斑马鱼TNFR2基因克隆及表达分析

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斑马鱼3种胰蛋白酶原基因的克隆、序列分析及组织表达

摘要：胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶类超家族成员之一，在动物蛋白消化中起着重要作用。为深入研究胰蛋白酶在鱼类中的蛋白结构和生理功能，利用ＲＴ．ＰＣＲ和ＲＡＣＥ方法，成功获得了斑马鱼３种胰蛋白酶原ｃＤＮＡ序列（ｚｌｆｒｙｌａ、ｚｆｔｒｙｌｂ和ｚｌｆｒｙ２）。结果表明，ｚｆｔｒｙｌａ和ｚｌｆｒｙｌｂ均有２４２个氨基酸残基组成，其中包括１５个氨基酸的信号肽和５个氨基酸（ＬＤＤＤＫ）的激活肽。ｚｌｆｒｙ２由２４７个氨基酸残基组成，其中包括１５个氨基酸的信号肽和９个氨基酸（ＡＰＬＧＤＤＤＤＫ）的激活肽。氨基酸序列比对结果显示，三者具备胰蛋白酶原的保守结构特征，如含有催化三联体氨基酸（Ｈｉｓ一５７、Ａｓｐ一１０２和Ｓｅｒ－１９５），１２个半胱氨酸，位于底物结合口袋底部Ａｓｐ一１８９和口袋开口处的Ｇｌｙ一２１６、Ｇｌｙ一２２６等。进化树结果显示，斑马鱼ｚｌｆｒｙｌａ和ｚｌｆｒｙｌｂ属于ｇｒｏｕｐＩ，为阴离子胰蛋白酶原；斑马鱼ｚｆｔｒｙ２属于ｇｒｏｕｐＩＩ，为阳离子型胰蛋白酶原。ＲＴ — ＰＣＲ结果显示，三者组织分布模式类似，且在肠中有最高表达量。这些结果为研究鱼类胰蛋白酶原的基因进化和功能以及进一步探讨鱼类消化生理的分子机制奠定了基础。
ＴｈｒｅｅＦｏｒｍｓＴｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎｓｉｎＺｅｂｒａｉｓｆｈ，Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ

(细胞生物学专业优秀论文)斑马鱼新基因KLP的克隆、分析及功能研究

结果１、异种同源基因的血清学筛选及鉴定以人脐静脉内皮细胞免疫获得的抗血清为筛选血清，采用ＳＥＲＥＸ方法筛选斑马鱼心脏ｅＤＮＡ文库。

噬菌斑内的重组蛋白转移到硝酸纤维素膜上经显色反应后背景呈浅紫色，阴性噬菌斑呈较淡的噬菌斑影，阳系的噬菌斑呈紫红色：筛选过程重复２—３次以排除假阳性结果。

通过斑马鱼心脏ｅＤＮＡ文库的两轮筛选获得了２２个阳性克隆，然后通过内部剪切使噬菌体转变呈噬粒以鉴定。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，插入片断大小大部分集中于１０００ｂｐ左右。

图１左图箭头所指为ＳＥＲＥＸ阳性克隆，右图为ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ噬菌粒经ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切表２基因号人同源基因名称阳性频率功能注释ＤＬｌ６３２９Ｈｓ．３５０９６４ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｎｄＢＴＢｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ４Ｄｒ３５ｃｒ７２Ｈｓ．２２７６０２２ｒｅｇｕｌａｔｅｏｆｎｕｃｌｅｒ删＾—ｂｉｎｄｇｉｎｇｐｅｒ－姝Ｎ＾ｍｏｔｉｆｐｒｏｔｅｉｎ１６未知基因（６个克隆。

２个基因）图２阳性克隆基因的功能分类３、新基因全长的克隆获得完整的ＯＲＦ是基因功能研究的第一步。

我们选择了一个基因作为重点研究对象：斑马鱼ＫＬＰ（ＫａｉＳＯＬｉｋｅ）基因，我们采用的电子克隆策略。

直接测序得到的斑马鱼ｅｓｔ序列长６４７ｂｐ，我们采用了基于基因组序列的直接预测策略。

通过与斑马鱼基因组序列的对比，可知该基于位于１２染色体的ＮＷ－－６３３３８０（共２３２５３７ｂｐ）的４６１６１－－４７０７９ｂｐ处。

选取该序列前后各３ｋｂ序列，运用ＧＥＮＥＳＣＡＮ和ＴＷＩＮＳＣＡＮ测序其中可能包含的基因，包含已知ＥＳＴ序列的预测结果即为可能的基因，长４７２５ｂｐ，编码１５７４个氨基酸。

再与Ｄｒ．１６３２９中的ＥＳＴ序列对比，通过与Ｃ０９２３１４７的序列拼接获得一长５１７１ｂｐ的基因序列，５’端延长３９５ｂｐ，编码区不变。

起始密码子周围序列为ｃｃｈａｔｇＡ，符合ｋｏｚａｋ规则，－－５７位存在终止密码予ＴＧＡ，据此可以确定已得到该基因完整的编码区。

斑马鱼模型在疾病研究中的应用

斑马鱼模型在疾病研究中的应用斑马鱼是一种常见的热带淡水鱼类，其身体呈流线型，有五彩斑纹，被誉为水族箱的明星。

但是，你有没有想过，这个看似平凡的小鱼，却有着非凡的魅力？实际上，斑马鱼模型已被广泛应用于疾病研究中。

它的生命周期短、维护费用低、繁殖能力强，并且与人类的基因共享高达80%的相似性，这些特点使得斑马鱼成为理想的生物模型。

一、斑马鱼模型在基因研究中的应用斑马鱼作为生物模型，最重要的用途莫过于在基因研究中的应用了。

近年来，在斑马鱼模型中，已经发现了许多与人类疾病相关的基因。

首先，斑马鱼作为脊椎动物模型，在基因表达上有着非常高的相似性。

因此，通过基因编辑技术，科学家可以在斑马鱼中模拟许多人类疾病，以便更好地了解疾病的发生机制。

不仅如此，斑马鱼还能够帮助科学家发现新的疾病基因。

科学家可以通过研究斑马鱼基因变异体，探寻与人类疾病相关的基因，并通过相关技术获得具有足够强度的证据，最终随着研究的深入，成功挖掘出了许多新的疾病基因。

二、斑马鱼模型在药物研究中的应用除了基因研究，斑马鱼更是被应用于药物研究中。

在药物研发初期，科学家可以利用斑马鱼模型，在体内进行大规模的药物筛选，快速发现具有潜在药效的分子。

相比较于传统的小鼠模型，斑马鱼模型可以更快速、更便捷地从全身水平研究生物相应变化。

并且，其周期短，更加节省时间和成本。

不仅如此，相比小鼠模型，斑马鱼模型的规模更为适宜，并且各个器官和肝脏的代谢率等参数也更容易掌握。

因此，对于小分子药物、化学物质的机理研究，斑马鱼模型也具有不可替代的优势。

三、斑马鱼模型在心血管研究中的应用除了前两点，斑马鱼模型还被广泛地应用于心血管研究中。

在这个领域中，斑马鱼模型的可塑性非常高，研究人员可以通过基因编辑技术，模拟出许多不同类型的心血管疾病，例如心肌病、心脏瓣膜疾病等等。

此外，斑马鱼模型还能够帮助科学家模拟人类心血管系统中的血管生成、血流动力学等生理过程 - 通过光学方法，科学家可以实时观察斑马鱼体内血流的变化，并对其进行非常详细的研究和分析，最终为心血管疾病的研究提供了有益的参考。

斑马鱼cGnRH-Ⅱ的基因克隆与序列分析

框；编码的ｃＲＨ一 Ⅱ前体为８Ｇｎ６个氨基酸残基，一个信号肽、ＲＨ十肽和一个由蛋白水解位点（ｙＬｓ由ＧｎＧｌ— ｙ —Ａｒ）接ｇ连的促性腺激素释放激素相关肽（ＧＡＰ组成；中信号肽和联接肽的长度分别为２）其４和４９个氨基酸．ｃ该ＤＮＡ编码的ｃｎＧＲＨ
谢保胜，瑞君段
（青海大学生物科学系，海西宁青摘８０１）１０６
要：斑马鱼脑组织提取总ＲＮＡ，用Ｒ从应Ｔ—ＰＲ方法克隆ｃＲＨｃＡ，长度为６６ｂ，ＣＧｎＤＮ其４ｐ包括一个２８ｐ开放阅读５ｂ
１２方法．
１２１斑马鱼总ＲＮＡ提取．．
按照谢保胜介绍的方法做斑马鱼总ＲＮＡ提取和纯化．泳分析Ｒ电ＮＡ质量，ｐｅｄｒ公Ｅｐｎｏｆ
司产Ｂｏｈｔｍｅｅ测定其含量后，ｉｐｏｏｔｒ分装储存于超低温冰箱中．
成，酶切加工后释放出有活性的十肽［．马鱼经２斑］（ｎｏｅｉ，ｅｒｆｈ是目前生命科学研究中Ｄａｉｒｒｏｚｂａｉ）ｓ重要的模式脊椎动物之一，有繁殖能力强、具体外
育研究室提供．物由ＮＩＰＮＧＴ株式会社引Ｐ０Ｅ合成．它试剂购自ＴＫａａ式会社．其ａＲ株

斑马鱼3种胰蛋白酶原基因的克隆、序列分析及组织表达

斑马鱼3种胰蛋白酶原基因的克隆、序列分析及组织表达陈文波;李卫国;张珍;焦春磊;吴帆【摘要】Trypsin, one member of the serine protease family, plays important roles in animal protein digestion. It is synthesized and secreted as proenzyme trypsinogen, and removed the N-terminal activation peptide by enterokinase converting to active form in the intestine. The active trypsin can specifically cleavage at the peptide bond on the carboxyl side of basic L-amino acids such as arginine or lysine resi-duse. For studying the protein structure and physiological funtions of trypsinogen in fish, we successfully got three trypsinogen cDNAs (zftry1a、 zftry1b and zftry2) from zebrafish by RT-PCR and RACE. The results showed zftry1a andzftry1b consisted of 242 amino acids which contained a signal peptide (SP) of 15 amino acids and an activation peptide (AP) of five amino acids, LDDDK. Zftry2 consisted of 247 a-mino acids which contained a SP of 15 amino acids and an AP of nine amino acids, APLGDDDDK. The alignment based on the amino acid sequences revealed that they had the conversed structural characteristics, such as the catalytic triad ( His-57, Asp-102, and Ser-195), 12 cysteines forming 6 disulfide bonds, Asp-189 at the bottom of the substrate-binding pocket and Gly-216 and Gly-226 lining the sides of the binding pocket, and so on. The results from isoelectric and phylogenetic analyses suggested that zftry1a and zftry1b were group with teleost anionic trypsinogen group I, while zftry2 was phylogenetically related to teleost cationic group II. Tissue expression pattern was similar toeach other, and all trypsinogens were mainly expressed in the intestine. These results from zebrafish trypsinogens can provide thernfoundations for further study of its expression profiles, the molecular characteristics and evolution of fishrntrypsinogen.%胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶类超家族成员之一,在动物蛋白消化中起着重要作用.为深入研究胰蛋白酶在鱼类中的蛋白结构和生理功能,利用RT-PCR和RACE方法,成功获得了斑马鱼3种胰蛋白酶原cDNA序列(zftry1a、zftry1b和zftry2).结果表明,zftry1a和zftry1b均有242个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸(LDDDK)的激活肽.zftry2由247个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和9个氨基酸(APLGDDDDK)的激活肽.氨基酸序列比对结果显示,三者具备胰蛋白酶原的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸(His-57、Asp-102和Ser-195),12个半胱氨酸,位于底物结合口袋底部Asp-189和口袋开口处的Gly-216、Gly-226等.进化树结果显示,斑马鱼zftry1a和zftry1b属于group Ⅰ,为阴离子胰蛋白酶原；斑马鱼zftry2属于group Ⅱ,为阳离子型胰蛋白酶原.RT-PCR结果显示,三者组织分布模式类似,且在肠中有最高表达量.这些结果为研究鱼类胰蛋白酶原的基因进化和功能以及进一步探讨鱼类消化生理的分子机制奠定了基础.【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(052)001【总页数】7页(P111-117)【关键词】斑马鱼;胰蛋白酶原;克隆;组织表达【作者】陈文波;李卫国;张珍;焦春磊;吴帆【作者单位】河南理工大学资源环境学院,河南焦作 454000;河南理工大学资源环境学院,河南焦作 454000;河南理工大学资源环境学院,河南焦作 454000;河南理工大学资源环境学院,河南焦作 454000;河南理工大学资源环境学院,河南焦作454000【正文语种】中文【中图分类】Q785;S917胰蛋白酶Trypsin(EC3.4.21.4)是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员，是动物消化蛋白质的重要酶类［1］。

基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建

基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建基因工程是一项对生物的基因进行精确调整的技术。

通过使用基因工程技术，人们可以设计出更加优良的生命体，并为生命体的研究提供更加有力的工具。

此前，学生们在课堂上只是通过书本等介质来学习基因工程的相关知识，而课程实验则更多的停留在理论层面，无法给学生们带来更加深刻的印象。

针对以上问题，一些高校开设了基因工程课程综合实验。

通过此课程，学生们可以在实验室中亲手操作各种基因工程实验，并更好的掌握相关的基因工程实验技术。

本文以某高校为例，介绍一项基因工程课程综合实验——转基因斑马鱼的构建，并从实验的背景、实验步骤和实验意义三个方面来进行详细剖析。

一、实验背景斑马鱼是一种热带淡水鱼，其生长发育周期短，幼鱼透明，移植简便等优点使它成为了许多生物学门类研究的模型生物。

斑马鱼表层神经细胞活动强烈，非常适合用来研究感知、运动和认知的神经环路。

因此，斑马鱼成为神经科学研究、药物筛选、疾病诊断等领域的重要模型生物。

转基因斑马鱼的构建是一项基因工程研究中的重要课题。

通过向斑马鱼中植入人类基因或与斑马鱼有关的基因，可以使得斑马鱼显示出人类疾病的症状，从而更好的研究这些疾病的发生和发展机制。

例如，植入人类神经退行性疾病相关基因的斑马鱼，可以展现出某些神经退行症的症状，可以更好地研究这些疾病的病理涅槃。

二、实验步骤1、设计转基因构和转基因斑马鱼的构建需要进行基因克隆，制备转基因构建质粒。

课程设计中的实验制备的是pPtre-3xFlag-Nf1（Nf1:神经母细胞瘤），这是一种携带3xFlag标签的神经母细胞瘤基因，可用于斑马鱼的转基因实验。

2、制备大量转基因质粒使用大肠杆菌进行转基因质粒大量制备，获得足够多的质粒进行后续操作。

Ptre-3xFlag-Nf1质粒用水切割得到15Kb和6.3Kb的两个DNA段，经过凝胶电泳后得到目标DNA。

3、定量测序分析对转基因质粒进行定量测序分析，保证重要区域为正确序列。

斑马鱼多克隆抗体制备方案

斑马鱼多克隆抗体制备方案斑马鱼是现代生命科学、健康科学和环境科学等研究的重要模式动物，我国的斑马鱼研究群体日益壮大，相比于大小鼠这类模式动物，斑马鱼个体小，可进行大规模的养殖，其体外受精方式可以让科研工作者研究时直接进行胚胎操作，并且斑马鱼的繁殖能力很强，每周可产卵约100-500个。

在斑马鱼卵受精后，它会快速发育，早期身体呈现透明状，用显微镜等设备可清楚观察其表型，现已成功运用于发育生物学、神经生物学、肿瘤病理学、药物学、毒理学等相关领域。

2018年10月11日-14日，全国（全球华人）斑马鱼PI大会大会在武汉举行，展会期间来自全国各地研究院所的斑马鱼专家与学者就斑马鱼抗体制备的技术手段，以及预期达到的实验效果和特异性等问题进行了沟通和交流。

随着斑马鱼研究群体日益壮大，斑马鱼抗体作为一项重要的工具也成了科学家的一道难题。

很多科学家反馈市售斑马鱼抗体无法满足实验需求，不是找不到抗体就是抗体特异性达不到要求。

人和小鼠物种的抗体为什么不能用于斑马鱼研究呢?斑马鱼虽然和人的亲缘性就很近，同源性高，但很多蛋白质的差别很大，故而不能通用，斑马鱼抗体的定制就成为一个好的选择。

多克隆抗体能够识别多个抗原表位，同时具有制备周期短、成本低、应用广泛等优点，常用于斑马鱼抗体的制备。

物种上可以提供兔、大鼠、小鼠、豚鼠、羊等多个宿主在内的多抗制备。

多克隆抗体制备技术流程：◆根据斑马鱼蛋白质序列设计免疫原，从源头保证抗体特异性；◆采用皮下多点注射，淋巴结免疫等方式，搭配自主研发佐剂以提高抗体效价，针对免疫原ELISA效价至少1：160000；◆采用抗原特异性亲和纯化；◆斑马鱼组织裂解液做为检测抗原，内源性验证，保住抗体特异性。

在蛋白质抗原难以获得，或对抗体特异性要求很高的情况下，多肽抗原显示出其独特优势。

与蛋白质抗原相比，多肽抗原制备容易，快速，价格较低，设计方案可选择空间更大，是一种常用的免疫原。

当客户需要区分同源性较高的家族蛋白质时，或需要制备磷酸化，甲基化，乙酰化等修饰性抗体时，多肽就成为重要或者唯一的免疫原选择。

斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析

２１００年９月第３３卷第３期
湖南师范大学自然科学学报。
ＪｕｎｌｏｔｒｌＳｉｎｅｏｎｎＮｏｍａｉｅｓｔｏｒａｆＮａｕａｃｅｃｆＨｕａｒｌＵｎｖｒｉｙ
Ｖｏ．３Ｎｏ３１３．
Ｓｐ．，０ｅ２０１
ＨＳＡ２是斑马鱼心脏发育的一个标志基因，了利用斑马鱼动物模型进一步研究ＨＳ为Ａ２基因在心脏发
育中的功能，采用生物信息学结合Ｒ－ＣＴＰＲ的方法获得了斑马鱼ＨＳ基因的片段．Ａ２将所得的片段插人原核表达载体ｐＥ－Ｔｌ中，将重组质粒（Ｇｘ一一Ａ２转化大肠杆菌（ｃｌ）Ｌ１ＩＴＧＸ４－并ｐＥ４Ｔ１ＨＳ）ＥｉＢ２，Ｇ诱导表达ＧＴＨＳｏＰＳ－Ａ２融合蛋
ＣｌｎｎｎｏｙｌｎｌｔｏｙＰｒｐｒｔｎｏｏｉｇａｄＰｌｃｏａＡｎｉｄｅａａｉｆＨＡｂｏ
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ＧｎｎＺｅｒｆｈｅｅｉｂａｉｓ
ＨｕａｏｍａＵｉｒｔ，Ｃａｇｈ１０１ｈｎ）ｎｎＮｒｌｎｅｓｙｈｎｓａ０８，Ｃｉａｖｉ４
ＡｂｓｒｃＨＡ．ｉｍｐｏｅｓａｍｏｅｕａｒｅｆｈａｔｄｖｌｐｎ．ＩｒｒｔｕｔｅｎｅｔａｅｔｅｔａｔｓｅｌｙｄａｌｃｌｒｍａｋｒｏｅｒｅｅｏｍｅｔｎｏｄｅｏｆｒｈｒｉｖｓｉｔｈｇｆｎｃｉｎｏｈｅＨＡＳｎｔｅｅｏｉｇｈａｔｕｉｅｒｆｓｓａｍｏｅ．ａｆａｍｅｔｏｕｔｏｆｔ２ｉｈｅｄｖｌｐｎｅｒｓｎｇｚｂａｈａｄ１ｒｇｎｆｉＳｅｎｚｂａｓｓ２ｇｎｅｉｅｒｆｈｗａｉ

斑马鱼hand2基因的克隆_抗体制备及分析

2010年3月第33卷第1期湖南师范大学自然科学学报Journal of Natural Science of Hunan Nor mal UniversityVol.33　No.1M ar.,2010斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析朱　婷,黄　文,王跃群,李永青,袁婺洲,莫小阳,万永奇,吴秀山,邓　云3 (湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心,中国长沙　410081)摘　要　为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT2PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX24T21中,并通过I PTG诱导表达出GST2Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western bl otting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;I PTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得S DS2P AGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.关键词　hand2;斑马鱼;原核表达;多克隆抗体中图分类号　Q812 文献标识码　A 文章编号　100022537(2010)0120108206C l o n i ng and Po l yc l o na l An ti bo dy P rep a ra ti o n o f hand2Gene i n Zeb rafishZHU Ting,HUAN G W en,WAN G Yue2qun,L I Yong2qing,YUAN W u2zhou,MO X iao2yang,WAN Yong2qi,WU X iu2shan,D EN G Yun3(The Center f or Heart Devel opment,Key Lab of MOE f or Devel opment B i ol ogy and Pr otein Che m istry,Hunan Nor mal University,Changsha410081,China)Abstract　The hand2gene in zebrafish is cl oned by bi oinf or matics combined with RT2PCR technique,then hand2frag ment is inserted int o pGEX24T21vect or.The GST2Hand2fusi on p r otein is induced by I PTG.After puri2 ficati on by GST affinity chr o mat ography,GST2Hand2fusi on p r otein is used t o i m mune the Ne w Zealand white rab2 bits t o p repare polycl onal antibody.The antibody is assayed by western bl otting and i m munohist oche m istry.The re2 sults show that zebrafish hand2gene coding regi on has627bp,which encods208a m ino acids,has83%identifica2 ti on with hu man Hand2gene.The GST2Hand2fusi on p r otein exp ressed in BL21accounts for71%of the t otal p r o2 teins.The GST2Hand2fusi on p r otein dis p lays a single strap in S DS–P AGE after purificati on,whose molecular mass is49000.The report de monstrates that the antibody has high sensitivity and s pecificity.Key words　hand2;zebrafish;p r okaryotic exp ressi on;polycl onal antibody已有文献表明:碱性螺旋2环2螺旋(basic helix2l oop2helix,bHLH)转录因子对骨骼肌细胞[1]、造血细胞[2]及一些神经元细胞[3]的分化起重要调节作用;也有bHLH家族成员与心脏及其他组织中的表达,肌细胞的发生、细胞增殖、组织分化以及其他重要的发育过程有关.Hand基因就是bHLH家族成员之一[4].近来有文献报道hand基因对心脏发育有非常重要的调节作用,在心脏的发生过程中与外胚中胚层、心管和心室的发育3收稿日期:2009212215基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671137);湖南省教育厅优秀青年资助项目(06B053)3通讯作者,E2mail:dengyun2008@有关.其中,hand 2(又称dhand )主要在右心室和蜕膜中表达[5].剔除hand 2等位基因,纯合子胚胎不能形成右心室[6].在缺失hand 2的小鼠胚胎中,脉管系统不能正常形成[7].Hand 2很可能是通过VEGF 信号途径在血管发育和发生调控中起着重要的作用.另外,hand 2的表达又受骨形成蛋白(BMPs )调控[8],且能在鳃弓神经嵴中表达,维持颅面结构和动脉弓的形状[9].近年来研究发现hand 2对于胚胎发育十分重要,其功能异常与人类一些先天性异常综合征相关(如22q11缺失综合征、DGS 综合征、CAT CH222综合征等)[10212].斑马鱼是进一步研究hand 2在心脏发育中功能理想模型,作者克隆了斑马鱼hand 2基因,成功实现原核表达并制备效价较高、特异性较好的Hand2多克隆抗体,对进一步研究利用斑马鱼研究hand 2基因生物学功能奠定基础.1　实验部分1.1　实验材料大肠杆菌E .coli DH5a,E .coli BL21菌株,由本实验室保种;载体pGEX 24T 21为本实验室提供;限制性内切酶B am H I 和Sa l I,Tag DNA 聚合酶,10×l oading buffer 购买自深圳晶美公司;p MD182T 载体和连接酶购自大连TaKaRa 公司;柱式DNA 胶回收试剂盒(离心柱型)购买自博大泰克公司;蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、I PTG (异丙基2β2D 2硫代半乳糖苷)、RNase 等购自上海sangon 公司;弗氏佐剂购自Sig ma 公司;Glutathi one Sephar ose T M4B 购自Amersha m B i otech 公司;新西兰大白兔购自中南大学湘雅附一医院.1.2　斑马鱼hand 2基因生物信息学分析应用UCSC 程序(htt p://genome .ucsc .edu ),根据已克隆的人的hand 2基因序列,在NCB I 数据库(ht 2t p://www .ncbi .nl m .nih .gov /)中查找斑马鱼hand 2基因,分析该基因在染色体中的位置、外显子与内含子数目、基因全长和开发阅读框的碱基数目,及其编码蛋白质的氨基酸数目.S MART (htt p://s mart .e mbl 2heidel 2berg .de )分析蛋白质Hand2的结构域.Matchcode 软件用于核苷酸序列和蛋白质序列的匹配.DNA star 软件用于DNA 序列、蛋白质性质及进化关系分析.Pri m er Pre m ier 5.0软件用于酶切位点的分析和PCR 引物设计.凝胶分析系统用于分析蛋白相对含量.1.3　斑马鱼hand 2基因的分离及序列测定用热酚法[13214]抽提斑马鱼成鱼组织总RNA 1mg,按试剂盒说明书分离纯化出mRNA ,并以之为模板进行反转录PCR 扩增(c DNA PCR Kits,TaKaRa 公司),从而构建斑马鱼成鱼组织c DNA 文库.以提取的斑马鱼mRNA 反转录所得的c DNA 文库为模板,用根据以上分析得到斑马鱼hand 2基因序列设计合成的引物:5′端引物(5′GG AT CCATG AGTTT AGTTGG AGGGT 3′,含B am H I 酶切位点)和3′端引物(5′GT CG ACCT CATTGCT 2TCAGTT CCA 3′,含Sal I 酶切位点),进行PCR 扩增.PCR 反应条件如下:95℃变性5m in;95℃30s,58℃30s,72℃42s,反应32个循环;72℃8m in .所得PCR 产物纯化后与p MD182T 载体16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒,通过B am H I 和S al I 酶切鉴定后,在上海英峻公司测序分析.1.4　斑马鱼Hand2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备利用限制性内切酶B am H I 和S al I 双酶切pMD182T 2hand 2质粒,切取hand 2基因片段,与同以B am H I和S al I 双酶切的pGEX 24T 21质粒相连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,接种于LB 固体培养基平板上(含50mg/L 氨苄青霉素)筛选阳性克隆,提质粒,经B am H I 和Sal I 双酶切鉴定,进行测序分析.将鉴定正确连接的pGEX 24T 212hand 2质粒转入BL21菌株.将含重组子pGEX 24T 212hand 2的BL21菌株在LB 培养液中37℃培养过夜,以1∶50比例接种于200mL LB 培养液,37℃振荡培养至OD600至0.6,加入I PTG 至终浓度为0.5mmol/L,于30℃继续培养5h .收集诱导培养细菌,重悬于pH 8.0的P BS 溶液中,超声破菌,离心后取上清经S DS 2P AGE 电泳鉴定.经考马斯亮蓝R250染色,脱色后,用凝胶图象分析系统分析,计算蛋白质相对含量.将表达的蛋白超声裂解后,离心取上清.再将上清与Glutathi one Sephar ose T M 4B 结合30m in,3000r/m in 、4℃离心5m in,去上清.P BS 漂洗后,用还原型谷胱甘肽缓冲液缓慢混匀,重悬珠子15m in,3000901第1期朱　婷等:斑马鱼hand 2基因的克隆、抗体制备及分析 r/m in 、4℃离心5m in 离心,上清即纯化的GST 2Hand2融合蛋白.免疫新西兰大白兔获取多克隆抗体将纯化得到的GST 2Hand2目的蛋白0.6mg 按体积比1∶1与弗氏完全佐剂混合,皮下多点注射免疫新西兰大白兔,在第14d 、第21d 再将目的蛋白0.15mg 与弗氏不完全佐剂混合并免疫.第28d 主动脉取血后,收集血清,即得到斑马鱼Hand2蛋白的多克隆抗体,分装后,-80℃保存.1.5　W estern blotti n g 分析抗体特异性将含pGEX 24T 212hand 2重组子的BL21菌株和含pGEX 24T 21的BL21菌株在LB 培养液中扩大培养,用I PTG 诱导后,收集细菌,P BS 重悬,S DS 2P AGE 电泳分离.将Hand2抗体稀释1000倍后,采用W estern bl otting 方法对表达的总蛋白抗原杂交,以检测抗体的特异性.同等条件下,用GST 抗体进行W estern bl otting 分析作为对照.1.6　免疫组化分析抗体特异性取斑马鱼成鱼心脏组织石蜡切片,脱蜡,3%H 2O 2室温孵育5～10m in;95℃的枸橼酸钠缓冲液(pH 610)中抗原热修复15m in;5%正常山羊血清封闭20m in 后,将Hand2抗体稀释100倍,于4℃孵育过夜;滴加生物素化羊抗免I gG,37℃孵育30m in;加S ABC 链霉亲和素2生物素2酶(或者F I T C )复合物室温孵育30m in,DAB 显色;苏木素轻度复染,中性树脂封片,各步骤间均用pH 7.4的P BS 漂洗2～3次,每次5m in .在相同条件下,以未免疫血清进行免疫组化分析作为对照.2　结果图1　hand 2的c DNA 序列、ORF 和编码蛋白2.1　斑马鱼hand 2基因克隆斑马鱼hand 2位于一号染色体上,全基因在基因组上长达2061bp,含两个外显子,一个内含子.其m RNA 为1668bp,该转录本编码一个长为208个氨基酸的蛋白质(图1),蛋白相对分子质量为23000.从491bp 到1117bp 为开放阅读框,其编码的蛋白包含一个HLH 结构域.利用斑马鱼hand 2基因序列在NCB I011 湖南师范大学自然科学学报第33卷数据库中进行Homol ogene 搜索,发现在人类、小鼠、大鼠、猩猩、狗、原鸡、果蝇中都存在斑马鱼hand 2的同源基因.Hand2同源蛋白进化树分析表明:Hand2蛋白在人类、猩猩、小鼠、大鼠中的同源度高达82%;在狗中的蛋白同源度达60%,与果蝇的蛋白同源度为39%.经PCR 技术扩增出hand 2基因全长,将目的片段纯化回收后,与pMD182T 连接.用B am H I 和S al I 双酶切pMD182T 2hand 2质粒,产生与hand 2基因大小一致的酶切片段,约640bp (图2).表明hand 2基因已插入到pMD182T 载体中.测序结果与NCB I 数据库报道一致.2.2　重组表达质粒的构建及GST 2Hand2融合蛋白诱导表达和纯化将从p MD182T 2hand 2质粒切取下来的斑马鱼hand 2基因片段插入到pGEX 24T 21载体中,构建成pGEX 24T 212hand 2质粒,质粒以B am H I 和Sal I 酶切产生与hand 2基因大小一致的酶切片段(图3),表明斑马鱼hand 2基因已插入到载体pGEX 24T 21. M:S M0241DNA 分子量标准; M:S M0331DNA 分子量标准; 1:B am H Ⅰ/Sal I 双酶切结果. 1:B am H Ⅰ/Sal I 双酶切结果.图2　p MD182T 2hand 2质粒酶切鉴定图谱图3　pGEX 24T 212hand 2重组表达质粒双酶切鉴定图谱收集诱导的细菌,P BS 重悬后超声破菌,取上清经S DS 2P AGE 电泳鉴定.结果表明,经I PTG 诱导后大量表达出相对分子质量约为49000的融合蛋白(图4),与预期结果一致.因为pGEX4T 21载体能表达出26000大小的GST 蛋白,而Hand2的蛋白相对分子质量为23000,故表达出的蛋白为49000大小的GST 2Hand2融合蛋白.该蛋白经Glutathi one Sephar ose T M 4B 亲和纯化后,S DS 2P AGE 电泳,经考马斯亮蓝染后,显示出特异性较强的条带,经凝胶图像分析系统分析,蛋白质相对含量高达71%,且为可溶性蛋白(图4). M:S M0671蛋白分子量标准;1:未经诱导的pGEX4T 21质粒转化的BL21总蛋白;2:I PTG 诱导后的pGEX4T 21质粒转化的BL21总蛋白;3:未经诱导的pGEX4T 212hand 2重组质粒转化的BL21总蛋白;4:I PTG 诱导后的pGEX4T 212hand 2重组质粒转化的BL21总蛋白;5:纯化的pGEX4T 212hand 2表达蛋白.图4　S DS 2P AGE 电泳图谱2.3　Hand2多克隆抗体特异性检测利用制备的Hand2多克隆抗体对含有重组子pGEX 24T 212hand 2和含有空载体pGEX 24T 21两种BL21菌株的I PTG 诱导表达蛋白进行W estern bl otting 分析,在相同条件下,以GST 抗体进行W estern bl otting 分析作为对照.结果表明:在用Hand2抗体进行分析时,在pGEX 24T 212hand 2诱导表达的GST 2Hand2融合蛋白的111第1期朱　婷等:斑马鱼hand 2基因的克隆、抗体制备及分析 49000处能检测到特异性条带,而pGEX 24T 21诱导表达蛋白则没有49000特异性条带出现;而用GST 抗体分析时,则在pGEX 24T 212hand 2诱导表达的GST 2Hand2融合蛋白的49000处和pGEX 24T 21诱导表达的GST 蛋白的23000处均有条带出现(图5).说明利用GST 2Hand2融合蛋白制备的Hand2多克隆抗体对Hand2蛋白有抗性,对GST 没有抗性,制备的Hand2抗体特异性较强,达到了用于进一步实验的需要. A:用制备的Hand2多克隆抗体W estern bl otting 分析I PTG 诱导的pGEX 24T 212hand 2和pGEX 24T 21在大肠杆菌BL21中的表达蛋白;B:用GST 抗体W estern bl otting 分析I PTG 诱导的pGEX 24T 212hand 2和pGEX 24T 21在大肠杆菌BL21中的表达蛋白.图5　W estern bl otting 检测抗体的特异性2.4　免疫组化结果分析应用免疫组化SuperPicTure T M法(DAB 棕色反应法)染色的切片,背景无色或浅棕色.Hand2免疫反应阳性物质呈深浅不等的棕色和棕黄色颗粒,主要定位于细胞核内,细颗粒状(图6A ).而在对照组中,细胞的细胞核被苏木素复染成淡蓝紫色(图6B ),未出现棕色颗粒阳性信号,与预想结果一致.再次说明Hand2抗体是特异性的. A:用Hand2抗体免疫组化分析斑马鱼心脏组织,图中黄色颗粒即为阳性信号;B:用未免疫血清免疫组化分析斑马鱼心脏组织.放大倍数=230.图6　免疫组化分析抗体特异性3　讨论Hand2蛋白含一个HLH 结构域,属于bHLH 家族.在这个家族成员中,组成HLH 结构域的多数氨基酸相对保守,不同物种间Hand2蛋白的同源性大多可达到80%.与其他物种相比,斑马鱼hand 2基因的开放阅读框不长,仅627bp,通过PCR 技术作者很容易扩增出了斑马鱼hand 2基因,并将其插入到pGEX 24T 21表达载体上.pGEX 表达载体是谷胱甘肽转移酶(GST )表达载体系列,该表达载体是专为外源多肽能在大肠杆菌中表达,并可在非变性的条件下快速纯化而设计的.与其他表达载体不同之处在于,pGEX 表达载体S D 序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因,而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连.表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体,可用Glutathi one Sephar ose T M 4B 纯化出来.目的蛋白与GST 蛋白以融合蛋白形式在大肠杆菌BL21中表达是目前使用很广泛的表达系统之一,它不仅表达量高,而且具有纯化方便的优点[15].在进行融合蛋白诱导时,蛋白极易以包涵体的形式表达,而包涵体形成后的缺点是需变性、复性等复杂处理过程后才能得到可溶性融合蛋白质.为了避免变性、复性等复杂过程,通过改变诱导的温度、时间和I PTG 的浓度,摸索到最适宜的条件,即在诱导温度为30℃,I PTG 浓度为0.5mmol/L 的条件下诱导5h,使211 湖南师范大学自然科学学报第33卷融合蛋白在上清表达,且不影响蛋白的大量表达,这样使得利用Glutathi one Sephar ose T M 4B 进行融合蛋白的纯化过程变得简单.在进行免疫组化实验时,热修复用的枸橼酸钠溶液的pH 值非常重要,偏高或偏低都将导致热修复效果不佳而影响免疫组化实验结果,故要严格控制好枸橼酸钠溶液的pH 值.本实验中,作者克隆了斑马鱼hand 2基因的全长,获得了高纯度的蛋白,并首次制备了斑马鱼Hand2抗体的多克隆抗体.W estern bl otting 及免疫组化等方法证明,制备的Hand2多克隆抗体能与原核生物和真核生物体内表达的Hand2蛋白结合,显示了该抗体与Hand2蛋白结合的特异性.因此,它为将来运用免疫共沉淀、染色质免疫沉淀、胚胎抗体染色等手段深入研究hand 2基因的功能奠定了基础.参考文献:[1]　OLS ON E,K LE I N W.bHLH fact ors in muscle devel opment:dead lines and comm it m ent,what t o leave in and what t o leave out[J ].Genes Dev,1994,8:126.[2]　SH I V DAS AN I R,MAYER E,ORKI N S .Absence of bl ood f or mati on in m ice lacking the T cell leukae m ia oncop r otein tal 21/SC L [J ].Nature,1995,373:4322434.[3]　JAN L,JAN Y .HLH p r oteins,fly neur ogenesis,and vertebrate myogenesis[J ].Cell,1993,75:8272830.[4]　E VANS S .Vertebrate Tin man homol ogues and cardiac differentiati on [J ].Cell B i ol,1999,10(1):73283.[5]　B I B E N C,HARVEY R.Homeodomain fact or Nkx225contr ols left/right asy mmetric exp ressi on of bHLH gene eHand during mu 2rine heart devel opment[J ].Genes Dev,1997,11:1357–1369.[6]　MOR I N S,CHARRON F,ROB I T A I L LE L ,et al .G AT A2dependent recruit m ent of M EF1p r oteins t o target p r omoters[J ].E MBO J,2000,19(9):204622055.[7]　Y AMAGI SH I H,OLS ON E,SR I V AST AVA D.The basic helix 2l oophelix transcri p ti on fact or,dHAND,is required f or vasculardevel opment[J ].Clin I nvest,2000,105:2612270.[8]　MARTHE J,MATT H I A S S,C AROL I N C,et al .The transcri p ti on fact or dHAND is a downstrea m effect or of BMPs in sy mpa 2thetic neur on s pecificati on[J ].Devel opment,2000,127:407324081.[9]　DAV I D G,MCF ADDE N,JEROE N C,et al .A G AT A 2dependent right ventricular enhancer contr ols dHAND transcri p ti on in thedevel op ing heart[J ].Devel opment,2000,127:533125341.[10]　CHUNG M ,LU J,W E NG Y,et al .Absence of mutati ons in hu man ubiquitin fusi on degradati on p r otein gene in tetral ogy ofFall ot[J ].J MolM ed,2001,79(526):3382342.[11]　T HOMAS T,K UR I HARA H,Y AMAGI S H I H.A signaling cascade involving endot helin21,dHAND and m sx1regulates de 2vel opment of neural crest derived branchial arch mesenchy me[J ].Dev,1998,125(16):300523014.[12]　P I O T R,AHN D,S CH I L L I N G T .The zebrafish vangogh mutati on disrup ts tbx1,which is involved in the D i2George deleti onsyndr ome in hu mans [J ].Devel opment,2003,130(20):504325052.[13]　李永青,曾伟奇,朱传炳,等.一个人类新基因Z NF322的研究初报[J ].生命科学研究,2001,5(2):1412145.[14]　王雁云,罗开梅,李永青,等.一种快速的胚胎组织总RNA 的提取方法[J ].生命科学研究,2001,5(1):88290.[15]　Y UAN C,RE ULAND J,LEE L,et al .Op ti m ized exp ressi on and ref olding of hu man kerat o ep ithelin in BL21(DE3)[J ].Pr o 2tein Exp r Purif,2004,35:39245.(编辑　王　健)311第1期朱　婷等:斑马鱼hand 2基因的克隆、抗体制备及分析。

斑马鱼nrf基因时空表达分析及其在调控胰外分泌酶原基因表达中的作用研究

含抗氧化反应元件（ＡＲＥ）序列基因ｆ如：ＮＱ０１抗氧
以上研究表明，厂同源基因均可参与氧化应激
化损伤及对抗外来化合物毒性方面是最重要的核转录因子，参与调控许多抗氧化酶和ＩＩ相解毒酶的
Ｎｒｆ３（Ｎｆｅ２１３）。
条件下出现急性肺损伤，这说明ｒｆ３可能在氧化应激反应中起保护作用。Ｎｆｅ２与／Ｊ，Ｍａｆ：￣白（ｓＭａｆ）
形成异二聚体作为转录因子调节珠蛋白基因的表达，并且可调节成熟红细胞中的氧化应激反应 ” 。有研究表明化酶等）的表达系同源基因编码的蛋白可以调节。
研究６个月桩物种之间的关系，实验对６个Ｎｒ瞪白进行系统发育树分析，结果显示６个Ｎｒｆ蛋白的分子进化趋势
基因各产生了两个拷贝，但Ｎｒｆ蛋白仍然是比较保守的。此外，实验选取斑马鱼胚胎发育十个不同时期（１ｃｅｌｌ、２ｃｅｌｌ、３．５ｈｐｆ、６ｈｐｆ、１２ｈｐｆ、
川在哺乳动物的许多组织中都表达，它在调节肝脏中氧化还原平衡、涉及发育的调控基因、氧化应激反应 ’ 、细胞骨架组织和蛋白酶体等方面起着重要作用。Ｎｒｆ２被认为在细胞内抑制氧
（Ｃａｐ ‘ ｎ ’ Ｃｏｌｌａｒｂａｓｉｃｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ，Ｃ胞保护作用 … 。，一，２基因敲除

斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用[发明专利]

专利名称：斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用专利类型：发明专利
发明人：宋桂丽,刘春艳,龙勇,李青,崔宗斌
申请号：CN201510281913.X
申请日：20150528
公开号：CN105087578A
公开日：
20151125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用，涉及一种组织和器官特异性表达基因的增强子捕获技术领域，用于荧光标记斑马鱼胚胎发育过程中的神经细胞。

斑马鱼神经组织特异性增强子，其序列为SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列。

其应用是：①研制神经组织特异表达荧光的转基因鱼，可用于神经器官再生过程研究；②用于驱动任意目的基因在神经组织特异表达，为研究者研究神经系统发育及相关疾病治疗提供有力工具。

本发明可用于斑马鱼眼睛发育及损伤再生过程的研究；有助于研究特定基因在神经系统发育及调控方面的作用，为相关疾病治疗提供新材料。

申请人：中国科学院水生生物研究所
地址：430072 湖北省武汉市武昌区东湖南路7号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：黄瑞棠
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干扰素调节因子2结合蛋白2在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达谱分析

Vol.41No.3Mar.2021上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)干扰素调节因子2结合蛋白2在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达谱分析王海红，高硕，朱军#，周隽#上海交通大学医学院附属瑞金医院中法生命科学和基因组研究中心，上海200025［摘要］目的·探究干扰素调节因子2结合蛋白2（interferon regulatory factor 2binding protein 2，irf2bp2）基因的2个横向同源物（irf2bp2a 和irf2bp2b ）在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达异同。

方法·选取发育不同时间点（胚胎期和幼虫期）的斑马鱼胚胎，通过mRNA 全胚胎原位杂交技术明确irf2bp2a 和irf2bp2b 的时空表达谱，并通过实时定量PCR 检测其表达水平。

结果·irf2bp2a 和irf2bp2b 在神经系统、眼及胸鳍等部位都有着类似的高表达，而各自在肝脏或斯坦尼小体出现特异性表达，提示其在斑马鱼胚胎早期发育过程中具有独特的表达模式。

实时定量PCR 检测结果显示irf2bp2a 和irf2bp2b 在胚胎发育早期都有表达，但表达水平有所不同。

结论·尽管斑马鱼irf2bp2a 和irf2bp2b 这2个横向同源物具有高度保守的功能结构域，但二者在胚胎早期发育过程中的表达谱不尽相同，提示其功能并不完全冗余。

［关键词］干扰素调节因子2结合蛋白2；斑马鱼胚胎；表达谱；mRNA 全胚胎原位杂交；实时定量PCR ［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.03.005［中图分类号］R321［文献标志码］AExpression patterns of interferon regulatory factor 2binding protein 2during the early embryonic development of zebrafishWANG Hai -hong,GAO Shuo,ZHU Jun #,ZHOU Jun #Sino-French Research Center for Life Sciences and Genomics,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China[Abstract ]Objective ·To explore the expression similarities and differences of the two paralogs of interferon regulatory factor 2binding protein 2(irf2bp2)gene (irf2bp2a and irf2bp2b )during the early embryonic development of zebrafish.Methods ·Zebrafish embyos at different developmental stages (embryonic and larval stages)were chosen as research object.The mRNA whole mount in situ hybridization was used to detect the temporal and spatial expression patterns of irf2bp2a and irf2bp2b,and real-time quantitative PCR (qPCR)was used to detect their expression levels.Results ·Although irf2bp2a and irf2bp2b shared similar expression patterns in the nervous system,eye and pectoral fin,irf2bp2a and irf2bp2b were specifically expressed in liver and stannius corpuscles,respectively,suggesting their expressions were quite unique in certain organs.The results of qPCR showed that both irf2bp2a and irf2bp2b were expressed in the early embryonic development stage,but their expression levels were different.Conclusion ·Although the functional domains of irf2bp2a and irf2bp2b are highly conserved,the two paralogs of zebrafish irf2bp2display some distinctions in the expression patterns during the early embryonic development of zebrafish,which suggests that their functions might not be redundant.[Key words ]interferon regulatory factor 2binding protein 2(irf2bp2);zebrafish embyo;expression pattern;mRNA whole mount in situ hybridization;real-time quantitative PCR (qPCR)干扰素调节因子2结合蛋白2（interferon regulatory factor 2binding protein 2，IRF2BP2）因首先被发现可与干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2，IRF2）结合并作为其转录辅因子而得名［1］。

斑马鱼模型在遗传学研究中的应用

斑马鱼模型在遗传学研究中的应用斑马鱼是一种广泛用于生物学研究的实验动物。

其身体结构简单，胚胎发育快速，易于繁殖，可以进行大规模的遗传学实验。

在斑马鱼遗传学研究中，斑马鱼模型被广泛应用，为我们深入研究生命起源和发展提供了重要的平台。

斑马鱼在基因遗传的研究中具有独特的优势。

首先，斑马鱼具有短周期和高繁殖率，可以很快地获得大量后代。

而且，斑马鱼的生殖周期比较短，它们可以在短时间内繁殖多代后代，因此可以很快地观察到基因变异在品系中的分布。

并且，斑马鱼胚胎在发育的早期阶段是透明的，因此可以直接观察染色体以及其他生物学过程的发生。

其次，斑马鱼基因组已经被完整测序，且其基因组大小较小，只有1.5亿个碱基对，这意味着可以快速地鉴定出参与特定生物学过程的基因。

许多基因在斑马鱼和人类之间是高度保守的，并且因为斑马鱼基因组较小，研究人员可以更快速、精确地定位到人类基因组中的相应位点，进一步说明斑马鱼模型在人类疾病研究中作用的重要性。

此外，斑马鱼在胚胎发育研究中也具有非常重要的作用。

因为斑马鱼的受精卵是透明的，所以可以直接观察到受精卵在不同阶段的细胞分裂与分化情况，以及不同的细胞类型的形成。

同时，自斑马鱼的受精卵开始，研究人员就可以通过注射RNA、外源蛋白等方法，操控斑马鱼的基因表达，再结合早期的胚胎观察，可以揭示出基因调控对于生物体胚胎发育的影响。

斑马鱼模型在遗传学研究中的应用也不仅仅局限于观察其基因在胚胎发育中的作用。

如将人类疾病相关基因连接到斑马鱼基因组中的相应位点，往往会导致斑马鱼的相应组织发生病理性改变，如神经退行性疾病或心肌病等。

经过针对性的治疗，研究人员也能够发现有效的药物，这为人们寻找治愈疾病的新方法提供了帮助。

斑马鱼的“红白相间”特点，也为研究人员提供了方便。

利用斑马鱼对于硝基恩氏塞氏菌等病原体的抵抗力和免疫系统相似于哺乳动物的特点，可以通过转基因方法制造携带特定疾病标志物的斑马鱼模型，分析其细胞、组织和器官等反应，来研究人体免疫系统的机制、寻找抗病毒及抗癌药物等。

斑马鱼TNFR2基因克隆及表达分析

斑马鱼TNFR2基因克隆及表达分析摘要：利用巢式PCR方法克隆斑马鱼（Danio rerio）肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）基因，该基因全长1 242 bp，编码413个氨基酸，分子质量44.68 ku，等电点5.90。

实时荧光定量PCR结果表明，TNFR2基因在斑马鱼胚胎发育时期的表达量呈现下降后趋于稳定，在斑马鱼不同组织中均能检测到，并且表达丰度差别不大，在肌肉中表达量最高，在肠道中表达量最低。

关键词：斑马鱼（Danio rerio）；肿瘤坏死因子受体2；实时荧光定量PCRAbstract：Tumor necrosis factor receptor2（TNFR2）of zebrafish was isolated using nest PCR method. The gene was 1 242 bp，encoding 413 amino acids. The deduced molocular mass and pI was 44.68 ku and 5.90 respectively. The realtime qPCR results showed that TNFR2 g ene was in“descent-stabilization” pattern during the development period. TNFR2 gene was expressed in different tissues of zebrafish，and highly expressed in muscle，lowly expressed in gut.Key words：zebrafish（Danio rerio）；TNFR2；realtime qPCR肿瘤坏死因子超家族（Tumor necrosis factor super family，TNFSF）是机体免疫反应的重要调节因子，调控炎症反应、细胞凋亡等诸多细胞应答进程[1]。

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析王盼盼;彭夕洋;易珍;江志刚;邓云;吴秀山;万永奇【期刊名称】《湖南文理学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)004【摘要】在心脏发育过程中，相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键.斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因.生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸，含有一个CXXC结构域.为进一步研究该基因的功能，采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因.将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中，经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中，用IPTG诱导表达出pET-28a-CFL融合蛋白，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%，融合蛋白相对分子质量约为30 kD.经包涵体纯化后，免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体.经验证，具有较好的特异性和较高的效价，可以用作 western-blot免疫印迹等实验分析.%The normal expression of related genes is critical in the heart development process. To explore the heart development related genes, to provide the basis to understand the pathogenesis of congenital heart disease and interventional treatment. CFL gene is a candidate gene for heart development from Zebrafish cDNA library. Bioinformatics analysis revealed that it contains CXXC domain, and encoding 278 amino acids. To further investigate the possible functions of CFL in the process of heart development, the full length of CFL gene was cloned and inserted into pET-28a vector.The His-CFL fusion protein was induced by IPTG, the expression of fusion protein accounts for 71 of totalbacteria protein. The relative molecular mass is about 30 kD. After inclusion body purification, immune the New Zealand white rabbit to prepared polyclonal antibody and was indentifited by western blot. These results demonstrate that the high titer polyclonal antibody was obtained.【总页数】5页(P24-28)【作者】王盼盼;彭夕洋;易珍;江志刚;邓云;吴秀山;万永奇【作者单位】湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心，湖南长沙，410081【正文语种】中文【中图分类】Q75【相关文献】1.斑马鱼Nfatc3基因多克隆抗体的制备及检测 [J], 冯德峰;屈永贵;袁佳佳;陈发;吴秀山;李永青2.斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测 [J], 盛力翔;冯德峰;罗世锋;吴秀山;戴国;莫小阳3.斑马鱼基因ATF4多克隆抗体的制备 [J], 李发祥;杨荣;陈婷芳;唐雄卓;赵碧峰;江志钢;张义;李永青;吴秀山4.斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体的制备及检测 [J], 刘华友;朱玲;李帆;王琨;江志钢;吴秀山;李永青5.斑马鱼ANF基因的克隆及多克隆抗体的制备 [J], 李竞超;吴坚;梁艳;莫小阳;吴秀山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

斑马鱼原肌球蛋白基因克隆表达及免疫学鉴定

斑马鱼原肌球蛋白基因克隆表达及免疫学鉴定李荔;陈樱麟;闫浩;刘志刚【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2013(32)1【摘要】克隆斑马鱼原肌球蛋白的基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行鉴定.提取斑马鱼总RNA,采用RT-PCR克隆斑马鱼原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增斑马鱼原肌球蛋白基因的完整开放阅读框,连入载体pET-28a,在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中通过IPTG诱导得到重组斑马鱼原肌球蛋白.重组蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测.获得斑马鱼原肌球蛋白基因,Western-blot结果显示重组蛋白具有良好的免疫活性.本研究成功克隆并表达了斑马鱼原肌球蛋白基因,经免疫学鉴定发现其具有过敏原性.【总页数】5页(P26-30)【作者】李荔;陈樱麟;闫浩;刘志刚【作者单位】深圳大学过敏反应与免疫学研究所,广东深圳 518060;深圳大学过敏反应与免疫学研究所,广东深圳 518060;深圳大学过敏反应与免疫学研究所,广东深圳 518060;深圳大学过敏反应与免疫学研究所,广东深圳 518060【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 [J], 徐秋芳;陈晴晴;倪海平;李硕;张金凤;周益军2.罗氏沼虾原肌球蛋白基因的克隆表达及变应原性鉴定 [J], 罗伟芝;符春荣;邬玉兰;陈献雄;刘志刚;黄海珍3.红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫学鉴定 [J], 吴凯威;刘志刚4.牡蛎主要过敏原原肌球蛋白的重组表达及鉴定 [J], 张江涛;李国明;方磊;刘艳;崔欣悦;鲁军5.斑马鱼ftr56基因克隆表达及功能研究 [J], 邝鸣; 刘皖蒙; 姚健; 霍诗天; 刘学芹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

斑马鱼促性腺激素释放激素基因的克隆与表达

斑马鱼促性腺激素释放激素基因的克隆与表达谢保胜;段瑞君;藤原滋树【期刊名称】《青海医学院学报》【年(卷),期】2009(030)001【摘要】目的克隆斑马鱼促性腺激素释放激素(GnRH)基因,构建重组质粒pQE30-GnRH并获得表达蛋白.方法从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT-PCR方法获得斑马鱼GnRH cDNA.将该cDNA插入质粒pQE30中,并使其在大肠杆菌RB791中表达.经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况.结果斑马鱼GnRH cDNA长为207bp,编码的GnRH前体为69个氨基酸残基.与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水鲤科鱼类的氨基酸序列同源性比较,分别为74.4%,69.8%,73.3% 和 73.3%.电泳结果显示一新的分子量约为14.4 kDa的特异蛋白带.结论本研究所克隆的斑马鱼GnRH基因属于GnRH-Ⅱ.构建斑马鱼GnRH 原核表达质粒不仅获得大量的GnRH蛋白,还可对该蛋白做进一步分离纯化以及生物活性方面的研究.【总页数】5页(P9-13)【作者】谢保胜;段瑞君;藤原滋树【作者单位】青海大学生物科学系;青海大学生物科学系;日本高知大学理学部【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与表达 [J], 丁炜东;曹丽萍;李建林;吴婷婷2.斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆与表达 [J], 杜长青;牛荣丽;张培军;林秀坤3.牙鲆促性腺激素释放激素基因cGnRH-II和sbGnRH的克隆与表达特征分析 [J], 房保海;孙修勤;曲凌云;张之文4.斑马鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与序列分析 [J], 谢保胜;段瑞君5.斑马鱼G蛋白偶联受体编码基因(DrGPCR)的克隆与表达分析 [J], 董超华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。