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待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆 盖细胞，固定2－4小时。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
免疫组织化学方法
荧光标记免疫组织化学 酶联免疫组织化学
荧光标记免疫组织化学
直接法
酶联免疫组织化学
• ABC法 • S - P法
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2020/12/15
可编辑
17
免疫组化二步法
固定时间：
固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温 度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
组织石蜡包埋
大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～
120min，95％醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇 Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30 ～60min，无水乙醇Ⅱ30～ 60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min 石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。
（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。
（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便
于辨认。
固定液的选择：
细胞爬片制作
将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养 瓶或六孔板内。
待细胞生长达到60％以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。
细胞涂片制作
离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2 －3遍，最后用PBS将细胞重悬。
吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴 至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。
切片：
石蜡切片：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年
冰冻切片：
(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理
24h，冰冻Βιβλιοθήκη Baidu片。
(2)冰冻切片后需凉干后立即固定
(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用
PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟 PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟 流水冲洗 苏木素复染，脱水，透明，封片。 显微镜观察拍照 IPP软件分析光密度
抗原修复方法
真空负压抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压 干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。 ⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按 选好的免疫组化染色方法进行染色。
二步法免疫组化染色步骤
二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯 PBS冲洗3次，每次3分钟 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧
化物酶的活性 PBS冲洗、浸泡5分钟，3次 正常山羊血清室温封闭10分钟
甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或 4℃过夜
组织与细胞材料的制备 免疫组织化学方法
组织与细胞材料的制备
组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的 死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95
％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min （肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡 Ⅲ1～2h。
切
片
载玻片的清洁：
市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉 干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
基本原理
通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗 体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质， 形成抗原 — 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标 记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反 应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原， 以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。
切片粘合剂的使用：
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）
干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂 （1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝 箔包好，室温或4℃保存备用。
（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
(1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中 性缓冲福尔马林
(2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂
较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂
微波辐射抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内 微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分 钟左右。 ⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好 的免疫组织化学的染色方法进行染色。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
免疫组织化学方法
荧光标记免疫组织化学 酶联免疫组织化学
荧光标记免疫组织化学
直接法
酶联免疫组织化学
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免疫组化二步法
固定时间：
固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温 度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
组织石蜡包埋
大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～
120min，95％醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇 Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30 ～60min，无水乙醇Ⅱ30～ 60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min 石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。
（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。
（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便
于辨认。
固定液的选择：
细胞爬片制作
将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养 瓶或六孔板内。
待细胞生长达到60％以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。
细胞涂片制作
离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2 －3遍，最后用PBS将细胞重悬。
吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴 至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。
切片：
石蜡切片：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年
冰冻切片：
(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理
24h，冰冻Βιβλιοθήκη Baidu片。
(2)冰冻切片后需凉干后立即固定
(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用
PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟 PBS冲洗，浸泡5分钟，3次 新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟 流水冲洗 苏木素复染，脱水，透明，封片。 显微镜观察拍照 IPP软件分析光密度
抗原修复方法
真空负压抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压 干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。 ⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按 选好的免疫组化染色方法进行染色。
二步法免疫组化染色步骤
二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯 PBS冲洗3次，每次3分钟 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧
化物酶的活性 PBS冲洗、浸泡5分钟，3次 正常山羊血清室温封闭10分钟
甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或 4℃过夜
组织与细胞材料的制备 免疫组织化学方法
组织与细胞材料的制备
组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的 死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95
％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min （肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡 Ⅲ1～2h。
切
片
载玻片的清洁：
市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉 干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
基本原理
通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗 体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质， 形成抗原 — 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标 记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反 应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原， 以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。
切片粘合剂的使用：
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）
干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂 （1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝 箔包好，室温或4℃保存备用。
（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
(1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中 性缓冲福尔马林
(2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂
较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂
微波辐射抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内 微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分 钟左右。 ⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好 的免疫组织化学的染色方法进行染色。