免疫组化原理

免疫组织化学的概念：

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

抗体的保存：

抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。

多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）

Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml

Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃

Thimerosal, 0.01%, added as preservative

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

[使用说明]

免疫学

操作步骤（可直接在玻片上涂布）

1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

2．用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃

3．将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。

4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

[注意]

1．每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。

2．用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

4．释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

5．用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

[订货信息]

￥100 / 10ml

免疫组化操作规程

（一）、仪器设备

1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；

2）水浴锅

（二）、试剂

1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7）封裱剂：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS(或PBS)配制。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程

1、脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

2）无水乙醇中浸泡5分钟；

3）95%乙醇中浸泡5分钟；

4）70%乙醇中浸泡5分钟；

2、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复

（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水