基因工程与敲除鼠
基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除小鼠的实验流程
一、前期准备
1、检索标记基因：采用全基因组测序技术或大规模基因组关联分析法筛选出敲除对研究有重要作用的基因；
2、设计敲除构建：根据筛选出的基因特异性序列，对基因进行深入分析，结合已有研究成果，根据基因的功能和结构确定可有效敲除的基因结构模型；
3、制备修饰质粒：根据设计模型，制备适当的质粒，使其具有足够的重组能力和具有全套的特异性对象；
4、选择载体：选择合适的载体（含有敲除的质粒），使敲除的基因更容易被载入小鼠细胞中进行修饰；
二、基因敲除实验
1、小鼠胚胎动物模型：小鼠胚胎是敲除小鼠研究的传统动物模型，采用小鼠母体体外受精，利用载体质粒将敲除基因引入胚胎，敲除的基因将被遗传给后代小鼠；
2、小鼠嵌合体模型：采用基因修饰技术将敲除基因嵌入小鼠细胞的质粒，多功能的抗体定位蛋白可以用来将质粒载入小鼠细胞，利用抗体定位系统，将修饰的嵌入小鼠胚胎，诱导而成嵌合体，使敲除的基因能够传递给后代；
3、选择敲除后的小鼠：将敲除实验的小鼠孵化。
几种基因敲除鼠简介
目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠：通过基因工程技术，将特定基因从 老鼠体内敲除，从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程，用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中，然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
03
疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病，用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果，加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低，产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术，将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子，使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统，如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物，缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性，可以避免全身敲除基因带来的副作用；同 时，可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能，提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂，需要较高的技术要求和时间成本；同时， 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响，如激素水平、给药方式等。
基因工程小鼠名称解读
基因工程小鼠名称解读基因工程小鼠是指通过人为干预小鼠基因组的技术手段，使其表达特定基因或缺失特定基因，从而实现对基因功能的研究和相关疾病模型的建立。
这些小鼠通常被用于研究基因功能、疾病机制、药物筛选等方面。
在基因工程小鼠的命名中，常用的方式是根据其基因改造方式或目的来命名。
以下是一些常见的基因工程小鼠名称及其解读：1. 转基因小鼠（Transgenic mice），这类小鼠是通过将外源基因导入小鼠的基因组中而得到的。
这些外源基因可以来自其他物种，如人类或其他动物。
转基因小鼠常用于研究特定基因的功能、表达模式等。
2. 敲除小鼠（Knockout mice），这类小鼠是通过人为干预使特定基因在小鼠体内失去功能的方式得到的。
一般采用基因敲除或基因靶向突变技术，使小鼠体内特定基因的表达受到抑制或完全消除。
敲除小鼠常用于研究基因的功能缺失对生理和病理过程的影响。
3. 过表达小鼠（Overexpression mice），这类小鼠是通过人为干预使特定基因在小鼠体内过度表达的方式得到的。
通过引入外源基因或增强内源基因的表达水平，使小鼠体内特定基因的表达量显著增加。
过表达小鼠常用于研究基因的过度表达对生理和病理过程的影响。
4. 突变小鼠（Mutant mice），这类小鼠是指在小鼠基因组中引入或产生突变的小鼠，突变可以是点突变、插入突变、删除突变等。
突变小鼠常用于研究特定基因突变对生理和病理过程的影响。
除了上述常见的命名方式，基因工程小鼠还可以根据具体的研究目的、基因改造技术等来命名，例如组织特异性表达小鼠、条件性基因敲除小鼠等。
需要注意的是，基因工程小鼠的命名通常是根据研究者或研究机构的需求和约定来进行的，不同研究领域和实验室可能会有不同的命名方式和规范。
总体而言，基因工程小鼠的命名旨在描述其基因改造方式、基因功能或研究目的，以便研究者能够清楚地了解其特点和应用范围。
基因敲除小鼠的原理
基因敲除小鼠的原理嘿，小伙伴们！今天咱们来聊聊基因敲除小鼠这个超级有趣的东西。
想象一下，小鼠的基因就像一本本小秘籍，每本秘籍都写着小鼠身体各个部分怎么生长、怎么工作。
而基因敲除呢，就像是一个调皮的小魔法师，把其中一本秘籍的好多页给撕掉或者改写了。
那这个小魔法师是怎么做到的呢？首先呢，科学家们得找到一种很厉害的工具，这个工具就像是一把超级小剪刀，这个小剪刀的名字叫做核酸内切酶。
它能专门识别小鼠基因里特定的小片段，就像钥匙和锁一样匹配。
比如说，有个基因片段长得像个小月亮，那这把小剪刀就专门找这种小月亮形状的片段。
然后呢，当小剪刀找到这个特定的片段后，咔嚓一下就把这个片段给剪断啦。
这一剪断可不得了，就像在那本秘籍中间挖了个大坑一样。
这个基因片段被剪断以后啊，小鼠的身体就会像突然接到了一个错误指令。
原本这个基因告诉身体要长出长长的尾巴，现在因为这个基因被破坏了，可能尾巴就长不长啦，或者长得奇奇怪怪的。
但是这个过程可不是随随便便就能成功的哦。
科学家们要做很多准备工作。
他们得精心挑选那些能够准确找到目标基因的小剪刀，这就好比是在一堆钥匙里找一把能开特定锁的钥匙，得特别细心才行。
而且，这个小剪刀要很稳定，不能乱剪其他不该剪的基因片段，不然小鼠身体里就乱套啦，就像把整个图书馆的书都弄乱了一样。
在这个过程中呢，还有一个很重要的步骤，就是要把这把小剪刀送到小鼠的细胞里面去。
这可不容易呢，就像要把一个小快递准确无误地送到一个超级小的收件箱里。
科学家们有时候会用一些特殊的方法，比如说把小剪刀和一些能轻松进入细胞的小物质结合起来，就像给小剪刀装上了一个导航仪，让它能顺利地到达目的地。
一旦小剪刀成功进入细胞，并且找到了目标基因并且剪断了它，这个细胞就开始按照新的指令来工作啦。
这个新的指令就是没有了被敲除的那个基因的指令。
然后这个细胞就会不断地分裂，产生更多的细胞，每个细胞都带着这个被改变的基因信息。
慢慢地，整只小鼠就会表现出因为这个基因被敲除而产生的各种变化啦。
基因敲除小鼠杂交意义 -回复
基因敲除小鼠杂交意义-回复基因敲除小鼠杂交是一种常用的实验手段，用于研究基因对生物体发育、生理和行为的影响。
通过杂交的方式将基因敲除小鼠与野生型小鼠（或其他小鼠株系）进行交配，可以获得一些有价值的信息。
本文将一步一步回答关于基因敲除小鼠杂交的意义。
首先，基因敲除小鼠是通过基因工程技术修改特定基因的结构，使其在小鼠体内失去功能。
这些基因敲除小鼠被广泛用于探究基因的功能和作用机制。
通过杂交将基因敲除小鼠与野生型小鼠或其他小鼠株系杂交，可以帮助我们进一步了解这些敲除基因对生物体的影响。
其次，基因敲除小鼠杂交可以帮助我们研究基因在发育过程中的作用。
例如，某个基因敲除小鼠可能表现出发育缺陷或其他异常表型，这些异常可能是因为该基因在特定发育阶段起到关键作用。
通过将这些敲除小鼠与野生型小鼠进行杂交，研究人员可以观察到产生杂交后代的发育过程，从而了解该基因在哪个发育阶段发挥作用。
此外，基因敲除小鼠杂交还可以帮助我们理解基因在器官和组织功能中的作用。
比如，某个敲除基因可能与心脏发育和功能密切相关。
通过将该敲除小鼠与野生型小鼠杂交，我们可以观察到产生的杂交后代的心脏发育和功能是否受到影响，从而了解该基因在心脏功能中的具体作用机制。
此外，基因敲除小鼠杂交还可以帮助我们研究基因在疾病发生机制中的作用。
通过敲除与某种疾病相关的基因，可以模拟该疾病在小鼠体内的发生过程。
将敲除小鼠与野生型小鼠杂交后，我们可以观察到产生的杂交后代是否具有疾病相关的表型，从而进一步研究该基因与该疾病的关系及其发生机制。
另外，基因敲除小鼠杂交还可以帮助我们研究基因在行为中的作用。
通过敲除与某种行为表现相关的基因，我们可以观察到产生的敲除小鼠是否表现出行为异常。
将敲除小鼠与野生型小鼠杂交后，我们可以观察到产生的杂交后代在行为方面是否受到影响，从而研究该基因与行为之间的关系。
总之，基因敲除小鼠杂交是一种常用的实验手段，用于研究基因对生物体发育、生理和行为的影响。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法
1. CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是一种高效的基因编辑工具，可以用来精确地敲除小鼠基因。
首先，科学家设计合成一段RNA序列，使其与目标基因序列相匹配，然后将这段RNA和Cas9蛋白复合体导入小鼠胚胎内。
复合体会通过识别并切割目标基因，导致基因敲除。
2. 胚胎干细胞技术，另一种常见的基因敲除小鼠方法是利用胚胎干细胞。
科学家可以将设计好的基因敲除载体导入小鼠胚胎干细胞中，使其发生基因敲除。
然后，这些修改过的干细胞可以被植入小鼠胚胎内，从而产生基因敲除小鼠。
3. 遗传改造小鼠技术，除了CRISPR/Cas9和胚胎干细胞技术，科学家还可以利用遗传改造技术来实现基因敲除。
这种方法涉及到选择性育种和杂交，通过选择性地交配和繁殖，最终得到具有特定基因敲除的小鼠品系。
总的来说，基因敲除小鼠的方法主要包括CRISPR/Cas9基因编辑技术、胚胎干细胞技术和遗传改造小鼠技术。
这些方法都是在实验室条件下进行的，需要经过严格的实验设计和操作流程，以确保
基因敲除的准确性和有效性。
同时，这些方法也为科学家提供了强大的工具，用于研究基因在生物体内的功能和作用机制。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理
基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过人工干预使目标基因无法正常表达。
基因敲除小鼠则是在小鼠模型中应用基因敲除技术。
基因敲除的原理是利用DNA重组技术制备特定的敲除载体。
该载体中携带有目标基因的一部分DNA序列，同时还含有选择标记基因和其他必要的DNA片段。
敲除载体经过转染进入靶细胞后，在细胞内会发生DNA重组，导致目标基因发生敲除。
继而，选择标记基因的表达使得细胞能够被筛选出来。
在基因敲除小鼠的制备上，可以通过体外受精的方式将敲除载体导入受精卵中，或者通过基因编辑技术如CRISPR/Cas9在早期胚胎阶段实现基因敲除。
随后，带有敲除基因的胚胎会被移植到代孕母鼠体内进行发育。
通过基因敲除小鼠模型，研究人员可以研究目标基因的功能以及生理、病理学功能。
这种技术广泛应用于研究基因对发育、生长、免疫应答、代谢、行为等方面的影响。
基因敲除小鼠模型也被用于疾病模拟，如研究癌症、神经系统疾病等。
总之，基因敲除小鼠是通过敲除目标基因实现对特定基因功能的研究，为深入理解基因的功能以及疾病发生机制提供了重要工具。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法基因敲除小鼠模型是生物医学研究领域中常用的实验动物模型之一。
通过对特定基因进行敲除，科研人员可以研究该基因在生物体内的功能和影响，从而深入了解该基因对生物体的生理和病理过程的调控作用，为人类疾病治疗和药物研发提供重要的实验基础。
下面我们将介绍关于基因敲除小鼠的方法。
一、基因敲除小鼠的原理和意义1.1 基因敲除原理基因敲除是指通过人工手段破坏特定基因的DNA序列，使其失去功能。
在小鼠模型中，通常利用基因敲除技术将目标基因进行突变或删除，从而观察小鼠在不同生理状态下的表型变化，探索目标基因在生物体内的功能和作用机制。
1.2 基因敲除的意义基因敲除小鼠模型可以帮助科研人员研究特定基因的生物学功能，了解其在生物体内的作用机制。
基因敲除小鼠模型也能够为疾病研究和药物开发提供重要的实验依据，有助于发现新的治疗靶点和疾病治疗方法。
二、基因敲除小鼠的制备方法2.1 基因敲除小鼠的选择在进行基因敲除小鼠实验前，首先需要选择合适的小鼠品系和基因靶向。
常用的小鼠品系包括C57BL/6、BALB/c等，而基因敲除的选择通常基于目标基因在疾病或生理过程中的重要性。
2.2 敲除载体的构建和筛选制备基因敲除小鼠需要先构建敲除载体，通常采用基因工程技术将靶向基因进行突变或删除，然后将这些构建好的载体导入至小鼠胚胎干细胞中，进行筛选和培养。
2.3 胚胎干细胞的培养与筛选在培养和筛选过程中，科研人员需要将导入敲除载体的胚胎干细胞引入小鼠胚胎中，然后进行体外培养和筛选，以筛选出正常的敲除基因小鼠。
2.4 敲除小鼠的鉴定和繁殖成功培育出的敲除小鼠需要进行PCR鉴定和繁殖，以得到稳定传代的敲除小鼠品系。
对敲除小鼠进行系统的表型观察和分析，以确定目标基因敲除后的表型变化。
三、基因敲除小鼠的应用和前景3.1 基因敲除小鼠在生物学研究中的应用基因敲除小鼠模型广泛应用于生物学研究领域，包括生理学、免疫学、神经科学、遗传学等各个领域。
基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除小鼠的实验流程1.设计基因敲除小鼠实验方案在开始实验之前，需要明确研究目的，确定需要敲除的基因，并设计相应的实验方案。
一般可以使用 CRISPR-Cas9 系统来实现基因敲除，在设计基因敲除实验方案时，需要选择合适的 sgRNA 序列，以及设计恰当的引物用于检测突变。
2.获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞为了实现基因敲除，需要获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞。
一种常用的方法是利用胚胎干细胞对外源DNA的高度易感性，将敲除基因的质粒DNA转染到小鼠胚胎干细胞中。
3.筛选敲除基因的胚胎干细胞株系将转染了敲除基因的胚胎干细胞以悬浮培养的方式进行培养，培养一段时间后，利用一定的筛选条件来筛选出含有敲除基因的胚胎干细胞株系。
筛选条件可包括对抗生素的使用或筛选标记基因的表达。
4.制备敲除基因小鼠的固定胚胎干细胞系通过体外培养，将敲除基因的胚胎干细胞系定植在培养皿上，培养数代以后，将其冻存，以备后续的实验使用。
5.实施敲除基因小鼠的胚胎干细胞基因改造将固定的胚胎干细胞系重新激活，转染 Cas9 和 sgRNA，利用CRISPR-Cas9 系统使这些细胞具有敲除基因的突变。
6.识别敲除基因的胚胎干细胞阳性克隆株对转染了 Cas9 和 sgRNA 的胚胎干细胞进行筛选，通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法识别出敲除了目标基因的阳性克隆株。
7.将敲除基因的胚胎干细胞注入小鼠的早期胚胎取出已受精的小鼠卵母细胞，利用显微操作将敲除基因的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。
利用体外受精或者通过体内或体外的胚胎移植方式将基因敲除干细胞注入受体小鼠。
8.制备基因敲除小鼠的嵌合小鼠将已注入敲除基因的胚胎干细胞的受体小鼠进行嵌合以产生基因敲除小鼠。
嵌合可以通过体内或体外的胚胎移植方式进行。
9.筛选识别基因敲除小鼠对产生的嵌合小鼠进行筛选，确认敲除基因是否成功。
可以通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法对小鼠体细胞或组织进行分析。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理基因敲除是一种常用的遗传工程技术，它通过人为地改变生物体的基因组，使得某个特定基因在生物体中失去功能。
基因敲除技术在动物模型研究中得到了广泛的应用，特别是在小鼠模型的构建中发挥着重要作用。
下面将介绍基因敲除小鼠的原理及其应用。
基因敲除小鼠原理。
基因敲除小鼠是指通过基因工程技术，将小鼠的某个特定基因进行改变，使得该基因在小鼠体内失去功能。
基因敲除小鼠的构建通常分为以下几个步骤：1. 选择目标基因，首先需要选择需要敲除的目标基因，通常选择与某种疾病或生理过程相关的基因作为目标。
2. 构建敲除载体，将目标基因的敲除载体导入到小鼠的胚胎干细胞中，使得目标基因在胚胎干细胞中发生敲除。
3. 胚胎干细胞筛选，经过敲除载体导入后，对胚胎干细胞进行筛选，筛选出发生了基因敲除的干细胞。
4. 小鼠胚胎的移植，将发生了基因敲除的胚胎干细胞移植到受精小鼠卵母细胞内，通过体外培育和移植到母体小鼠子宫内，使得基因敲除小鼠的胚胎发育成熟。
5. 基因敲除小鼠的鉴定，对出生的小鼠进行基因型分析，确认是否成功构建了基因敲除小鼠模型。
基因敲除小鼠的应用。
基因敲除小鼠模型在生物医学研究中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 功能基因研究，通过敲除特定基因，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生物体生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
2. 疾病模型构建，基因敲除小鼠模型可用于构建各种疾病模型，如肿瘤模型、免疫缺陷病模型等，用于研究疾病的发病机制及寻找治疗方法。
3. 药物筛选，基因敲除小鼠模型可用于药物的筛选和评价，通过观察敲除某个基因后对药物疗效的影响，为新药的研发提供重要参考。
4. 基因治疗研究，基因敲除小鼠模型可用于基因治疗的研究，通过敲除某个致病基因或导入正常基因，探索基因治疗的可行性及疗效。
总结。
基因敲除小鼠模型是一种重要的生物医学研究工具，通过对特定基因的敲除，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
基因敲除鼠 方法
基因敲除鼠方法
基因敲除鼠是一种利用基因编辑技术实现的实验动物模型。
它是通过对小鼠胚胎干细胞进行基因编辑，使其基因组中的目标基因发生永久性的敲除，从而实现对该基因功能的研究。
以下是基因敲除鼠的具体方法：
1.设计合适的基因编辑工具：选择合适的RNA引物或合成具有特定剪切酶活性的酶，如CRISPR/Cas9系统。
2.制备适当的DNA和RNA（或Cas9/sgRNA复合物）：将DNA或RNA分别转染到小鼠胚胎干细胞中，使其与靶基因发生靶向切割或插入。
3.筛选和鉴定：筛选和鉴定敲除细胞，将敲除细胞移植到小鼠胚胎中，培育出敲除小鼠。
4.对敲除小鼠进行验证：通过PCR或转录组分析等技术，确认敲除小鼠已经成功实现，从而得到目标基因敲除的实验动物模型。
需要注意的是，敲除基因会对小鼠的生理和行为表现造成影响，因此需要进行更加详尽的生理和行为分析，确保研究结果的可靠性。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠是一种常用的遗传学实验手段，通常用于研究某一
基因功能和相关疾病的机制。
其原理是通过基因转染、导入、定向改
造等方法，实现对特定基因的去除或改变，从而制备具有该基因敲除
或改变的小鼠模型。
敲除的方式包括大小不等的片段缺失、点突变、
替换等。
在这种方法中，关键是选择合适的基因靶点和敲除方法。
一般是
对已有的相关研究和文献进行了解和分析，然后选择合适的目标基因，设计相应的敲除载体，实现基因敲除小鼠的制备。
在实验过程中，需
要对敲除小鼠进行一系列的鉴定和检测，以确保所制备的模型符合研
究要求。
此外，敲除小鼠也常常需要和其他基因改变模型进行交叉繁殖，从而得到更复杂的基因改变模型，以深入研究基因与疾病的关系。
基因敲除小鼠为遗传学研究提供了一种可靠的模型，为研究基因
在身体发育、功能调节、疾病发生等方面的作用机制提供了有力的工具。
基因敲除鼠原理 -回复
基因敲除鼠原理-回复基因敲除鼠是一种常用的实验动物模型，用于研究基因功能和疾病机制。
基因敲除是指通过人为手段删除动物体内的特定基因，从而观察基因缺失对生物体的影响。
在本文中，我们将详细介绍基因敲除鼠的原理和步骤。
1. 鼠标基因组定位和筛选首先，需要确定目标基因在鼠标基因组中的位置。
通过鼠标基因组浏览器等数据库和工具，我们可以获取目标基因的相关信息，包括基因的结构、启动子和剪接变异等。
在确认目标基因的位置后，接下来需要选择适合的切割位点。
2. 制备敲除载体基因敲除的一个关键步骤是通过亚克隆技术制备敲除载体。
首先，需要设计合成两个与目标基因两侧序列互补的引物。
引物设计时需要考虑到引物的特异性和合成的效率。
然后，利用聚合酶链反应(PCR)和DNA合成技术，我们可以扩增和合成两个互补的引物序列。
接下来，将扩增得到的两段DNA序列进行连接，形成敲除载体。
3. 选择胚胎干细胞接下来，在实验室条件下，需要选择和培养适合的胚胎干细胞。
胚胎干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和分化为不同类型细胞的能力。
这些细胞通常从早期胚胎中获得，可以通过培养和传代来扩增。
4. 转染敲除载体和选择阳性克隆将敲除载体转染到胚胎干细胞中是基因敲除鼠实验中的关键步骤之一。
转染一般采用电穿孔法或者病毒介导的转染技术。
转染后，通过添加适当的选择性抗生素，可以选择出转染了敲除载体的阳性克隆。
5. 形成敲除鼠模型得到阳性转染克隆后，可以通过将这些细胞注入早期胚胎的内质网，进一步培养和发展。
通过将这些胚胎移植到代孕母鼠子宫中，可以等待胚胎发育并诞生敲除鼠模型。
6. 验证基因敲除效果最后一步是验证基因敲除的效果。
可以通过PCR和DNA测序等分子生物学技术进行验证。
PCR可以检测目标基因的DNA序列是否被成功替换或删除。
而DNA测序则可以进一步验证目标基因的序列是否发生了改变。
基因敲除鼠模型的建立可以提供对特定基因功能的深入了解，并帮助研究人员揭示基因的作用和疾病机制。
转基因小鼠和基因敲除小鼠区别？
转基因小鼠和基因敲除小鼠区别？基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgenic technology）。
人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的同义词。
经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"（Genetically modified organism，简称GMO）。
Genetically Modified--转基因，简称GM。
是指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质。
利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。
也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。
基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。
所谓胚胎干细胞(EmbryonicStem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3-5天)分离出的内细胞团(Inner cellmass，ICM)细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。
在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。
而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。
转基因小鼠与基因敲除小鼠的差异
转基因小鼠与基因敲出小鼠的差异
请问：转基因小鼠与基因敲出小鼠之间有什么差异呀？？
最佳答案
转基因小鼠就是基因组中含有外源基因的小鼠。
它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术而发育。
用以改变普通小鼠的性状.
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源
序列的目的基因整个置换内源基因。
用以研究某一基因的作用.。
基因工程与敲除鼠79页PPT
基因工程常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
基因工程小鼠肿瘤模型构建方法
基因工程小鼠肿瘤模型构建方法
（1）敲除小鼠（CRቤተ መጻሕፍቲ ባይዱSPR/Cas9）：基因的完全敲除，风险是有可能胚胎致死。（2）条件性敲除小鼠（Cre/LoxP）：基因的条件性敲除，可选择在特定的组织和特定的时间进行基因敲除或敲入。推荐指数：★★优点：可对小鼠基因进行操作，模拟基因突变的肿瘤发生过程。缺点：贵操作复杂，周期长。适用研究：基因突变导致的肿瘤发病机制，肿瘤发生转移和药物研究。获取方法：可以自己构建（难度大），也可以购买已有的商业化小鼠或定制。
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用于第二股链
的合成； ⑷ DNA序列分析。
+
3' 5'
标记探针
3. Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）
作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。
（三）逆转录酶
特点 一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：
碱性磷酸酶
末端转移酶
（一）限制性核酸内切酶(RE)
是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序 列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割 酶。
根据限制酶的作用特性，一般分为三类：
——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，
其中常用的是Ⅱ型限制酶。
限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点
特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断， 主要产生3种缺口： 5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端 平端或钝端
1. 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。如，具 有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素 （Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。
(1) 插入失活
当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基
因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板 上。
抗生素平板筛选（插入失活）
1. 质粒 (plasmid)：
是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分
子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： ① 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内 ② 具有1个以上的遗传标志，便于筛选
③ 具有多克隆位点
常用的质粒： pBR322质粒、pUC系列等
pBR322质粒
① ② 4363 bp 含一个复制点(ori) ③ 含一个抗氨卞青霉素 标记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ⑤ ampR和tetR基因内 各有一些限制酶的酶 切位点，供外源基因 插入
2. Klenow片段（DNA pol.大片断）
Klenow片段用途
⑴ 补齐双链DNA的 3ˊ末端； ⑵ 用标记碱基补 齐3ˊ末端 ； ⑶ 在cDNA克隆中，
5' 3' 变性 5' 3' 5' 3' Klenow DNA聚合酶 5' 3' 外切酶Ⅲ 3' 5' [α 32P]dNTP 3' 标记末端 5' 5'-粘端 3' 双链 DNA 5'
基因工程与基因敲除
(genetic recombination and genetic engineering)
基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切 割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA
重组。 基因克隆
将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其 扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为 基因克隆、DNA克隆或分子克隆。
（主要有以下4种连接方式）
1. 粘性末端连接
2. 平头末端连接
3. 人工接头法 4. 同源多聚尾连接法
1. 粘性末端连接
将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起 来，构成重组DNA分子。
2. 平头末端连接
在T4DNA连接酶的作用下将平头末端的目的基因
基因工程 实现基因重组和基因克隆所采用的方 法和相关工作，统称为重组DNA技术或基 因工程。
基因工程目的： ① 分离获得某一目的基因或DNA ② 获得目的基因的表达产物（蛋白质）
重组DNA技术的基本流程
目的基因的获取； 克隆载体的选择和处理
外源基因与载体的连接
重组DNA导入受体菌
重组体的筛选
本节主要内容
3.
聚合酶链反应( PCR)
在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下， 体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次 循环（2530次），扩增目的基因。
4. 化学合成法
较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物
测序引物
定点突变 核酸杂交探针
(二) 目的基因与载体的连接（接）
（六）末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)
作用 将dNTP加到DNA的3’-OH末端；也可催化载体分子或待克隆 的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。 应用 ① 探针标记
P32-α dGTP
.
G32G32G32G32
G32G32G32G32
② 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接
回文序列
是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末 端突出的碱基序列相互具有互补性。
⑴
产生5'-粘性末端
⑵
产生3'-粘性末端
5' -CTGCAG- 3' 3' -GACGTC- 5'
Pst I
G- 3' 5' -CTGCA + ACGTC- 5' 3' -G
如， BstpⅠ，其识别顺序为 GGTNACC。
（二） DNA聚合酶（DNA polymerase )
（最常用的DNA聚合酶有以下4种）
1. DNA聚合酶Ⅰ 2. DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段 3. Taq DNA聚合酶
4. T4 噬菌体DNA聚合酶
1. DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ）
λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长
溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，2个COS位点互补成环，在宿主菌体 内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。
溶源性生长
噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体 中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂 解 。
与载体DNA连接起来。
3.
人工接头法
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割，产生粘 性末端→连接，构建重组DNA。
4 同 源 多 聚 尾 连 接 法
(三) 重组DNA导入宿主细胞（转）
转化 转染 转导 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。
一、重要的工具酶 二、基因克隆常用的载体 三、重组DNA基本原理 四、重组技术在医学和制药工业中的应用
五、基因工程制备敲除鼠文献解析
一、重要的工具酶
工具酶
主要是指用于DNA和RNA分子的 切割、连接、聚合、修饰、反转录 等有关的各种酶系统。
工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶
逆转录酶
DNA连接酶
同裂酶——同识同切
5'-TTT AAA-3' 3'-AAA TTT-5'
Aha Ⅲ Dra Ⅰ
5'-TTT + AAA-3' TTT-5' 3'-AAA
同裂酶——同识异切
5'- GGTAC C -3' 3'- CCATGG -5' 5'- GGTAC C -3' + 3'- C CATGG -5'
E.Coli DNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ） 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
E. coli DNA pol. Ⅰ催化切口平移
DNA pol Ⅰ应用
⑴ ⑵ ⑶ ⑷ 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针； 第二条cDNA链的合成； 对DNA 3’突出末端进行标记； DNA序列分析。
（四） DNA连接酶(DNA ligase)
DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA 中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2 形成磷酸二酯键 而相连，从而构成一条完整的DNA长链。
DNA连接酶的用途
（1）
5ˊ- ACG
两个双链DNA片段连接起来
AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 GCA-5ˊ 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ
载体(vector)
是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载
工具，其化学本质为DNA 。
主要内容
载体必须具备的基本条件
载体的种类
常用的载体
（一）载体必须具备的基本条件
⒈ ⒉ ⒊ ⒋ ⒌ 有自身的复制子，能独立复制 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) 具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、
3ˊ- TGCTTAA
（2）
修补带有缺口的双链DNA分子
T4DNA连接酶
（五） 碱性磷酸酶
碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA 5'-端的
磷酸基团。 用途 ⒈ 制备载体时，去除载体分子 5ˊ－端磷酸基后，可防止载 体自身环化连接，提高重组效率。 ⒉ 用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性 核苷酸加到5'-端进行标记。
pUC系列质粒
由pBR322和M13噬菌体构
建而成的双链质粒载体；
（1） 2674bp；
（3）有一个来自大肠杆菌的 LacZ操纵子的DNA片断, 编 码半乳糖苷酶
2. λ噬菌体
组成特点：
双链线状DNA分子，
全长50kb，
含65个基因，
在其分子两端各含有 12个碱基的互补单链，是 天然的粘性末端，被称为 COS位点。