组织固定、包埋时抗原被破坏 • 抗原位于细胞内，未使用破膜剂(尤其是定位于细
胞核)
• 抗体浓度过低，孵育时间过短 • 操作中滴加试剂时缓冲液未漓干，致使试剂稀释 • 室内温度<15 ℃ • 过度封闭 • 试剂超过有效期 • 抗体保存不当导致活性降低 • 染色过程中未避光（荧光染色）
无阳性染色常见原因
• 操作错误（漏加试剂） • 组织中无抗原 • 固定、包埋、修复时抗原被破坏 • 修复方法不当 • 一抗与二抗不匹配 • 底物和酶不匹配 • 封闭过度 • 封片剂选择不当 • 一种或多种试剂活性降低或失活 • 抗原位于细胞内，未使用破膜剂
多标记检测
多标记染色法
• 适用于同一组织片2~3个不同抗原的检测 • 技术平台： 同样的酶，不同底物
Red/Fast Red, 免疫金-银染色
DAB, BCIP/NBT
BCIP/NBT
DAPI(染 核,兰色)
荧光
9、脱水/透明/封片
AEC,AP Red/ DAB,New Fuchsin,
Fast Red, 和其它 Vega Red,BCIT/NBT
有机染料
和其它水溶性染料
荧光染料
不需脱水、透明
脱水、透明
• 载玻片处理不充分 • 组织固定、脱水、透明不充分 • 组织切片太厚（>5um) • 组织切片有折叠 • 过度的热抗原修复（高压、微波、水煮） • 抗原修复液的pH值偏高 • 操作过程中冲洗方法不正确
非特异性背景染色
➢ 封闭不充分：增加封闭试剂浓度、延长封闭时间 ➢ 冲洗不充分：短时间多次数的洗涤更有效 ➢ 实验过程中切片干燥：试剂量充足，注意观察，避免干片 ➢ 组织切片折叠 ➢ 组织抗原弥散：组织标本及时固定，选择合适的固定液 ➢ 抗原修复不充分：更改修复方法，优化时间 ➢ 内源性生物素/亲和素：使用封闭试剂或者不用SP/ABC系统 ➢ 二抗原因：选择Fab段的抗体或者吸附过的抗体，设置二抗对照 ➢ 一抗原因：
脱水、透明
水溶性封片剂如 AEC封片剂
有机封片剂如中性树 胶
水溶性封片剂，最 好是含荧光抗淬灭 成分的(PE不能用含
甘油的封片剂)
10、结果观察
• 普通光学显微镜 • 荧光显微镜
IHC/ICC常见问题分析
常见问题及处理方法
• 组织脱片 • 非特异性背景染色 • 染色弱 • 无阳性染色
组织脱片常见原因
• 二抗必须是和一抗来源及亚型相配套的
➢正确设置合适的对照
➢正确选配固定方法和修复方法
➢正确选配显色系统
免疫组化实验对照设置
• 阳性对照：判断染色全过程和所有试剂的正确性：
A、内部对照：对照组织本身明确存在的抗原（二抗系统的 正确性）
B、外部对照：明确表达待测抗原的组织或细胞（一抗的工 作性）
• 阴性对照：明确不表达待测抗原的组织或细胞 • 二抗对照：不加一抗，余操作相同
4%多聚甲醛
醛
需要修复
不需修复，冷丙酮 固定不需破膜
细胞涂片
甲醇、乙醇 不需修复
如果待测蛋白位于细胞浆或者细胞核内，同时还需要进行破膜处理
3、抗原修复
➢加热修复技术
修复方法：微波加热修复、高压热修复、煮沸热修复：
常用buffer：柠檬酸Buffer:0.01M, pH6.0
EDTA buffer: pH9.0
• 内源性生物素/亲和素：有些组织如肾脏、肝脏、脾
脏含有很高的内源性生物素，如使用SP或者ABC试 剂盒需要进行封闭
• 封闭条件：室温 30-120mins • 如是HRP系统，则同时需要使用3% H2O2室温10-
30mins淬灭内源性HRP的活性
5、一抗孵育
• 选择验证过待测种属和实验方法的一抗 • 根据说明书上推荐的固定和修复方法处理标本 • 说明书推荐的稀释比例仅作参考，需要根据标
本类型来摸索最佳稀释比例
• 一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如
PBS(T) /TBS(T)中4℃过夜
6、二抗及酶标记物孵育
➢根据一抗的来源和Ig亚型选择合适的二抗 ➢根据说明书推荐的稀释比例和标本类型摸索
最佳稀释比例
➢一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如
PBS(T) /TBS(T)中室温(RT) 30-60mins
免疫组织/细胞化学
IHC/ICC
主要内容
• 免疫组织化学概况 • 免疫组化实验步骤和试剂 • 常见问题及处理方法 • 多色标记
免疫组织/细胞学简介
免疫组织学
是一种把分子水平的物质在组织原位通过 抗原抗体反应和组织化学的呈色反应进行定性、 定位测定，准确具体表达出来的一种方法。这 些分子水平的物质可能与癌细胞、蛋白质、多 肽、酶、激素、病原体以及受体等等有关
酶免疫组织化学（IHC）常用方法
❖ PAP/APAAP：二抗-HRP/AP + HRP-抗HRP/AP； ❖ LAB/LSAB：二抗 – 生物素(Biotin) + HRP-亲和素； ❖ S-P/SAP： 二抗 – 生物素 + 链酶亲和素-HRP/AP； ❖ ABC/SABC：亲和素/链酶亲和素-生物素化HRP/AP复合物； ❖非Biotin/Avidin方法/Envision两步法：二抗直接偶联酶
➢荧光免疫组织染色（IF）
• 多用于冰冻组织切片或者细胞爬片
➢胶体金免疫组织染色（GIHC）
根据标本类型分类
• 石蜡切片：用酶免疫组织染色 • 冰冻切片：多用荧光免疫染色 • 细胞爬片：多用荧光免疫染色
免疫组化相关名称
简写 ICC ICC/IF IHC-P IHC-Fr
IF IHC IHC (Methanol fixed) IHC (PFA fixed) IHC-FoFr IHC-FrFl IHC-G IHC-Glut IHC-M
590nm
• Texas Red：红色，激发波长589nm；发射波长570-
615nm
• Cy3：橙色，激发波长512/550nm；发射波长570nm • Cy5：红色，激发波长625/650nm；发射波长670nm
免疫组化实验注意事项
➢正确选配抗体
• 一抗必须是说明书上经过验证(tested application)可以用 于IHC(IHC-P;IHC-Fr)检测的
基本原理
• ABC法：先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成ABC复
合物，抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合， 形成巨大复合物（网络大量酶分子），最后显色。
二抗直接偶联酶的Polymer
俗称两步法
基本原理
• Envision两步法：抗原与抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚
中文名称 免疫细胞化学 免疫荧光（细胞标本） 免疫组织化学 (石蜡切片) 免疫组织化学 (冰冻切片)
免疫荧光 免疫组织化学
免疫组织化学 (甲醇固定) 免疫组织化学 (PFA 固定标本) 免疫组织化学 (灌注固定冰冻切片) 免疫组织化学 - Free Floating 免疫组织化学 (Glycolmethacrylate sections) 免疫组织化学 (PFA-glutharaldehyde fixed) 免疫组织化学 (Methylmethacrylate sections)
• 人肾脏，石蜡切片
Human卵巢 GATA-4 核染色
细胞质、细胞膜染色
• 骨组织 β-catenin 免疫组化
不同的酶，不同底物 荧光检测
• 适用于中性福尔马林固定的石蜡切片、冰冻
切片、细胞爬片
多色检测操作程序
第一个抗原检测 第二个抗原检测
多色标记抗体选择
• 一抗最好是不同动物来源的 • 选择验证过实验种属和方法的抗体 • 根据染色顺序选配合适的酶和底物
dopamine D1 receptor 免疫组化
化合物酶复合物（EnVision复合物），与第一抗体结合，进而由酶 作用底物进行显色定位。
荧光免疫组织染色方法
• 使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组
织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵 敏度高、操作简单的优点。
• 缺点是染色组织片不能长期保存
IF常用荧光素
• FITC：绿色，激发波长488nm；发射波长515nm • Rhodamine：橙色，激发波长570nm；发射波长570-
S-P/LAB方法
复合物:链酶亲和素-HRP/AP
基本原理
• S-P/LAB方法:一个亲和素和多个标记酶（HRP）结合，多个生
物素与抗体（一抗或二抗）结合，细胞的抗原（或一抗）先与 生物素化的抗体结合，既而将酶标记的亲和素结合在生物素上， 最后进行显色反应定位。
ABC方法
ABC复合物:亲和素-生物素化HRP/AP A－亲和素，B－生物素，C－复合物
➢也可以选择商业化的试剂盒：SP,ABC或者
两步法
7、显色
根据所用酶类型选择合适的显色底物
HRP
AP
AEC（red)
Fast Red(pink)
DAB(brown/gray)
BCIP/NBT(blue/violet)
8、复染
苏木素(染核,蓝色)
甲基绿(染核,Biblioteka Baidu绿色)
核固红(染核, 红色)
AEC,DAB,AP
技术平台
➢组织切片或细胞爬片 ➢纯化的一抗（单克隆或多克隆） ➢标记的二抗(酶、金颗粒或者荧光） ➢显色系统（DAB、AEC、BCIP/NBT、FAST RED等） ➢ 检测系统（普通或荧光显微镜）
免疫组织学方法分类
➢酶免疫组织化学染色（IHC）
• IHC-Fr：冰冻切片 • IHC-P：石蜡切片
➢非加热修复技术
• 胃蛋白酶(细胞内抗原): 0.4%,37℃,30mins • 胰酶(细胞间抗原): 0.05-0.25%,37℃,10-15mins • Proteinase K : 20ug/ml
4、封闭
• 正常血清(5-10%)：阻断组织内源IgG、Fc-R • BSA (5%) ：阻断组织内源IgG、Fc-R • 特殊封闭试剂：当使用小鼠源性抗体检测小鼠组织
1、载玻片处理
• 重酪酸钾浓硫酸浸泡24h－ddH2O漂洗—95%乙醇
浸泡12h
• 防脱粘片剂处理：
Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent
• 可直接购买处理好的载玻片
2、组织固定
标本类型及常用固定液
石蜡切片
冰冻切片
组织固定液 特点
10%中性福尔马林 冷丙酮，4%多聚甲
免疫组化基本操作步骤 及需要的试剂
免疫组化基本操作步骤
Envision二步法操作步骤
• 1、组织切片60℃预热 • 2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水） • 3、抗原修复 • 4、PBS/T洗3次，5min/次 • 5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP） • 6、PBS/T洗3次，5min/次 • 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R） • 8、一抗4 ℃孵育过夜 • 9、PBS/T洗3次，5min/次 • 10、二抗RT 30min • 11、PBS/T洗3次，5min/次 • 12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度 • 13、充分水洗 • 14、苏木素复染核 • 15、1%盐酸酒精分化 • 16、充分水洗返蓝 • 17、脱水、透明，中性树胶封片
• 抗体浓度过高：降低抗体浓度、建议4℃过夜 • 选择纯化的抗体 • 设置阳性对照
➢ 试剂污染：重新配置新的缓冲液和试剂
染色弱常见原因
• 组织固定、包埋时抗原被破坏 • 抗原位于细胞内，未使用破膜剂(尤其是定位于细
胞核)
• 抗体浓度过低，孵育时间过短 • 操作中滴加试剂时缓冲液未漓干，致使试剂稀释 • 室内温度<15 ℃ • 过度封闭 • 试剂超过有效期 • 抗体保存不当导致活性降低 • 染色过程中未避光（荧光染色）
无阳性染色常见原因
• 操作错误（漏加试剂） • 组织中无抗原 • 固定、包埋、修复时抗原被破坏 • 修复方法不当 • 一抗与二抗不匹配 • 底物和酶不匹配 • 封闭过度 • 封片剂选择不当 • 一种或多种试剂活性降低或失活 • 抗原位于细胞内，未使用破膜剂
多标记检测
多标记染色法
• 适用于同一组织片2~3个不同抗原的检测 • 技术平台： 同样的酶，不同底物
Red/Fast Red, 免疫金-银染色
DAB, BCIP/NBT
BCIP/NBT
DAPI(染 核,兰色)
荧光
9、脱水/透明/封片
AEC,AP Red/ DAB,New Fuchsin,
Fast Red, 和其它 Vega Red,BCIT/NBT
有机染料
和其它水溶性染料
荧光染料
不需脱水、透明
脱水、透明
• 载玻片处理不充分 • 组织固定、脱水、透明不充分 • 组织切片太厚（>5um) • 组织切片有折叠 • 过度的热抗原修复（高压、微波、水煮） • 抗原修复液的pH值偏高 • 操作过程中冲洗方法不正确
非特异性背景染色
➢ 封闭不充分：增加封闭试剂浓度、延长封闭时间 ➢ 冲洗不充分：短时间多次数的洗涤更有效 ➢ 实验过程中切片干燥：试剂量充足，注意观察，避免干片 ➢ 组织切片折叠 ➢ 组织抗原弥散：组织标本及时固定，选择合适的固定液 ➢ 抗原修复不充分：更改修复方法，优化时间 ➢ 内源性生物素/亲和素：使用封闭试剂或者不用SP/ABC系统 ➢ 二抗原因：选择Fab段的抗体或者吸附过的抗体，设置二抗对照 ➢ 一抗原因：
脱水、透明
水溶性封片剂如 AEC封片剂
有机封片剂如中性树 胶
水溶性封片剂，最 好是含荧光抗淬灭 成分的(PE不能用含
甘油的封片剂)
10、结果观察
• 普通光学显微镜 • 荧光显微镜
IHC/ICC常见问题分析
常见问题及处理方法
• 组织脱片 • 非特异性背景染色 • 染色弱 • 无阳性染色
组织脱片常见原因
• 二抗必须是和一抗来源及亚型相配套的
➢正确设置合适的对照
➢正确选配固定方法和修复方法
➢正确选配显色系统
免疫组化实验对照设置
• 阳性对照：判断染色全过程和所有试剂的正确性：
A、内部对照：对照组织本身明确存在的抗原（二抗系统的 正确性）
B、外部对照：明确表达待测抗原的组织或细胞（一抗的工 作性）
• 阴性对照：明确不表达待测抗原的组织或细胞 • 二抗对照：不加一抗，余操作相同
4%多聚甲醛
醛
需要修复
不需修复，冷丙酮 固定不需破膜
细胞涂片
甲醇、乙醇 不需修复
如果待测蛋白位于细胞浆或者细胞核内，同时还需要进行破膜处理
3、抗原修复
➢加热修复技术
修复方法：微波加热修复、高压热修复、煮沸热修复：
常用buffer：柠檬酸Buffer:0.01M, pH6.0
EDTA buffer: pH9.0