现代组织化学技术问答题详解(同济)

1.组织化学的基本原理及其与生物化学的基本区别

组织化学是在保持组织或细胞基本上不改变其生活状态时的细微结构的条件下，采用显微镜技术观察某些化学成分和酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律，以便阐明它们在组织或细胞中的存在和含量及其变化的机能意义。

基本原理:在组织切片或细胞涂片上加入一定的化学试剂，该试剂与组织或细胞内的拟检成分起化学反应，形成有颜色的的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，可在显微镜下观察得到，用以研究糖类、脂类、蛋白质、酶类和核酸等物质在组织或细胞内的分布和含量。

组织化学与生物化学的区别在于：虽然两者都着眼于组织和细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，但生物化学技术中通常是将组织和细胞打碎，制成匀浆，然后进行化学测定，故其定位性能差，而组织化学技术中是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分，故其定位性能好；生物学技术中的化学反应是在试管内进行的，而组织化学技术中的化学反应通常是在组织切片或细胞涂片中进行的。

2.试述组织化学技术的基本要求

在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及其定位和定量以及代谢状态时，必须满足一下基本要求：

1.保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确，如果形态结构破坏而失真，则定位困难。

2.具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。

3.具备一定的灵敏性，以便含量很少的物质也能被显示出来。

4.生成的产物必须是有色沉淀，颗粒细微不被溶解，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相反应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。

5.反应产物具有稳定性，以便于重复观察。

6.要有重复性。

(一) 保持组织和细胞形态结构的良好状态

(二) 具备一定的特异性

(三) 具备一定的灵敏性

(四) 生成的反应产物必须是有色沉淀

(五) 反应产物具有稳定性

(六) 要有重复性。

3.试述酸性磷酸酶，乙酰胆碱酯酶和NO合酶的反应原理？以任意三种酶为例说明酶显示的基本原理？NO 合酶的分类及其组化原理?

酸性磷酸酶反应原理：铅法和重氮偶联法

1.铅法：在PH为5.0的条件下，酸性磷酸酶（ACP）水解其底物：β-甘油酸钠，产生PO43-,后者被捕获剂Pb(NO3)2的Pb2+直接捕获形成无色的Pb3 (PO4)2沉淀，后者又与(NH4)2S发生置换反应，最终形成棕黑色沉淀。

2.重氮偶联法：α-苯酚磷酸钠或萘酚AS-BI磷酸被酶水解放出萘酚，后者立即被重氮盐捕获偶联而生成有色偶氮色素沉淀（红色）。

乙酰胆碱酯酶反应原理：

亚铁氰化铜法：乙酰胆碱酯酶（AChE）能将乙酰胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜而呈现有色沉淀(棕色)。

NO合酶反应原理：

NADPH-d法：一氧化氮合酶可催化前体物质L-精氨酸转变成为L-瓜氨酸和NO，由于NOS和NADPH-d可能为同一种酶，并且都可以还原辅酶Ⅱ（NADPH）为辅助因子，介导NOS催化L-精氨酸转变成为L-瓜氨酸和NO，并释放电子，后者又被NADPH传递给硝基四唑兰（N-BT）, N-BT可被还原为有色沉淀（蓝色）。

4.原位杂交间接法的基本原理，并简述杂交后处理的原理？

原位杂交间接法的基本原理：一般使用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学反应对半抗原定位，间接地显示探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体。

杂交后处理的目的：除去未参加杂交体形成的过剩探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，包括那些与靶核酸相似的序列与探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体从而减低背景。

杂交后处理：系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗

洗涤的条件：盐浓度、温度、洗涤次数和时间。盐浓度由高到低而温度由低到高。

洗涤过程中至少有一次高严格度条件(低盐、高温、高甲酰胺)下的漂洗

注意防止切片干燥：因干燥的切片即使使用大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合。

当用RNA探针时，杂交后可用RNA酶处理(所用的试剂不能含有对RNA酶有抑制作用的物质,如还原剂DTT和甲酰胺等)

放射性同位素标记探针的杂交后漂洗要比非放射性标记探针的更充分些

5.杂交严格度的含义及主要影响因素和作用？

杂交严格度(hybridization stringency)

通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度，即决定探针是否能与含不互补碱基的核酸序列结合而形成杂交体的条件。

影响严格度的因素：甲酰胺的浓度、杂交温度、离子强度

高严格度：碱基对完全互补。特异性强，敏感性低（高甲酰胺浓度、低离子强度和高杂交温度）

低严格度：碱基并不完全配对。特异性差，而敏感性高（低甲酰胺浓度、高离子强度和低杂交温度）

6.试述用半抗原标记的探针原位杂交组织化学的原理及注意事项

原位杂交基本原理：在低于核酸变性温度（Tm值）20-30。C时，根据碱基互补配对原则，在适宜条件下用带有半抗原标记物的已知序列的核酸探针与组织切片上具有相应序列的单链核酸（靶核酸）发生杂交反应，形成双链结构，即杂交体。然后通过相应的显示方法将这些杂交体显示出来而对相应的靶核酸进行定位，并可利用显微分光光度计或图像分析仪等进行半定量研究。

注意事项：

1.以半抗原标记的探针的原位杂交信号可通过免疫细胞化学或亲和组织化学技术进行间接显示。

2.用生物素标记的探针进行原位杂交，带有标记探针的杂交体可以根据亲和素-生物素亲和组织化学原理，或生物素-抗生物素抗体的免疫细胞化学原理进行显示。

3.以地高辛标记的探针在进行原位杂交反应后，可根据免疫细胞化学原理，用结和有酶（如HRP或AKP）或荧光素的羊地高辛抗体与标记在探针上的地高辛进行免疫反应，再用相应底物显示酶促反应或以荧光显微镜产生荧光间接显示杂交体。

与放射性标记探针相比，生物素、地高辛等探针具有对人体无害、不受半衰期限制、可长期保存等优点。与生物素探针相比，地高辛标记探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性与分辨率高，背景染色低，故标记广泛。

7.试述影响杂交体熔解温度（Tm值）的主要因素及根据？

影响杂交体熔解温度的因素主要包括以下几个方面：

1.杂交双链的碱基组成：杂交双链解离成单链时主要涉及配对碱基间氢键的断裂。G-C之间有三个氢键，A-T之间或A-U之间有两个氢键，故（G+C）含量越高的杂交双链的Tm值越高。

2.杂交双链的长度：杂交双链越长，结合的位点越多，Tm值越高。

3.杂交双链的碱基错配程度：错配的碱基越多，及错配的程度越高，Tm值越低。