免疫组织化学技术
组织化学技术5免疫组化
Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
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应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
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包埋后染色：
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组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
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成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
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于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
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故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
2
液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
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新配）
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自来水洗净。
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用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
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核（可不染）。
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常规脱水、透明、封固、镜检。
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结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
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（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学技术(immunohistochemistry)
免疫组织化学技术（immunohistochemistry）由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。
此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。
目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。
一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围（一） 免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫学检验技术—免疫组织化学检验技术
（四）标本片的保存 固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需保存，
置-20℃下低温干燥保存。
二、荧光抗体标记及染色
• 荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与 特异性抗体通过共价键的方式结合而成。其制备过程通常 包括抗体的标记、纯化和鉴定三步。
• 在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置于 带盖的湿盒内，37℃温育30min。检测不耐热抗原以4℃ 过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜检。
（三）方法评价 该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是
标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体性。 尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
四、临床应用
• 酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它 抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性 物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗 原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志 等均可检测。
二、SPA法
• SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴 等的IgG Fc结合的能力，这种结合不会影响抗体的 活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可 一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过 氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。
• 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆) 型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块 型等）主要是定位指标
• 哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也 应视为阳性表达
（三）阴性结果
阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方 法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致 阴性反应。
• 即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶 桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将 抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶 （P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗 酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫组化技术
Mart-1 抗原修复前
抗原修复后
抗原修复
加热法的注意事项 ：
✓达到规定的温度(92～95 C以上) ✓维持一定的时间； ✓避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)； ✓加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使 未折叠的蛋白分子链恢复天然构型； ✓修复液：最常用的是pH6.0的0.01mol抗原修复液的容器 中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
抗原修复
微波照射法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器 中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟， 冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
➢ 免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
抗体
✓ 抗体的结构：
每个抗体都含有两个较小的 蛋白质 （轻链）和两个较大的 蛋白质（重链）。组成 抗体 的这四个蛋白质通过二硫键 （ S-S ）结合在一起。
➢ Fab（fragment antigen binding）： 该端是抗体与抗原特异性结合的部位
➢ Fc（fragment crystalline）：
常用固定剂
丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组 织标本。
组织学切片制作
冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片 方法。
《免疫组织化学技术》PPT课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组织化学技术
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（ 1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔 包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞 ，固定2－4小时。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
荧光标记免疫组织化学
直接法
间接法
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内 可保存半年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶
的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态
光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
第七章免疫组织化学技术【实用资料】
（immunofluorescence cytochemistry）
免疫组化
原位杂交技术
膀胱癌和癌旁组织上用ADAM12 T3 反义探针检测到阳性杂交信号(C,D)， 而正义探针在癌旁的正常组织中只见 到很弱或阴性信号(E,F)。D和F分别是 C和D的黑视野图像。
定量免疫 组化技术
免疫组织化学技术基本流程
（protein A immunocytochemistry） （7）生物素-亲合素系统介导的免疫组织化学方法
（biotin-avidin system cytochemistry）
3．按应用方式不同分类
（1）免疫电镜组化技术 （immunoelectromicroscopy cytochemistry）
固定剂选择
• 血涂片：丙酮，福尔马林（胞质蛋白，BCR） • 细胞涂片：95%乙醇、carbowax. • 冰冻切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛 • 石蜡切片：福尔马林（需抗原修复）、氯化汞（胞浆蛋白）
PLP/PLDP（糖类、脂类）、乙醇、丙酮
固定方法
• 浸泡法 • 蒸汽法 • 注射、灌注法 • 微波固定
• 注意事项： • 自然冷却、避免蒸干、条件统一，结构改
变，适当加入螯合剂
免疫组织化学技术基本流程
一、样品的制备 二、抗原抗体反应 三、化学呈色反应 四、免疫组织化学结果及其分析
染色策略
ABC PROCEDURE UTILIZING CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION (CSA)
组织细胞的固定
（Fixation）
➢ 要求：
➢ 完整性、天然性、抗原性、便于后期操作
➢ 策略：
➢ 快速脱水、阻断酶活、保持抗原性
10免疫组织化学检测技术
四、几种常用的免疫组化检测技术
荧光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能 发出较激发光波长更长的可见光并随照射停 止而消失。 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外 光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检 标本内的荧光物质发出发射光。
四、几种常用的免疫组化检测技术
海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色
⑵非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现 的阳性染色成为非特异性染色。防止非 特异性染色的有效方法是采用与第二抗 体相同的动物源血清（非免疫血清）吸 附封闭底物树脂上的带电荷物质，然后 再进行抗原抗体结合反应，必要时也可 采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少 非特异性染色。
三、免疫组化的全过程
③酶消化处理 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固 定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定 簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性， 因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消 化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、 蛋白酶K等。
三、免疫组化的全过程
2、抗体处理与保存 • 抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用 的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗 体。 • 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应 鲜明，背景应浅或不着色。 • 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感 抗体稀释度应越高。（效价指某一物质引起 生物反应的功效单位 ）
• • • • • • • • • • •
免疫组化在临床病理诊断中的应用 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度; 协助肿瘤良恶性的诊断; 鉴别低分化癌和肉瘤; 鉴别转移癌的性质; 协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶; 鉴别小细胞恶性肿瘤; 癌组织耐药基因的检测; 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据; 确定肿瘤组织的增殖活性; 评估癌症患者的预后; 检测病原体。
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
免疫组织化学技术
复
染
根据所用的底物溶液而选择复染液
DAB 有色终末产物不溶于酒精和有机溶剂， 可用醇性染料复染、脱水，有机溶剂透明和封 固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的 底物；b、Harris苏木素复染；c、流水洗涤； d、1%盐酸酒精分化；e、流水冲洗，温水蓝 化；f、梯度酒精脱水；g、二甲苯透明；h、 中性树胶封固。
显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。
新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他 实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时 间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是 低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定 和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。 低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。
10%中性缓冲福尔马林液
40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml
影响固定的因素
固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定 和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原 变性，因而要选择一合适的固定时间。
固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升 高而加强，固定的温度以室温最为常用。
冰冻切片 石蜡切片
免疫组织化学染色
内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红 蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单 核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物 酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟
内源性碱性磷酸酶
内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内
热诱导的抗原修复应注意的问题：
热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破 坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡 染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化 时间而异，但核的破坏较轻。
【检验医学】免疫组织化学技术
各种抗原的固定
抗原 蛋白质 微生物 病毒外壳 多糖 黏液物质 类脂质
固定剂或处理方法 乙醇、甲醇 丙酮、三氯化碳 胰蛋白酶 10%甲醛或微火加热 透明质酸酶 乙醚、丙酮
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。
四、结 果 判 断
➢ 对照实验： 阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈 阴性结果时更为重要） 阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）
➢ 确证实验： 空白实验：PBS（排除内源性酶） 替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗 原引起的非特异性反应） 吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的 标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原 抗体反应。）
第十二章 免疫组织化学技术
概念
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测 定的一项免疫检测方法。
第一节 免疫组织化学技术概述
根据标记物的不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术
第一节 免疫组织化学技术概述
免疫组织化学的基本过程包括：
1.抗原的提取与纯化； 2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及
抗体的纯化； 3.将标记物与抗体结合形成标记抗体； 4.标本的处理与制备； 5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应； 6.观察结果。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
病理学中的免疫组织化学技术
病理学中的免疫组织化学技术免疫组织化学技术是病理学中常用的一种技术，它利用特异性抗体来检测并鉴定组织中的特定细胞或分子。
这种技术在肿瘤学、免疫学、神经科学等领域得到广泛应用，并且对于疾病的早期诊断、治疗有着重要的作用。
免疫组织化学技术是在组织学的基础上发展起来的一种技术，它利用特异性抗体识别组织中的不同成分，并将它们染色或标记。
目前常使用的免疫组织化学技术主要有免疫荧光、免疫酶标记、免疫金标记等。
免疫荧光是一种利用荧光染料标记抗体或标记物并将其显色的技术。
它可以快速、准确地鉴定出组织中的不同分子或细胞，并可以通过多重荧光染色技术同时检测出多种分子，从而实现复杂的研究目的。
免疫荧光技术在病理学中的应用十分广泛，包括免疫球蛋白的分布、肿瘤细胞的识别和定位、免疫细胞的分布和功能等。
免疫酶标记是一种将酶标记物（如过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记在抗体或其他分子上，然后通过酶促反应将其染色或显色的技术。
这种技术可以用于特定细胞或分子的定量分析，可以通过数字化显微镜来定量计算染色强度等参数。
在肿瘤学中，免疫酶标记技术常被用来鉴定肿瘤细胞的种类和分化程度，以及进行肿瘤的分子分型。
免疫金标记技术是一种将金标记物标记在抗体或标记物上，然后通过放大或显色等方式来进行检测的分析技术。
这种技术的优点在于其对细胞结构和分子的高分辨率显微镜观察，同时可通过计算机数字化技术实现图像分析和处理。
在神经科学领域中，免疫金标记技术常被用于观察神经元的形态和分布，以及神经递质的定位和释放。
总之，免疫组织化学技术在病理学中得到了广泛应用。
这种技术的出现和发展，为疾病的诊断、治疗和研究提供了有力的工具，同时也为未来疾病防治的研究和治疗提供了新的思路和可能性。
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What’s the Neuroscience?
•
不同学科（解剖、生理、病理、 药理、生物、生化、信息、临 床）；
•
不同水平(分子、细胞、组织、 器官、整体、行为、认知）；
不同侧面（结构、功能、发育、 病理、工程）； 不同技术平台
Tyrosine HydroxlyaseRat
Immunocytochemis try for TH
Immunohistochemistry Staining
Aß -1-40 (pan) Mouse Cortex PS-1/APP Transgenic
Aß -1-42 Mouse Cortex PS-1/APP Transgenic
免疫酶组织化学方法模式图
直接法
间接法
PAP法
ABC法
三、设立对照 (Tissue Control)
目的是证明阳性反应的确是由于抗原抗体反 应所致，任何一个未知标本染色时都必须同时进 行阳性对照和阴性对照。
1. 阳性对照 (Negative tissue controls)
2. 阴性对照 (Positive tissue controls) 3. 空白对照 (Internal tissue controls) （不加一抗）
提取和纯化：
神经生物学中的抗原：酶，神经肽，膜性结构成分，神
经递质，类固醇
2. Antibody
• 免疫球蛋白（Ig） • 免疫组化中多用IgG • 免疫球蛋白的结构：与抗原有结合能力的为Fab段
3. 多克隆抗体和单克隆抗体
Polyclonal antibody: Polyclonal antibodies are produced by different cells, and in consequence, are immunochemically dissimilar; they react with various epitopes on the antigen against which they are raised.
• 历史与发展：1950年, Coons
免疫组化实验程序
• 抗原提取 • 抗体制备 • 抗体标记 • 染色反应
• • 免疫组织化学与免疫细胞化学 亲和组织化学
• 呈色观察
• 结果评价
第一节 免疫组织化学原理
一、抗原和抗体
1. Antigen：
种类：完全抗原和半抗原 性质：具有免疫原性和免疫反应性；其特异性由表面的 抗原决定簇（antigenic determinant）决定
五、染色结果评价
• 从抗原在局部的表达方式判断染色结果 是否特异 • 积极评价阳性染色结果的意义
• 人为假象的识别
第三节 免疫组化技术在神经科学 研究中的应用
• 区分神经细胞和神经胶质细胞及其结构成分
1.神经细胞的特殊化学性质：
NSE (Neuron specific enolase) 神经元特异性烯醇化酶
第二节 免疫组织化学染色方法
一、免疫荧光技术（Immunofluorescence method）
1. 原理：荧光标记抗体 2. 方法： • 直接法：荧光素标记特异性抗体
• 间接法：荧光素标记Ⅱ抗
• 补体法：荧光素标记抗补体抗体
免疫荧光组织化学模式图
荧光显微镜及其使用：
1）荧光显微镜主要结构；
Monoclonal antibody: Monoclonal antibodies are the product of an individual clone of plasma cells. Antibodies from a given clone are immunochemically identical and react with a specific epitope on the antigen against which they are raised.
• 抗原在细胞的合成、转运及代谢途径
基本原理与方法
• •
避免两种染色系统的交叉反应
方法： 1. 洗脱法：在第一种免疫反应后，用酸性溶液洗脱切片
上所形成的抗原抗体复合物。
1）保留第一种显色反应生成物，可在同一组织片上 标记两种抗原。 2）洗脱第一种反应的全部抗原抗体复合物，在空白 片上重新进行第二种染色，分别摄片纪录。
• 免疫动物
• 细胞融合
• 选择培养 • 克隆化
• 效价检测
• 扩大培养
抗体标记（Antibody labeled)
若要显示组织中的抗原抗体免疫反应，由于抗原抗体反 应形成的免疫复合物不能被肉眼和显微镜所观察到，因 此，若欲检测组织中的抗原，就需将抗体或免疫复合物 用可以分辨的物质加以标记。
• 荧光素标记 • 酶标记抗体 • 胶体金标记 • 铁蛋白标记
Histochemistry for Neural tissue
Nissl staining
Golgi staining
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1906
"in recognition of their work on the structure of the nervous system"
NF (Neurofilament)神经原纤维
2. 神经胶质细胞性质： GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein)
胶质原纤维酸性蛋白
S100, O1-O4
神经系统细胞类型的免疫学标志
Marker GFAP C1抗原 M1抗原 胼胝体抗原 S-100 髓磷脂碱性蛋白 NS-1抗原 半乳糖脑苷脂 O1-O4抗原 NS-4抗原 NSE NF 破伤风毒素受体抗原 星形胶质细胞 Astrocyte + + + + + 少突胶质细胞 Oligodendrocyte 神经细胞 Neuron
Camillo Golgi 1/2 of the prize Italy
Santiago Cajal 1/2 of the prize Spain
The dilemma of histochemistry
Immunohistochemistry
Introduction
• 目的：利用免疫学及化学反应所呈现的颜色变化， 在原位确定组织细胞结构的化学成分或化学性质， 是组织化学的一种。 • 本质：用标记的抗体追踪抗原，以确定组织和细胞 中的某种化学物质。
抗体制备
Polyclonal antibody制备
• 动物：家兔、山羊 • 佐剂：Freund • 免疫方法：皮下、静脉或肌肉注射
第一抗体：具有特异性
第二抗体：不具有特异性
• 效价检测：放射免疫分析、琼脂双向扩散法 • 免疫球蛋白的提纯：柱层析，亲和层析
Monoclonal antibody制备
•
•பைடு நூலகம்
20世纪神经科学的飞速发展
——诺贝尔奖获得者的主要战场
当代神经科学已经达到全方位认识脑水平
Molecular Neuroscience Cellular Neuroscience Systems Neuroscience Behavioral Neuroscience Cognitive Neuroscience
四、非特异性染色及处理
• 凡是不属于上述免疫特异性反应的染色通 常称为非特异性染色或背景染色。 1. 原因：
• 富含电荷的胶原和结缔组织吸附抗体
• 内源性过氧化物酶 • 抗体浓度过高 • 不适当的孵育温度和时间
2. 消除方法：
• • • • • • • 蛋白封闭抗原：加Ⅰ抗之前，正常动物血清 内源性过氧化物酶阻断： 0.3%H2O2-甲醇30min 盐酸修复抗原 增加Ⅰ抗稀释度 调整孵育时间及反应温度 消除醛类固定液所致的非特异性染色： 0.01%硼氢化钠 避免标本干枯
GFAP- Rat Hippocampus Trimethyl Tin Intoxication
Reactive Microglia Stain
Resident microglia of the brain become reactive following various forms of insult, including physical (d) and chemical trauma and viral infection(a-c). Our silverbased protocol stains reactive microglia but not resting microglia. Microglial features visible with our silver are the same as with lectin staining (IsoB4) and antibody staining (ED-1 in rat).
COX-2 Rat Hippocampus
c-fos Rat Piriform Cortex
第四节
其他免疫组化技术
双重或多重免疫标记技术
•
应用免疫组织化学方法，在同一张组织切片上同时进行
或先后显示两种或两种以上的抗原成分
•
作用： • 可以了解不同细胞、组织之间与相关抗原的相互关系
• 同一种细胞内抗原之间的相互关系
The gain in brain is mainly in the stain!
Histochemistry
•
法国植物学家Raspail（1826）将化学技术与显微镜结合 起来：植物花朵受精过程中的碘淀粉反应。 Takamatsu和Gomori （1939）同时发表证明了碱性磷酸 酶的组织化学方法，使组织化学技术进入现代水平。 Scheldon, Brandes等（1955）将电镜与酶组织化学技术相 结合。