PCR,不只是温度循环-PPT文档资料
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pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
PCR三个循环过程
PCR三个循环过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增DNA分子的技术，它能够在短时间内迅速产生大量目标DNA片段。
PCR的核心是通过三个循环过程，不断地复制和扩增目标DNA片段。
本文将对PCR的三个循环过程进行介绍。
第一循环：变性第一循环是PCR的起始阶段，主要目的是将DNA双链解开，得到单链DNA。
在该阶段中，PCR反应液中的DNA模板被加热至94-98摄氏度的高温，使得DNA双链断裂。
此时，DNA中的氢键被破坏，双链分离成两条单链。
第二循环：退火在第一循环后，PCR反应体系的温度被快速降低至50-65摄氏度的退火温度。
在这个温度下，引物（引物是两段DNA分子，在PCR反应中作为DNA复制的起始点）会与目标DNA片段的两个末端互相结合，形成DNA引物与目标DNA片段的复合物。
此外，PCR反应中的缓冲液中还含有DNA聚合酶，它能够在适当的温度下，将引物与DNA复合物之间的间隙填充。
这个阶段的目标是确保引物与目标DNA片段的结合以及引物与DNA聚合酶的结合。
第三循环：延伸在第二循环之后，PCR反应液的温度被升高至72摄氏度，这是DNA聚合酶的最佳工作温度。
在这个阶段，DNA聚合酶会利用引物与目标DNA片段的复合物作为模板，开始合成新的DNA链。
该阶段也被称为延伸阶段。
DNA聚合酶通过在模板DNA链上添加适配器，用游离的核苷酸作为原料，逐渐合成新的DNA链。
此过程串联进行，每次延伸阶段完成后，目标DNA片段的数量就会成倍增加。
这个过程将重复进行，直到达到所需的DNA复制数量。
结论PCR三个循环过程的顺序为变性、退火和延伸。
通过精确控制每个循环的温度和时间，PCR能够快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在生物学、医学等领域具有广泛的应用，例如基因测序、疾病诊断以及法医学鉴定等。
通过深入理解PCR三个循环过程，我们可以更好地利用这一技术的优势，为科学研究和医学发展做出贡献。
PCR技术介绍精品课件(一)
PCR技术介绍精品课件(一)PCR技术介绍精品课件——掌握基因分子生物学核心技术的利器PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种非常重要的基因分子生物学核心技术，在疾病检测、基因工程、药物研发、环境监测等方面具有广泛的应用。
PCR技术介绍的精品课件是掌握该技术的有效工具。
一、PCR技术实现的原理PCR技术是利用DNA聚合酶作为酶催化剂，最小量的DNA模板进行体外扩增，使其在几个小时内扩增成1000万甚至10亿份以上，实现DNA分子的大规模扩增和检测。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火、延伸。
变性是使双链DNA变成单链DNA，退火是让引物与目标DNA序列的特定区域结合，从而制造重复扩增模板；延伸是将DNA聚合酶介导的dNTP延伸至3'-OH端，最终形成双链DNA。
PCR反应可以进行20-40次的循环，以成倍地扩增目标DNA。
二、PCR技术介绍的内容1. PCR技术的基本原理该部分对PCR技术的原理进行详细阐述，包括PCR反应的三个步骤、PCR反应体系的组成、PCR反应不同温度时，DNA的状态变化。
同时，应用画图软件进行动态模拟，使学生直观地感受PCR反应的过程。
2. PCR技术中引物的设计和合成方法引物是PCR反应中的重要组成部分，正确的引物设计对PCR反应结果的准确性有很大影响。
该部分将介绍引物的设计原则和方法，如引物长度的选择、GC含量的控制、引物序列的互补性等等，并展示引物合成的实验过程。
3. PCR技术的应用该部分主要介绍PCR技术在不同领域的应用，如遗传病的诊断、基因工程、药物研发、环境监测等，同时以实际案例为例进行深入探讨。
三、课件特色和优势1. 直观易懂该精品课件采用了动态模拟的方式，并借助图片、表格、视频等元素，使学生直观地感受PCR技术的核心原理和应用。
2. 实践操作该精品课件不仅介绍PCR技术的原理和应用，更是通过实验演示的方式，精准地展示样品制备、PCR反应、基因分析等关键步骤。
PCR详细ppt课件
PCR引物设计
引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如primer premier5、
Internet免费引物设计网站有primer 3，Primerfinder等。
引物设计有以下几个原则：
（1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过
70％的同源性或连续8个的碱基互补，减少非特异产物； （2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在5’端额外
引物设计软件primer premier 5.0的使用
可通过两个方法将序列输入软件中
打开原有的序列文件
在表中粘贴序列
选择序列文 件所在位置
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮
引物设计界面
对正向和反向引物进行编辑
正向和 反向引 物的互 换 正向和反向 引物的信息 正向和反向 引物的评价
用键盘输入了5个碱基
改动后引物的信息
引物的信息
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μ M之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异，但浓度过低，不足 以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高 特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合， DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可 造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一 般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一 般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度 Tm(melting temperature)低5℃，可按公式 进行计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。
PCR技术简介-PPT课件
2 ul
4 ul 2 ul 0.4ul 0.4ul 0.4ul 3.8ul 1 ul 1 ul 5 ul
RT-PCR反应体系
两步法RT-PCR
Components
Volume(µ l)
Components
RNA 5xR.T.buffer dNTPs(10mmol/L)
Primer Rnasin(50U/µ l) AMV-RT((10U/µ l)
目的基因的克隆 基因的体外突变 生成大量DNA以进行序列测定 特异基因表达量分析
PCR反应体系
20ul；25ul；50ul
10× PCR Buffer Mg2+ dNTPs 引物1 引物2 模板 Taq酶 ddH2O
浓度
1.5mmol/L 200umol/L
10pmol 10pmol 0.1～2ug
PCR实验准备--仪器、耗材
PCR仪 移液器 吸头 200ul PCR管 反应程序
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系（通 常4 l/50 l ） Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、 PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特 异性
PCR实验准备—试剂
PCR技术详解ppt课件
• 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间 的非特异性结合，提高PCR反应的特异性
28
③ 延伸温度与时间： • 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 • 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
22
低浓度引物
高浓度引物
23
3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多 重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的 存在或缺失。
引物
电 泳
24
4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量 功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一 轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓 度
3
• 1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人 发明了聚合酶链反应（PCR） • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错，未能推广 • 1988 年 ， Saiki 等 人 从 嗜 热 杆 菌 (thermus aquaticus) 中 提 出 TaqDNA 聚 合 酶 ， 使 得 PCR技术得以广泛应用 • 1993 年， Mullis 等因此项技术获诺贝尔化 学奖
15
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
PCR及相关技术PPT课件
DNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果 的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量；
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
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9
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
200 150
2
100
100
3
50
1
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3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
2020/7/28
18
2020/7/28
6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
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3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
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掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
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pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
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6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
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PCR仪
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（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
PCR原理 ppt课件
医学课件
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• 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一 个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角， 下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一 侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的 电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替 地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其 泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位， 使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢， 从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。
（1min）
循环3
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引
物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反
应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃
延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
产物的数量医满学课足件 实验需求为止。
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Reaction Condition for a Typical PCR Assay
Parameter Concentration
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μM(each one)
Thermus aquaticus strain YT1 94 kd 72--80℃
150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle
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2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
TaqMan法
工作原理
19
命
每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
Taqman法
优缺点
20
命
优点
对目标序列的高特异性-----阴性结果确定 设计相对简单------与目 标序列某一区域互补 重复性比较好
8、蝎形引物（Scorpion primer）：荧光标记引物 9、Amplifluor：荧光标记引物
2019/3/3
14 实时荧光定量PCR 方法 1 －SYBR Green 法(EVA Green)
用
科
技
关
爱
生
命
Excites at 497 nm and emits at 520 nm.
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
15
命
SYBR Green 染料工作原理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
• SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 • 变性时，DNA双链分开，无荧光 • 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发 荧光，在此阶段采集荧光信号。
荧光分子的性质(激发和 发射波长、强度、寿命、 偏振等)可随所处环境的 性质，如极性、折射率、 黏度等改变而灵敏地改变。
12
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
13
命
QPCR用什么荧光分子，怎么用？
非特异性荧光染料：
1、 SYBR Green
特异性荧光探针：
2、TaqMan（Taqman-MGB)
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
12
命
荧光分子简介
荧光是一种光致冷发光现象。荧光分子经某种波长的入射光（
通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立 即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在可 见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失 。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
实时荧光定量PCR方法2－TaqMan-MGB法
TaqMan---水解型杂交探针
18
命
荧光素
非荧光淬 灭基团
MGB (Minor Groove Binder) 将探针的Tm值提高 10℃
与目标序列互补
因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低 了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。 TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
PCR，不只是温度循环
用 科 技 关 爱 生 命
杭州博日科技有限公司 肖强海
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
1
命
PCR基本原理
变性
延伸
退火
N个循环
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
2
命
PCR的基本成分
模板DNA
特异性引物 热稳定DNA聚合酶
脱氧核苷三磷酸（dNTP）
二价阳离子（Mg2+/Mn2+） 缓冲液（Tris-Cl）
吸头 操作手法
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2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
9
命
温度及时间控制 ——滞后效应
导热膜
反应试剂 耗材 金属底座
温度探头
半导体
散热器
9
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
10
命
面对困难如何调整优化
二级结构 GC含量 模板 序列 试剂 让 厂 商 去 优 化 吧
完整度 抑制剂
二聚体 错配
模板
人
仪器
引物 耗材
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
17
命
实时荧光定量PCR方法2－TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互 补 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与 Q分开，发荧光
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
SYBR Green 法
优缺点
16
命
优 点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA
缺 点
容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的 分析，优化反应条件
使用方便
----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜
对引物特异性要求较 高
3、Molecular Beacon
4、LNA probes 5、Scorpions primers 6、FRET probe 7、Allglo探针
SYBR Green， FAM，HEX， VIC，TET， JOE，CY3， TAMRA， NED，ROX， CY5，LCRed等等
一价阳离子（KCl）
2
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
3
命
原理简单，结果多变
重复性差
假阳性 假阴性
扩增效率低
Ct值出现的晚 标准曲线线性不佳
WHY?
2019/3/3
4
组分量很重要——相互制约的平衡之道
模板引物复合物 产物
EDTA
腐殖质 模板
螯合
dNTP
螯合 螯合
引物
盐离子
10
2019/3/3
生
11
命
荧光定量PCR（QPCR）是咋回事？
PCR全部循环跑完再检测一次产物量，在电泳仪上分
离后，用EB等染料染色，在紫外灯下检测。 通过荧光分子标记，QPCR每跑一个循环都检测一次 产物量，无需任何分离，在QPCR仪内直接检测。 一个PCR反应产物检测只得到一个数据，只能粗略判 断终产物的量。 一个单色QPCR跑40个循环可以检测到40个数据，可 以更精确的推断出DNA的量。
盐离子
Mg2+
活性
Taq
构象
Tween 甘油
4
KCl
Buffer
DDT
2019/3/3
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科
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爱
生
5
命
反应温度时间很重要——动态竞争的过程
引物与引物，引物与模板的不同部位都会有一定的结
合力，只是大小有差异，取决于温度与浓度 DNA聚合酶与引物，与双链DNA（模板和产物），与 模板引物复合体都能结合，只是与后者结合力更强 DNA聚合酶与DNA的结合是动态的，在不断的结合与 分离 DNA分子之间的结合，以及聚合酶与DNA分子之间的 结合发生的温度范围很广，并非只有退火的时候才发 生。
温度和时间决定了哪个产物能胜出
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
6
命
原理简单，控制不易
成分控制
体积控制 温度控制
时间控制
6
2019/3/3
用
科
技
关
爱
生
7
命
成分控制
核酸抽提试剂
引物合成可能有杂质 商品化的PCR试剂盒未标明成分
7
2019/3/3
用
科
技
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爱
生
8
命
体积控制
移液器
用
科
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生
TaqMan法
工作原理
19
命
每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光
2019/3/3
用
科
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爱
生
Taqman法
优缺点
20
命
优点
对目标序列的高特异性-----阴性结果确定 设计相对简单------与目 标序列某一区域互补 重复性比较好
8、蝎形引物（Scorpion primer）：荧光标记引物 9、Amplifluor：荧光标记引物
2019/3/3
14 实时荧光定量PCR 方法 1 －SYBR Green 法(EVA Green)
用
科
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爱
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命
Excites at 497 nm and emits at 520 nm.
2019/3/3
用
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15
命
SYBR Green 染料工作原理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
• SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 • 变性时，DNA双链分开，无荧光 • 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发 荧光，在此阶段采集荧光信号。
荧光分子的性质(激发和 发射波长、强度、寿命、 偏振等)可随所处环境的 性质，如极性、折射率、 黏度等改变而灵敏地改变。
12
2019/3/3
用
科
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爱
生
13
命
QPCR用什么荧光分子，怎么用？
非特异性荧光染料：
1、 SYBR Green
特异性荧光探针：
2、TaqMan（Taqman-MGB)
2019/3/3
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生
12
命
荧光分子简介
荧光是一种光致冷发光现象。荧光分子经某种波长的入射光（
通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立 即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在可 见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失 。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
2019/3/3
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生
实时荧光定量PCR方法2－TaqMan-MGB法
TaqMan---水解型杂交探针
18
命
荧光素
非荧光淬 灭基团
MGB (Minor Groove Binder) 将探针的Tm值提高 10℃
与目标序列互补
因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低 了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。 TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
PCR，不只是温度循环
用 科 技 关 爱 生 命
杭州博日科技有限公司 肖强海
2019/3/3
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1
命
PCR基本原理
变性
延伸
退火
N个循环
2019/3/3
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生
2
命
PCR的基本成分
模板DNA
特异性引物 热稳定DNA聚合酶
脱氧核苷三磷酸（dNTP）
二价阳离子（Mg2+/Mn2+） 缓冲液（Tris-Cl）
吸头 操作手法
8
2019/3/3
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9
命
温度及时间控制 ——滞后效应
导热膜
反应试剂 耗材 金属底座
温度探头
半导体
散热器
9
2019/3/3
用
科
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10
命
面对困难如何调整优化
二级结构 GC含量 模板 序列 试剂 让 厂 商 去 优 化 吧
完整度 抑制剂
二聚体 错配
模板
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仪器
引物 耗材
2019/3/3
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17
命
实时荧光定量PCR方法2－TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互 补 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与 Q分开，发荧光
2019/3/3
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SYBR Green 法
优缺点
16
命
优 点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA
缺 点
容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的 分析，优化反应条件
使用方便
----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜
对引物特异性要求较 高
3、Molecular Beacon
4、LNA probes 5、Scorpions primers 6、FRET probe 7、Allglo探针
SYBR Green， FAM，HEX， VIC，TET， JOE，CY3， TAMRA， NED，ROX， CY5，LCRed等等
一价阳离子（KCl）
2
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用
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3
命
原理简单，结果多变
重复性差
假阳性 假阴性
扩增效率低
Ct值出现的晚 标准曲线线性不佳
WHY?
2019/3/3
4
组分量很重要——相互制约的平衡之道
模板引物复合物 产物
EDTA
腐殖质 模板
螯合
dNTP
螯合 螯合
引物
盐离子
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11
命
荧光定量PCR（QPCR）是咋回事？
PCR全部循环跑完再检测一次产物量，在电泳仪上分
离后，用EB等染料染色，在紫外灯下检测。 通过荧光分子标记，QPCR每跑一个循环都检测一次 产物量，无需任何分离，在QPCR仪内直接检测。 一个PCR反应产物检测只得到一个数据，只能粗略判 断终产物的量。 一个单色QPCR跑40个循环可以检测到40个数据，可 以更精确的推断出DNA的量。
盐离子
Mg2+
活性
Taq
构象
Tween 甘油
4
KCl
Buffer
DDT
2019/3/3
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5
命
反应温度时间很重要——动态竞争的过程
引物与引物，引物与模板的不同部位都会有一定的结
合力，只是大小有差异，取决于温度与浓度 DNA聚合酶与引物，与双链DNA（模板和产物），与 模板引物复合体都能结合，只是与后者结合力更强 DNA聚合酶与DNA的结合是动态的，在不断的结合与 分离 DNA分子之间的结合，以及聚合酶与DNA分子之间的 结合发生的温度范围很广，并非只有退火的时候才发 生。
温度和时间决定了哪个产物能胜出
2019/3/3
用
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6
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原理简单，控制不易
成分控制
体积控制 温度控制
时间控制
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7
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成分控制
核酸抽提试剂
引物合成可能有杂质 商品化的PCR试剂盒未标明成分
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8
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体积控制
移液器