免疫组织化学技术

Section of Brain stained by immunoperoxidase for GFAP (Glial fibrillary acidic protein).
GFAP- Mouse Amygdala Idiopathic Astrocyte Reactivity
GFAP is the major component of the filaments found in fibrillary and protoplasmic astrocytes - the protein is visualised as a brown deposit
• 光源：高压汞灯；高压氙灯；卤素白炽灯
• 滤片：激发滤片；阻断滤片 2）荧光摄影： 3）共焦激光扫描荧光显微镜：
二、免疫酶标技术 （Enzyme labeled IHC method）
用酶蛋白（常用HRP）标记抗体，通过免疫反应后追加标记 物酶催化底物（H2O2）及供电子体（DAB二氨基联苯胺）的组 织化学反应，得到具有一定电子密度的有色产物。据反应形式 的不同分为以下四种： 1. 直接法 2. 间接法 3. 过氧化酶抗过氧化酶法（PAP法） 4. 卵白素生物素法（ABC法）
• 抗原在细胞的合成、转运及代谢途径
基本原理与方法
• •
避免两种染色系统的交叉反应
方法： 1. 洗脱法：在第一种免疫反应后，用酸性溶液洗脱切片
上所形成的抗原抗体复合物。
1）保留第一种显色反应生成物，可在同一组织片上 标记两种抗原。 2）洗脱第一种反应的全部抗原抗体复合物，在空白 片上重新进行第二种染色，分别摄片纪录。
Histochemistry for Neural tissue
Nissl staining
Golgi staining
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1906
"in recognition of their work on the structure of the nervous system"
Tyrosine HydroxlyaseRat
Immunocytochemis try for TH
Immunohistochemistry Staining
Aß -1-40 (pan) Mouse Cortex PS-1/APP Transgenic
Aß -1-42 Mouse Cortex PS-1/APP Transgenic
抗体制备
Polyclonal antibody制备
• 动物：家兔、山羊 • 佐剂：Freund • 免疫方法：皮下、静脉或肌肉注射
第一抗体：具有特异性
第二抗体：不具有特异性
• 效价检测：放射免疫分析、琼脂双向扩散法 • 免疫球蛋白的提纯：柱层析，亲和层析
Monoclonal antibody制备
•
•
Neurohistology of Different Species
cat Neonaterat mouse
dog rat gerbil
monkey
rabbit guineapig
This is an example of the ThionineNissl Stain on a 40 micron Rhesus Monkey section.
Immunohistochemistry Techniques for Neuroscience
What’s the Neuroscience?
•
不同学科（解剖、生理、病理、 药理、生物、生化、信息、临 床）；
•
不同水平(分子、细胞、组织、 器官、整体、行为、认知）；
不同侧面（结构、功能、发育、 病理、工程）； 不同技术平台
Monoclonal antibody: Monoclonal antibodies are the product of an individual clone of plasma cells. Antibodies from a given clone are immunochemically identical and react with a specific epitope on the antigen against which they are raised.
+ + + + + + + + + +
IHC in Neuroscience
• • • • • • • 确定神经元的性质定位和分布 探索和发现新的神经递质 追踪神经纤维的投射区及其径路 在超微结构水平研究神经元的构造及突触联系的化学本 质 神经递质共存 个体发育和种系发生的研究 神经系统的机能和临床研究
五、染色结果评价
• 从抗原在局部的表达方式判断染色结果 是否特异 • 积极评价阳性染色结果的意义
• 人为假象的识别
第三节 免疫组化技术在神经科学 研究中的应用
• 区分神经细胞和神经胶质细胞及其结构成分
1.神经细胞的特殊化学性质：
NSE (Neuron specific enolase) 神经元特异性烯醇化酶
第二节 免疫组织化学染色方法
一、免疫荧光技术（Immunofluorescence method）
1. 原理：荧光标记抗体 2. 方法： • 直接法：荧光素标记特异性抗体
• 间接法：荧光素标记Ⅱ抗
• 补体法：荧光素标记抗补体抗体
免疫荧光组织化学模式图
荧光显微镜及其使用：
1）荧光显微镜主要结构；
免疫酶组织化学方法模式图
直接法
间接法
PAP法
ABC法
三、设立对照 (Tissue Control)
目的是证明阳性反应的确是由于抗原抗体反 应所致，任何一个未知标本染色时都必须同时进 行阳性对照和阴性对照。
1. 阳性对照 (Negative tissue controls)
2. 阴性对照 (Positive tissue controls) 3. 空白对照 (Internal tissue controls) （不加一抗）
NF (Neurofilament)神经原纤维
2. 神经胶质细胞性质： GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein)
胶质原纤维酸性蛋白
S100, O1-O4
神经系统细胞类型的免疫学标志
Marker GFAP C1抗原 M1抗原 胼胝体抗原 S-100 髓磷脂碱性蛋白 NS-1抗原 半乳糖脑苷脂 O1-O4抗原 NS-4抗原 NSE NF 破伤风毒素受体抗原 星形胶质细胞 Astrocyte + + + + + 少突胶质细胞 Oligodendrocyte 神经细胞 Neuron
•
•
20世纪神经科学的飞速发展
——诺贝尔奖获得者的主要战场
当代神经科学已经达到全方位认识脑水平
Molecular Neuroscience Cellular Neuroscience Systems Neuroscience Behavioral Neuroscience Cognitive Neuroscience
• 免疫动物
• 细胞融合
• 选择培养 • 克隆化
• 效价检测
• 扩大培养
抗体标记（Antibody labeled)
若要显示组织中的抗原抗体免疫反应，由于抗原抗体反 应形成的免疫复合物不能被肉眼和显微镜所观察到，因 此，若欲检测组织中的抗原，就需将抗体或免疫复合物 用可以分辨的物质加以标记。
• 荧光素标记 • 酶标记抗体 • 胶体金标记 • 铁蛋白标记
GFAP- Rat Hippocampus Trimethyl Tin Intoxication
Reactive Microglia Stain
Resident microglia of the brain become reactive following various forms of insult, including physical (d) and chemical trauma and viral infection(a-c). Our silverbased protocol stains reactive microglia but not resting microglia. Microglial features visible with our silver are the same as with lectin staining (IsoB4) and antibody staining (ED-1 in rat).
COX-2 Rat Hippocampus
c-fos Rat Piriform Cortex
第四节
其他免疫组化技术
双重或多重免疫标记技术
•
应用免疫组织化学方法，在同一张组织切片上同时进行
或先后显示两种或两种以上的抗原成分
•
作用： • 可以了解不同细胞、组织之间与相关抗原的相互关系
• 同一种细胞内抗原之间的相互关系


提取和纯化：

神经生物学中的抗原：酶，神经肽，膜性结构成分，神
经递质，类固醇
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2. Antibody
• 免疫球蛋白（Ig） • 免疫组化中多用IgG • 免疫球蛋白的结构：与抗原有结合能力的为Fab段
3. 多克隆抗体和单克隆抗体
Polyclonal antibody: Polyclonal antibodies are produced by different cells, and in consequence, are immunochemically dissimilar; they react with various epitopes on the antigen against which they are raised.
This is an example of the Weil-Myelin Stain on a 40 micron Rhesus Monkey section.
Silver Degeneration Stains
Degenerated neurons in substantia nigra in MPTP treated BALB/C57 mouse. Cupric Silver Stain
The gain in brain is mainly in the stain!
Histochemistry
•
法国植物学家Raspail（1826）将化学技术与显微镜结合 起来：植物花朵受精过程中的碘淀粉反应。 Takamatsu和Gomori （1939）同时发表证明了碱性磷酸 酶的组织化学方法，使组织化学技术进入现代水平。 Scheldon, Brandes等（1955）将电镜与酶组织化学技术相 结合。
四、非特异性染色及处理
• 凡是不属于上述免疫特异性反应的染色通 常称为非特异性染色或背景染色。 1. 原因：
• 富含电荷的胶原和结缔组织吸附抗体
• 内源性过氧化物酶 • 抗体浓度过高 • 不适当的孵育温度和时间
2. 消除方法：
• • • • • • • 蛋白封闭抗原：加Ⅰ抗之前，正常动物血清 内源性过氧化物酶阻断： 0.3%H2O2-甲醇30min 盐酸修复抗原 增加Ⅰ抗稀释度 调整孵育时间及反应温度 消除醛类固定液所致的非特异性染色： 0.01%硼氢化钠 避免标本干枯
Camillo Golgi 1/2 of the prize Italy
Santiago Cajal 1/2 of the prize Spain
The dilemma of histochemistry
Immunohistochemistry
Introduction
• 目的：利用免疫学及化学反应所呈现的颜色变化， 在原位确定组织细胞结构的化学成分或化学性质， 是组织化学的一种。 • 本质：用标记的抗体追踪抗原，以确定组织和细胞 中的某种化学物质。
• 历史与发展：1950年, Coons
免疫组化实验程序
• 抗原提取 • 抗体制备 • 抗体标记 • 染色反应
• • 免疫组织化学与免疫细胞化学 亲和组织化学
• 呈色观察
• 结果评价
第一节 免疫组织化学原理
一、抗原和抗体
1. Antigen：

种类：完全抗原和半抗原 性质：具有免疫原性和免疫反应性；其特异性由表面的 抗原决定簇（antigenic determinant）决定