咪喹莫特纳米结构脂质载体的可控制备及表征

2006年 8 月 The Chinese Journal of Process Engineering Aug. 2006收稿日期：2005−09−23，修回日期：2006−01−06基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：60171005; 60371027)；江苏省计划委员会资助项目(编号：7607038009)作者简介：周华锋(1980−)，男，江苏省泰兴市人，硕士研究生，研究方向：药学纳米技术；顾宁，通讯联系人，E-mail: guning@.咪喹莫特纳米结构脂质载体的可控制备及表征周华锋1,2, 马全红1,2, 丁 艺2, 夏 强1， 旷英姿2， 郝晓帧2， 顾 宁1(1. 东南大学生物电子学国家重点实验室，江苏省生物材料与器件高技术重点实验室；2. 东南大学化学化工系，江苏 南京 210096)摘 要：采用高压均质法制备咪喹莫特纳米结构脂质载体(IMQD −NLC)，分别考察表面活性剂、高压均质操作参数及药物加入量对IMQD −NLC 制备的影响，并对其形貌、物相、表面Zeta 电位及体外释放特性等进行了表征. 结果表明，选取S-40和Span-20复配作为表面活性剂，随着S-40含量的增大，IMQD −NLC 的平均粒径和Zeta 电位的绝对值逐渐减小，而PI 值呈现增大趋势；高的高压均质循环次数制备的IMQD −NLC 平均粒径和PI 值均比较低；药量增大，粒子平均粒径和PI 值增大，而Zeta 电位并没有发生明显变化；平均包封率为88.3%；IMQD −NLC 呈无定型状态；IMQD −NLC 在pH 1的释放介质中呈现先突释后缓释，而在pH 5.5的释放介质中呈现缓慢释放. 关键词：咪喹莫特；纳米结构脂质载体；缓释中图分类号：R943.4 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2006)04−0598−051 前 言固体脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticle, SLN)是一种由固体脂质材料经过高温加工后冷却而制得的一种新型药物给药系统，但存储过程中出现由于载体材料结晶或晶型的转变引起的药物泄漏等缺点. 而纳米结构脂质载体(Nanostructured Lipid Carriers, NLC)是在固体脂质纳米粒的基础上发展起来的新一代药物给药系统，采用两种或两种以上的固−液(或固−固)脂质材料经过高温加热后冷却而制得[1−5]. 与传统的胶体载药系统相比，NLC 不仅具有SLN 的优良生物相容性、药物释放的可控性与靶向作用好、生物利用度高等优点，而且避免了SLN 存在的药物泄漏等缺点.咪喹莫特(Imiquimod, IMQD)属于非核苷类异环胺类药物，是一种新型的免疫调节剂，具有抗病毒、抗肿瘤活性等优点，但由于其不溶于水及一般有机溶剂[6]，制剂较困难，从而限制了其临床广泛应用. 本工作以IMQD 作为药物模型，选择生理相容的固态脂质材料单硬脂酸甘油酯(Glycerol Monostearate, GMS)及能溶解IMQD 的液体脂质材料油酸(Oleic Acid, OA)混合作为药物载体，制备了咪喹莫特纳米结构脂质载体，改善其水溶性，并对其进行了表征，为应用奠定了基础.2 实 验2.1 原料与仪器原料：咪喹莫特(99.18%，江阴永达化工有限公司赠送)，单硬脂酸甘油酯(上海试四赫维化工有限公司)，油酸(上海久意化学试剂有限公司)，硬脂酸聚烃氧(40)酯(S-40，南京威尔化工有限公司)，失水山梨醇月桂酸酯(Span −20，北京化学试剂公司)，其他试剂均为分析纯.仪器：N4-PLUS 光子相关光谱仪(Photon Correlation Spectroscopy, PCS ，美国Beckman −Coulter 公司), Zeta 电位仪(美国Beckman −Coulter 公司), JEM −2000EX 透射电镜(日本JEOL 公司)，XD-3A 型X 射线分析仪(日本Shimadzu 公司)，GYB60-10S 高压均质机(上海东华高压均质机厂)，FA25型高剪切分散乳化机(上海弗鲁克机电设备有限公司). 2.2 实验方法2.2.1 IMQD −NLC 的制备本实验采用高压均质法[3]制备咪喹莫特纳米结构脂质载体. 按处方量称取咪喹莫特、油酸、单硬脂酸甘油酯，在80℃温度下加热搅拌均匀，然后在搅拌的条件下加入相同温度的含有表面活性剂的水溶液中，用高剪切乳化机在12000 r/min 下乳化均匀制成初乳，最后将初乳通过高压均质机，高温乳液冷却至室温形成IMQD −NLC 水分散液，室温密封保存，备用. 2.2.2 IMQD −NLC 的形貌观察取适量经二次蒸馏水稀释的IMQD −NLC 水分散液滴加在覆盖有方华膜的铜网上，用 1.5%的磷钨酸溶液负染，在透射电镜下观察其形貌.2.2.3 IMQD −NLC 的Zeta 电位和平均粒径分布测定用Zeta 电位分析仪测定其Zeta 电位值，测试温度为25℃；用PCS 测定其平均粒径，测试角度为90o ，测试温度为25℃.2.2.4 药物包封率测定精密定量量取IMQD −NLC 水分散液500 μL ，加入200 μL MgSO 4溶液，使纳米粒聚集，然后在4℃, 12000 r/min 下冷冻离心，去除清液，分离出游离IMQD ，最后将所得IMQD −NLC 溶于冰醋酸，超声使药物完全溶解并定容至25 mL 容量瓶中，0.22 μm 微孔膜过滤，在320 nm 波长下测定其吸光度A ，代入IQMD 标准曲线回归方程A =0.0428C +0.0049(R 2=1)，得药物含量W 1. 不加MgSO 4溶液相同方法测得药物总含量W 2.IMQD −NLC 中药物的包封率EE(%)=(W 1/W 2)×100%，测定方法的相对标准偏差小于5%. 2.2.5 IMQD −NLC 水分散液稳定性测试取较佳条件制备的IMQD −NLC 水分散液，分成2份密封，分别置于4℃冰箱和25℃水浴中保存，分别在1, 90, 180 d 时取样测试其平均粒径变化. 2.2.6 X 射线衍射分析测试条件为Cu 靶，K α辐射，电压为40 kV ，管流30 mA ，2θ范围为10º∼70º，扫描速度为5.4º/min. 2.2.7 IMQD −NLC 的体外释放取1 mL IMQD −NLC 水分散液加入透析袋中，再加入5 mL 释放介质，封住两端口，将透析袋置于装有44 mL 释放介质的100 mL 广口瓶中，(37±0.5)℃恒温磁力搅拌，搅拌速度50 r/min ，分别于一定的时间间隔取样3 mL ，再补充3 mL 新鲜释放介质. 样本用冰醋酸定容至10 mL ，空白对照，用紫外分光光度计在320 nm 波长处测定样液A 值，代入回归方程，求出相应的药物浓度，计算药物不同时间的累积释放率.3 结果与讨论3.1 IMQD −NLC 的制备 3.1.1 表面活性剂的影响首先考察复配表面活性剂对制备IMQD −NLC 的影响，选取的表面活性剂均为药典中认可的药用乳化剂. 由于本研究制备NLC 需要经历一个O/W 的乳化过程，考虑到表面活性剂的亲油亲水平衡值(HLB 值)，所以分别选取水溶性表面活性剂S-40(HLB=17),F-68(HLB=16), Tween-20(HLB=16.7)和油溶性表面活性剂Span-20(HLB=8.6)复配，结果如表1所示.表1 不同复配表面活性剂对IMQD-NLC 的影响Table 1 Influence of different surfactants on IMQD −NLCFormation Surfactant Phenomena1 Tween-20+Span-20 Becoming adhesive and thick after several days2 F-68+Span-20 Particles sediment after 1 d3 S-40+Span-20 No variation after several days由表1可知，不同组合的表面活性剂对IMQD −NLC 制备的影响比较明显，S-40与Span-20复配表面活性剂制备的IMQD −NLC 较好. 因此，实验选取S-40/Span-20复配表面活性剂，考察S-40含量[R =(S-40)/ (S-40+Span-20)]对制备IMQD −NLC 的影响，结果如图1和表2所示.图1 S-40含量对IMQD −NLC 的平均粒径和PI 值的影响 Fig.1 Influence of content of the surfactant S-40 on the averageparticle size and PI value of IMQD −NLC表2 S −40含量对IMQD-NLC 表面Zeta 电位的影响Table 2 Influence of content of S-40 onZeta value of IMQD −NLCS-40 content in the surfactant (%) Zeta potential (mV)35 −18.30 50 −16.40 65 −10.2680 −8.80100 −5.02由图1及表2可知，当S-40含量从35%增加到100%时，IMQD −NLC 的平均粒径d 从212 nm 近似直线下降到105 nm ，其线性拟合方程为d =−156.69R +265.52, r = 0.9902，表面Zeta 电位绝对值从18.3 mV 降低到5.02 mV ，而多分散性指数(Polydispersity, PI)值逐渐增大. 当S-40含量大于50%时，虽然制备的IMQD −NLC 平均粒径比较小，但其PI >0.5，并且其表面Zeta 也比较低(不利于粒子稳定). 当S-40含量小于50%时，PI 值减小，表面Zeta 电位增大(有利于粒子稳定)；与S-40含量为35%相比，S-40含量为50%时制备的粒子具有较小的平均粒径. 与复配表面活性剂相比，单一表面活性剂S-40制备的IMQD −NLC 平均粒径虽小，但其PI 高达0.73，0.40.50.60.750100150200A v e r a g e p a r t i c l e s i z e (n m )S-40 content (%)35 50 65 80 100P I并且Zeta电位仅为−5.02mV(不利于粒子稳定).根据S-40和Span-20的结构(图2)可知，由于羟基上的氧的电负性比较强，诱导效应使电子向羟基端偏移，导致羟基带部分负电荷(δ−). 由于Span-20羟基端羟基数比S-40羟基端羟基数多，所以Span-20羟基端带δ−比S-40带δ−多. 在NLC水分散液中由于亲油端烷烃指向脂质粒子而亲水羟基端指向水，因此NLC粒子表面带负电荷，并且随着S-40含量的增加，NLC表面Zeta 电位绝对值逐渐降低，与实验结果相吻合.S-40:Span-20:图2 S-40和Span-20的结构Fig.2 The structures of S-40 and Span-20通常带电粒子由于同种电荷之间的相互排斥而不易聚集，Zeta电位的高低可以用来预测分散体系贮存的稳定性[7]. 虽然S-40的含量为50%时的Zeta电位(−16.4 mV)不足以防止粒子间的聚集，但是由于S-40不仅是乳化剂，而且是一种空间稳定剂，具有空间位阻作用，可以阻止纳米粒间的聚集[8]. 由以上讨论可以说明复配表面活性剂制备的IMQD−NLC较单一表面活性剂好，而且S-40含量变化对IMQD−NLC的制备有显著性的影响，随着S-40含量的增加，平均粒径和Zeta电位逐渐降低，而PI值逐渐增大. 因此，以下实验选取S-40/Span-20作为复配表面活性剂，且S-40含量为50%.3.1.2 高压均质操作参数的影响选取表面活性剂S-40含量为50%，考察高压均质操作参数对制备IMQD−NLC的影响. 实验过程中发现，压力较高时产生大量的热量，从而导致整个循环体系温度升高，而压力较低时又不能制备出理想的NLC. 因此，本实验采用60 MPa的压力研究高压均质循环次数对IMQD−NLC平均粒径及PI值的影响，结果如图3所示. 随着高压均质循环次数的增加，IMQD−NLC的平均粒径趋于减小，而PI值在循环8次前逐渐减小，循环8次后几乎没有明显的变化. 循环12次既能得到平均粒径相对较小的IMQ−DNLC，又能避免由于过多的循环次数导致循环体系温度升高引起的负面影响，因此本实验中较佳高压均质次数为12次.3.1.3 药物含量的影响固定表面活性剂S-40含量为50%，高压均质压力图3 高压均质循环次数对IMQD−NLC的影响Fig.3 Effect of high pressure homogenization cycle times onIMQD−NLC为60 MPa，循环次数为12次，考察了药物含量分别为0, 0.5, 1, 1.5 mg/mL的IMQD−NLC的平均粒径、PI值及Zeta电位. 由图4可知，随着药物含量的增加，IMQD−NLC的平均粒径和PI值均逐渐增大；而表面Zeta电位测量结果没有明显变化，为(−16.48±0.13) mV.图4 药物含量对IMQD−NLC的平均粒径和PI值的影响Fig.4 The average particle size and value of PI of IMQD−NLCwith different contents of drug3.2 可控重现性实验根据以上讨论选取实验较佳制备条件：复配表面活性剂为S-40/Span-20, S-40含量50%，高压均质压力为60 MPa，循环次数12次，制备了药物含量为1 mg/mL的 IMQD−NLC样品3批，其平均粒径和PI值见表3，平均粒径和PI值变化不大，平均粒径为181 nm，平均PI为0.476，说明该法制备IMQD−NLC的重现性好.表3 三批IMQD−NLC样品的平均粒径和PI结果Table 3 Average particle size and PI with three group of IMQD−NLCFormation Average particle size (nm) PI1 1820.4232 1850.5303 1770.4760.400.450.500.550.604080120160200240280Averageparticlesize(nm)Cycle times0 2 4 8 12 16 24 32 38PI0.250.300.350.400.450.00.5 1.0 1.550100150200Averageparticlesize(nm)The mass of imquimod (μg/mL)PI3.3 形貌表征IMQD −NLC 的TEM 照片如图5所示，可以看出IMQD −NLC 呈球型，形态规整，粒径分布均匀.图5 IMQD −NLC 的电镜照片Fig.5 TEM micrograph of IMQD −NLC3.4 包封率的测定本工作尝试利用高速冷冻离心技术分离纳米粒子，但结果并不理想，纳米粒子不能很好地分离出来，这可能是由于纳米粒表面电位导致相互排斥的原故. 通常采用调节体系的表面电位至0左右，可引起粒子的自身凝聚. 因此本实验采用强电解质MgSO 4调节纳米粒的表面电位，使纳米粒聚集，然后经过低速冷冻离心，结果发现此法可以将粒子很好地分离出来，而且经过多次重复实验证明此方法对于该体系是适用可行的. 优化条件下制备的样品平均包封率为88.3%. 3.5 留样稳定性粒子的平均粒径可以作为衡量纳米结构脂质载体水分散液长期存储稳定性的指标之一. 因此，本实验将较优处方制备的IMQD −NLC 水分散液分成2份，分别置于4和25℃条件下存放，考察其贮存过程中的长期稳定性，结果发现IMQD −NLC 水分散液在4和25℃条图6 平均粒径随存储时间的变化Fig.6 Effect of conservation time on the diameter of IMQD −NLC件下贮存180 d 后没有出现粒子聚集、沉淀分层现象，保持了很好的均匀水分散体，其平均粒径变化如图6所示，说明其稳定性比较好. 3.6 XRD 表征图7为IMQD, GMS, IMQD −NLC 的XRD 图谱(常温条件下在载玻片上滴加IMQD −NLC 水分散液，自然沉积2 mm 厚的IMQD −NLC ，常温真空干燥)，可以看出IMQD 在2θ=11.3o 出现了一个强峰，GMS 分别在2θ=19.5o 和23.7o 出现了2个峰. 从IMQD −NLC 的XRD 峰形可以看出IMQD 的强峰完全消失，GMS 的2θ=23.7o 峰消失，IMQD −NLC 主要是无定型结构.图7 IMQD −NLC 的XRD 图 Fig.7 XRD patterns of IMQD −NLC3.7 体外释放采用动态透析袋技术[9]，分别以pH 为1和5.5的磷酸缓冲液作为释放介质，初步考察IMQD −NLC 体外释放规律，图8为药量1 mg/mL 的IMQD −NLC 的体外释放曲线. 由图可知，在pH 1的释放介质中IQMD 在前2 h 迅速释放，累积释放量高达76.5%. 随后纳米结构脂质载体中的药物处于持续缓慢释放，12 h 后药物累积释放量达80.3%. 而在pH 5.5的释放介质中药物一直处于持续缓慢释放期，12 h 后药物累积释放量只有40.5%，图8 IMQD −NLC 体外释放曲线Fig.8 Drug release profiles of imiquimod from IMQD −SLN in vitro50100150200 4 25Temperature (℃)P a r t i c l e s i z e (n m )Conservation time (d)1 90 180102030405060700500010000IMQD 2θ (o )10002000GMS I n t e n s i t y (C P S )05001000IMQD-NLC2468101214161820222420406080A c c u m u l a t i v e a m o u n t (%)Time (h)说明不同pH值的释放介质对IMQD−NLC的释放速率有一定的影响，可能是由于药物与H+形成⎯NH3+，所以pH值越小，H+浓度越高，药物溶解速度越快. 药物体外释放突释可能是由于这部分药物主要负载在纳米结构脂质载体的外壳或者表面，高溶解速度和纳米结构脂质载体巨大的比表面能导致这部分药物在释放介质中很快被释放出来，随后被负载在纳米结构脂质载体骨架中的药物通过扩散的方式相对缓慢地释放出来[10]. 这种现象可用于药物制剂设计，为给药方式提供一定的依据. 通常药物制剂给药时需要一个首剂量，以达到最佳疗效，突释部分的药物可作为首剂量给药，缓释部分的药物可用来维持其药物浓度，从而减少给药次数，提高治疗效果.4 结 论采用高压均质法制备IMQD−NLC，通过表面活性剂复配及高压均质操作参数的调控来控制其平均粒径大小，较佳的制备条件为：复配表面活性剂S-40/Span-20, S-40含量为50%，高压均质压力60 MPa，循环次数12次. 较佳条件下制备的药量1mg/mL的IMQD−NLC平均粒径为181 nm，PI值为0.476，平均包封率为88.3%，呈球形，形态规整，长期贮存稳定性好，XRD结果表明呈无定型状态，体外释放表明其具有一定的缓释效果. 参考文献：[1] Radtke M, Souto E B, Muller R H. 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Department of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, Nanjing, Jiangsu 210096, China)Abstact: Imiquimod-loaded nanostuctured lipid carriers (IMQD−NLC) were prepared by high pressure homogenization method. The influences of surfactant, high pressure homogenization parameter and capacity loading on the preparation of IMQD−NLC were explored. Additionally, its morphology, crystalline phase, Zeta potential and release in vitro were characterized. The results show that there was a trend toward increasing the particle size of IMQD−NLC and decreasing the absolute value of Zeta potential with increasing the content of S-40 in the combined surfactant of S-40 and Span-20. Both the particle size and PI value were lower with the many cycle times, while ascending with increasing the content loading. IMQD−NLC, characterized by XRD, was amorphous. It was confirmed that burst release occurred followed by a sustaining release at pH 1 and a sustaining release at pH 5.5 in vitro for IMQD−NLC. Consequently the preparation of IMQD−NLC can be controlled by altering the conditions of preparation to realize sustained release effect.Key words: imiquimod; nanostructured lipid carriers; sustained release。