海洋生物功能基因表达与分析实验

海洋生物功能基因表达与分析实验
实验一：海洋生物功能基因生物信息学分析
实验二：蛋白质Ni柱亲和层析
实验三：活性蛋白质测定与分析
实验四：SDS-PAGE检测蛋白纯度
实验一·海洋生物功能基因生物信息学分析
生物信息学分析就是利用在线软件对测序后已知的核苷酸或氨基酸序列进行分析，从而预测蛋白质的部分理化性质，结构与功能等。

主要实验方法：
1.基因全长序列分析：对于给定的DNA序列进行分子生物学分析。

通过NCBI 的Open Reading Frame Finder（/gorf/gorf.html）分析可知：给定的基因序列全长，及能编码氨基酸数量。

2.蛋白理化性质预测与分析：根据在线服务系统ExPASy中的ProtParam工具
Proscale工具(/ cgi-bin/protscale/protscale.pl)进一步对目的基因蛋白氨基酸序列的基本理化性质进行综合预测分析，结果比较可靠。

预测的理化性质有：蛋白分子量(Molecular weight)、理论等电点(Theoretical pI)、氨基酸组成(Amino acid composition)、电荷分布(negatively charged residues, positively charged residues)、原子构成(Atomic composition )、消光系数( Extinction coefficients )、半衰期(Estimated half-life)、不稳定系数(Instability index)，脂肪系数(Aliphatic index)、总平均疏水性(Grand average of hydropathicity, GRA VY )等。

3.磷酸化位点预测与分析：磷酸化和去磷酸化是细胞内信号传导的重要方式，应用在线服务NetPhos 2.0 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对目的基因的磷酸化位点进行预测与分析，对蛋白序列中的Ser、Thr和Tyr三种氨基酸残基可能成为的磷酸化位点作出预测。

4.蛋白卷曲螺旋结构的预测与分析：利用在线服务Coils分析工具(http://embnet. vital-it.ch/software/COILS_form.html)对目的基因蛋白序列形成卷曲螺旋的倾向性进行预测，以window=14，21和28为实验参数，按照几率>50%就可形成螺旋的规则，比较不同权重情况下的分析结果。

5.蛋白质二级结构预测与分析：蛋白质二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素。

应用JPred
（/jpred/）和
6.蛋白的跨膜结构预测与分析：跨膜结构域的预测和分析，对正确认识和理解蛋白质的功能、结构、分类、方位及细胞中作用部位均有着重要的指示意义。

应用在线服务TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Tmpred
(/software/TMPRED_form.html)对目的基因蛋白的跨膜
结构进行预测及分析。

红色表示跨膜区，蓝色即在膜内部，相反紫色细线表示在膜外的概率。

7.信号肽的预测和分析：预测和分析信号肽有助于蛋白质功能域的划分和蛋白质
细胞定位。

应用在线服务
对目的基因的信号肽进行预测与分析。

8.亚细胞定位预测与分析：亚细胞定位与蛋白质的功能存在着非常重要的联系，可以通过氨基酸组成进行亚细胞定位的预测。

应用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/)软件对目的基因蛋白的亚细胞内定位进行预测。

[这个网站需要翻墙才能登陆，可以试一下，不一定能打开。

9.三维结构的预测和分析：蛋白质依赖于其三维结构的形状和关键功能域的性质来实行生物功能。

利用Phyre在线工具
(/phyre2/html/page.cgi?id=index)对目的基因氨基酸序列进行蛋白质三维结构预测。

10.保守结构域与功能域分析：根据NCBI-CDS(/cdd/)和Prosite (/scanprosite/)对目的基因蛋白的保守结构域与功能域进行在线分析。

11.同源蛋白质家族比较分析：应用InterProScan程序搜索位于EBI的InterPro数据库（/interpro/search/sequence-search）进行同源蛋白质分析比较。

12.分子系统发育预测与分析：
(1)首先对目的基因的氨基酸序列进行BLAST分析。

应用NCBI的BLAST在线工具（/Blast.cgi）进行在线BLAST分析，检索并选取若干与给定目的基因相似度较高的基因进行下载，尽量不要选带SP.（未知菌）的菌株基因，选择typical菌株的基因，并且选取时主要不要选择染色体基因。

下载时选定Fasta 格式，得到txt文件，打开该文件，并进行编辑，主要是菌株及基因名称及genbank编号等。

(2)打开BioEdit软件，并打开下载好的txt文件。

选择Accessory Application，选择ClustalW
Multiple alignment，及Run ClustalW，保存文件untitled.fas。

(3)打开MEGA软件，打开untitled.fas文件，确认进行分析。

选择Nucleotide Sequences，并确认，不进行核苷酸序列的蛋白质编码。

选择phylogeny，选择第二个Construct/Test Neighbor-Joining Tree即可。

之后进行保存，并可用AI等软件进行修饰。

13.基因功能的预测与分析：应用在线软件InterPro (/ interpro/search/)对目的蛋白参与的生物过程、分子功能进行预测与分析。

注意事项：
1.部分网站可能会出现打不开的情况，搜索网站前面的英文单词（如“基因功能的预测与分析：应用在线软件InterPro (/ interpro/search/)对目的蛋白参与的生物过程、分子功能进行预测与分析。

”中如果网站打不开，就搜索InterPro）找到相关网站，也可达到同样的效果。

2.以上在线分析网站及软件大部分需要Fasta格式，Fasta格式的序列获取方法我单独建了个文档，在这里就不详细阐述。

实验二·蛋白质Ni柱亲和层析
一．实验目的：利用Ni柱亲和层析，对蛋白质进行分离、纯化。

二．实验原理：通常为了方便纯化异源表达的目的蛋白质，会在目的基因末端添加一段组氨酸序列标签。

由于组氨酸内含有的咪唑侧链可与镍、锌等金属离子亲和结合，因此目的蛋白可在中性或弱碱性条件下结合于树脂上，并在低pH下被咪唑竞争洗脱。

选择组氨酸作为蛋白标签主要是因为：（1）该标签分子量很小，只有6个组氨酸，通常不需要去除；（2）在高浓度尿素和胍的变性纯化条件下仍能保持较好的结合力；（3）无免疫原性。

因而利用Ni 柱可以对目的蛋白进行有效分离、纯化。

三．实验材料：
1.培养基：LB培养基（1000 mL）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，固体培养基需加15 g琼脂，5 N NaOH调pH至7.0，121 ºC湿热灭菌20 min。

包括LB液体摇瓶培养基以及LB液体试管培养基。

2.相关溶液配制：
①0.1 g/mL Kana的配制：0.1 g Kana粉末+ 1 mL灭菌ddH2O，混匀于-20 ºC保存备用；
②IPTG的配制：0.4 g IPTG粉末+ 1 mL灭菌ddH2O，混匀于-20 ºC保存备用；
③高缓冲液：6.06 g Tris，0.4 g SDS，90 mL灭菌ddH2O，用4 N HCl调pH为
6.8，定容至100 mL，混匀于4 ºC保存备用；
④50 mM 磷酸缓冲液pH 6.8：称取NaH2PO4• 2H2O 10.86105g，NaH2PO4• 2H2O
6.08595g，用水定容至1L。

⑤Binding/wash buffer（10 mM咪唑）：14.625 g NaCl，3.5814 g Na2HPO4，0.34 g 咪唑，溶于450 mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至500 mL，混匀于4 ºC 保存备用。

⑥Elution buffer （40 mM咪唑）：7.3125 g NaCl，1.7907 g Na2HPO4，0.68 g咪唑，溶于200 mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至250 mL，混匀于4 ºC 保存备用。

⑦Elution buffer （100 mM咪唑）：7.3125 g NaCl，1.7907 g Na2HPO4，1.7 g咪唑，溶于200 mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至250 mL，混匀于4 ºC
保存备用
⑧Elution buffer （250 mM咪唑）：14.625 g NaCl，3.5814 g Na2HPO4，8.5 g咪唑，溶于450 mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至500 mL，混匀于4 ºC 保存备用。

⑨PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调节pH至
7.2，定容至1L。

四．试验方法：
1.发酵实验：（1）将验证成功的含阳性重组质粒pET-GK的BL21接种于5 mL
含5 μL的0.1 g/mL Kana的LB 液体培养基中，接种3管，摇床37 ºC、200 rpm 培养12 h；（2）取过夜培养后的菌液100μl在含有0.1 g/mL Kana的LB液体药瓶培养基中，37 ºC、200rpm培养到OD（λ=595 nm）值为0.4-0.6时，加入终浓度为1.0 mM 的IPTG（60 µL）诱导表达6 h；（3）对诱导表达后的菌液用高速冷冻离心机4 ºC7500 rpm离心20 min，得菌体沉淀，再用灭菌的双蒸水漂洗2-3次，4 ºC7500 rpm离心20 min最后收集菌体沉淀；（4）将所得菌体沉淀转移至预冷的研钵中，加入2 mL 50 mM磷酸缓冲液（pH 7.8）、400 µL的高缓冲液和少许的SiO2在冰浴下进行研磨直至菌体成为匀浆液，大约25 min（为保证研磨效果，最好延长研磨时间至35min），研磨结束后，收集研磨所得的匀浆，再用 1 mL 的高缓冲液清洗研钵底部残留的菌体，一并转入5 mL的离心管中；（5）将离心管用封口膜封好，用超声波清洗机超声裂解破碎细胞（超声波裂解时，需于水槽内放置冰袋），破2 min停1 min，重复5-6次，超声裂解后，于4 ºC，12000 rpm 离心10 min，收集上清液即为所得粗蛋白。

2.蛋白纯化：（1）加柱子：取3 mL的Ni-NTA树脂填料装入层析柱内，让储存缓冲液通过重力流从脂中慢慢流出，加45 mL的0.5 M NaOH洗脱，同时控制流速为1 mL/min，再加30 mL的PBS洗脱；（2）柱平衡和上样：加6 mL的Binding/wash buffer洗脱平衡柱子，然后将粗蛋白溶液和Binding/wash buffer等体积混合加入介质内，流尽后在用Binding/wash buffer进行洗脱至平衡，约3 h；（3）洗脱：分别用40、100和250 mM的Elution buffer洗涤树脂，从脂内洗脱蛋白，并分别收集各梯度缓冲液洗脱液，每1 min更替一个收集管，同时测定各管内洗脱液在λ=595 nm的吸光度，以检测蛋白洗脱情况，直至洗脱吸光值为零
时，进行更高梯度的缓冲液逐次洗脱；（4）检测：对收集管里测得吸光值不为零的进行SDS-PAGE电泳检测是否为单一条带，将检测为单一条带的于4 ºC保存以备后续试验使用。

实验流程、药品的配制方面按照上面的过程走下来就可以了。

蛋白质Ni-NTA纯化柱子的重生
1.用10倍树脂体积的洗脱液（stripping buffer）（50mM磷酸钠；30mM NaCl；
100Mm EDTA；pH调8.0），洗涤，流尽。

EDTA的目的是为了洗掉与柱料结合的Ni离子，方便下一步的Ni填装
2.用20倍体积的双蒸水洗涤，流尽
3.用2倍柱体积的100mM NiSO4(去离子水配制)流尽，进行离子填装（配方：
NiSO4 5.258g，200ml）
4.用10倍柱体积的灭菌双蒸水进行洗涤，再用10倍树脂体积的1X PBS重新
平衡树脂，即可使用
5.洗脱液配方（400ml）：
Na3PO37.6.24g ;NaCl 7.01g ; EDTA: 14.89g
洗柱子（当柱子受到污染时，用于除去污物如脂蛋白、沉淀的蛋白等）
1.15倍体积的0.5M NaOH（控制在30min内流完）
2.10倍体积的1X PBS 流完
3.柱子保存：20%~30% 乙醇或者10~100mM NaOH中，4℃
重生通常是不必要的，如果发现柱子受到污染，洗柱子即可恢复其性能。

若是恢复不好，柱子可进行重生操作。

一般情况下，过完一次柱子后，都会进行洗柱子的操作。

为防止其亲和力下降而导致纯化效率降低，一般柱子用过3次后重生一次。

实验三·活性蛋白质测定与分析
一．实验目的：利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法对纯化获得的蛋白进行酶活测定。

二．实验原理：葡萄糖在葡萄糖激酶作用下，磷酸化成为六磷酸葡萄糖，六磷酸葡萄糖在六磷酸葡萄糖脱氢酶作用下脱氢，则NADP+被还原生成NADPH，其产量与样品中目的蛋白GK活性呈正相关。

NADPH在340 nm处有一吸收峰，故通过吸光度的增加可间接反应酶活性。

三．实验材料：
Tris、HCl、NADP+、ATP 、MgCl2、G6PD、D-葡萄糖
四．试验方法
反应体系200 µL，其中含Tris-HCl 100 mmol/L，NADP+ 0.2 mmol/L，ATP 5 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，G6PD 0.2 U，pH 7.5，每次测定设葡萄糖终浓度为100 mmol/L。

待反应体系充分混匀后，30 ºC水浴5 min，再加入纯化蛋白GK 25 μL进行反应，在340 nm处读取吸光度的变化，每30 s记录1次，连续记录5 min，测出每分钟光密度的增加值，根据以下公式计算酶活性：酶活性（U/mL）=吸光度变化（/min）/6.22（NADPH吸光系数）。

实验四·SDS-PAGE检测蛋白纯度
一．实验目的：利用SDS-PAGE电泳技术检测Ni柱亲和层析纯化获得的目的蛋白的纯度。

二．实验原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。

使在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，从而达到检测蛋白的目的。

三．实验材料：
1.低缓冲液：18.78 g Tris，0.4 g SDS，90 mL 灭菌ddH2O，用4 N HCl调pH为8.8，定容至100 mL，混匀于4 ºC保存备用。

2.储备液（IEF）：0.8 g Bis，14.2 g Acr，用灭菌ddH2O定容至50 mL，混匀于棕色试剂瓶4 ºC保存备用。

3.10%过硫酸铵：0.1 g过硫酸铵固体粉末，1 mL灭菌ddH2O混匀即可（现用现配）。

4.电极缓冲液（5×）：15 g Tris，72 g甘氨酸，5 g SDS，定容至1000 mL，混匀于
4 ºC保存备用。

5.10%SDS：0.5 g SDS粉末+ 5 mL ddH2O，混匀常温保存备用。

6.0.1%溴酚蓝：5 mg溴酚蓝粉末加入5 mL ddH2O，混匀于4 ºC保存备用。

7.2×蛋白上样缓冲液：高缓冲液2 mL，甘油2 mL，10%SDS 4 mL，0.1%溴酚蓝，ddH2O 2 mL，β-巯基乙醇1 mL，混匀于4 ºC保存备用。

8.染色液G250：100 mg考马斯亮蓝，50 mL 95%无水乙醇，120 mL 85%浓磷酸，用灭菌ddH2O定容至1000 mL，混匀于常温避光保存备用。

9.脱色液：75 mL冰乙酸，875 mL灭菌ddH2O，50 mL甲醇混匀常温保存备用。

（甲醇对身体有害，通常也可采用乙醇250ml，冰乙酸75ml，用水定容至1L。

）四．试验方法
（1）制备凝胶板：按表1配制10 mL 10%分离胶，混匀后用枪将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8 cm高，再沿长玻璃板板壁缓慢注入ddH2O约1 cm 高，以进行水封。

约30 min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。

倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分；再按表2
配制4 mL 3%浓缩胶，混匀后用100 μL的枪将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5 cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。

约30 min后凝胶聚合，再放置20-30 min。

待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将稀释好的电极缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5 cm以上，即可准备加样。

表1 10%分离胶表2 3%浓缩胶
试剂体积试剂体积低缓冲溶液 2.5 mL 高缓冲溶液 1.0 mL
IEF储备液 4.2 mL IEF储备液0.64 mL
ddH2O 3.25 mL ddH2O 2.3 mL 10%过硫酸铵50 µL 10%过硫酸铵50 µL TEMED 5 µL TEMED 10 µL
总计10 mL 总计 4 mL
（2）样品准备：25 µL 2×上样缓冲液+50 µL pET-28a（+）蛋白；25 µL 2×上样缓冲液+50 µL纯化后的目的蛋白，分别于1.5 mL离心管中，封口膜封口，和20µL 的蛋白maker同时于100 ºC水中煮沸5 min。

（3）上样：用100 µL枪小心地将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，并将电泳槽置于冰浴中即可开始电泳。

（4）电泳：电泳时将电泳仪开关打开，开始时将电压调至70 V，待样品进入分离胶时，将电压调至80 V。

当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。

拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

将染色液倒入培养皿中，放置在TS型脱色转移万向摇床上震荡染色1 h左右，用脱色液脱色3次每次15 min，再用蒸馏水漂洗数次，直到蛋白条带清晰可见。

步骤：
1.仪器装配：先戴手套用双蒸水冲洗玻璃板，然后用纸擦干。

装配时先在桌面
上将2块玻璃压齐，再将两块楔子平压下去，将2侧固定桩调到1.5
2.检漏: 加水在2板间，（一枪不加完再吸，以免产生气泡），静置5~6分钟，
看液面是否变化，5~6分钟后倒掉水，并用滤纸条吸干
3.加入分离胶后，加水液封，静置50~60分钟，等分离胶完全凝固后，倒掉水
层，用滤纸吸干，不要有气泡。

然后加浓缩胶，加完后迅速插入梳子，静置40~60min，注意梳子一定不要插反
4.跑胶：胶凝固后，拔出梳子，用针拨正胶孔，去掉气泡，即可上样。

制胶注意事项：
1.先刷玻璃板，一定要戴手套，因为手上有蛋白，会干扰实验结果
2.10%过硫酸铵溶液配制时，现用现配。

200~300ul即可。

配时先称0.02g左右
的过硫酸铵颗粒，然后按比例加入相应的双蒸水。

TEMED一定要最后加，加完快速搅拌，将胶加至标线处（贴着玻璃板壁注射，不要有气泡），加完后用水液封。

3.固定时一定对称旋至1.5，压板时双手对称压，以防将玻璃板压碎。