转基因和基因敲除技术介绍

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转基因和基因敲除技术(及英文文献讲解)

DNA，分别为：
5´
3´
5´
3´
3´ 3´ 5´
5´ 内切酶 5´ (recBCD)
3´
3´ 3´ 5´
5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA侵扰
(recA)
5´
3´
5´
3´
3´
5´ 分支迁移
3´
5´
3´
5´ (recA)
3´
5´
5´
3´
5´
3´
内切酶
(recBCD)
5´
3´
DNA
5´
3´
3´
5´ 连接酶
转化体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
分子杂交
目录
(
抗药插性入标失记活选法择
目录
)
原位杂交
目录
Southern印迹
目录
常用的植物转基因方法
遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类:
1、需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；
研究现状
现在基因敲除技术主要应用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
文献讲解
技术原理：同源重组的基因敲除
实验目的：用胚胎干细胞为基础的基因打靶技术方法，构建基因敲除（p53）的大鼠模型。
PGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是为了减少含有位随于机10目号标染媒色介体插上入，的包耐括抗10生个素外型显E子S细，胞其，中以启富动集子正外确显的子目2上标细胞。

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术

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TAL 靶点识别模块
X2
FokI
32
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率编辑升pp高t 几个数量级
33
TALEN的最前沿
27
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。
技术原理：
表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
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16
（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定基因的敲除。
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17
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

基因敲除与转基因互补

基因敲除与转基因互补英文回答：Gene knockout and genetic complementation are two important techniques used in molecular biology and genetics research.Gene knockout refers to the process of intentionally disabling or "knocking out" a specific gene in an organism. This is typically done by introducing a mutation into the gene, rendering it non-functional. Gene knockout is used to study the function of a particular gene by observing the effects of its absence. For example, if a gene is suspected to be involved in a specific disease, researchers can create a knockout mouse model by disabling that gene and then observe the resulting phenotype to understand the gene's role in the disease.On the other hand, genetic complementation is a technique used to determine whether a specific phenotype iscaused by a mutation in a particular gene. It involves introducing a functional copy of the gene into an organism that carries a mutation in the same gene. If the introduced gene is able to restore the normal phenotype, it indicates that the mutation in the original organism was responsible for the observed phenotype. This technique is often used to confirm the causative role of a gene mutation in a particular disease or trait.Both gene knockout and genetic complementation have their own advantages and limitations. Gene knockout allows researchers to study the function of a specific gene by observing the effects of its absence. It helps in understanding the role of genes in development, disease, and other biological processes. On the other hand, genetic complementation helps in confirming the causative role of a gene mutation by restoring the normal phenotype. It provides evidence for the involvement of a specific gene in a particular phenotype or disease.中文回答：基因敲除和转基因互补是分子生物学和遗传学研究中两种重要的技术。

分子生物学课件：基因敲除

P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组在G418、单核苷酸类似物的培养基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组在G418培养基中存活，但是含有单核苷酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠交配
1
3D
基因敲除的纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活，但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123

基因敲除小鼠技术

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。

尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

生物工程学中的基因工程技术

生物工程学中的基因工程技术生物工程学是一门涵盖多个领域的学科，其中包括基因工程技术。

所谓基因工程技术，就是通过切割、粘贴、合成等手段修改生物体的遗传信息。

这项技术可以用于研究基因的功能、制造人工生物、生产生物制品等多个领域。

基因工程技术的原理和方法基因工程技术的基础是DNA分子，DNA是生命的遗传物质，包含了决定生物特征和功能的基因序列。

基因工程技术的方法主要有4种：DNA分子修饰技术、蛋白质表达技术、基因敲除技术和基因突变技术。

- DNA分子修饰技术DNA分子修饰技术是通过切割、粘贴、合成等手段修改DNA分子的结构和信息。

其中，酶切技术是一种常用的DNA切割技术，可以把DNA切成不同大小的片段，这些片段可以用于构建重组DNA。

重组DNA是通过将两个或多个不同来源的DNA片段连接起来，形成新的DNA序列。

- 蛋白质表达技术蛋白质表达技术是将DNA序列转录成mRNA，再将mRNA翻译成蛋白质的过程。

在这个过程中，需要用到表达载体（如质粒），将目标基因插入载体的表达区域，使其在宿主细胞内表达。

这项技术可以用于生产蛋白质制品，如药物、酶等。

- 基因敲除技术基因敲除技术是通过导入人工合成的DNA序列，使其与目标基因发生同源重组，从而使目标基因失效。

这项技术可以用于研究基因功能，了解目标基因对生物体的重要性。

同时，还可以用于植物育种、治疾病等领域。

- 基因突变技术基因突变技术是在基因DNA序列中插入或删除特定的碱基或片段，从而改变目标基因的信息。

这项技术可以用于研究基因功能，如寻找可以治疗基因疾病的靶标基因等。

基因工程技术的应用基因工程技术的广泛应用，涉及多个学科领域。

以下是基因工程技术在不同领域的应用。

- 生物医学领域基因工程技术在生物医学领域的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1）基因诊断：利用基因工程技术分析人类DNA序列，检测基因突变，帮助医生对疾病作出早期诊断。

2）基因治疗：利用基因工程技术将正常基因导入患者体内，替代或修复受损基因，治疗某些遗传性疾病。

基因敲除-简介

用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目
的(gene knock-out)。
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister
chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重
新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、 RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11Rad50等等。
glrA
Ta
actin
Ta
hph
glrA
ble
3.9 kb
RT-PCR验证∆glrA及cglrA菌株
影响因素
细菌的限制性修饰系统。
合适的选择性标记。高效的转化技术(CaCl2法、电转化、原生质体、结合转移、农杆菌介导的转化）。
Thanks!
1、建立高效的遗传转化系统。
2、构建基因敲除载体（最好带有双标记）。
3、转化实验。
4、筛选基因敲除的转化子。
5、验证转化子。
构建glrA 基因缺失株、遗传互补株和高表达菌株
PCR 2 (2.67 Βιβλιοθήκη b)∆glrA ∆glrA
WT
WT
NC
PCR 1 (1.52 kb)
NC
Ladder
3 kb 2 1.6 1
除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变(insertional mutagenesis) 和RNAi
(gene knock-down) 。
a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，成为重组载体。

基因治疗中的基因敲除技术及其应用

基因治疗中的基因敲除技术及其应用基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的新型医疗方法。

基因敲除技术是基因治疗的关键技术之一，它通过引入干扰性RNA或基因编辑工具，针对患者身体内的异常基因进行靶向打击，以实现基因疾病的治疗。

本文将介绍基因敲除技术的基本原理、方法及其在基因治疗中的应用。

基因敲除技术是指通过致使特定基因失活或删除之前定义的区域，来研究近亲气生物中基因的功能，尤其在人类基因组中的应用十分广泛。

基因敲除技术通常包括两种方法：RNA干扰技术和基因编辑技术。

RNA干扰技术是一种用来靶向沉默特定基因表达的方法。

它通过引入干扰性RNA（siRNA或shRNA）来干扰目标基因的转录或翻译，从而使目标基因的表达水平下降。

siRNA是由人工合成的双链RNA构成，可以选择性地降解与其互补的mRNA，使其无法被翻译成蛋白质。

shRNA是一种基因表达载体，可以产生siRNA，并持续地抑制目标基因的表达。

基因编辑技术是一种直接修改基因组的方法，可以实现精确编辑和改变DNA 序列。

基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录调节因子样活化基因编辑酶（TALENs）和CRISPR-Cas9系统。

这些工具通过引导靶标DNA序列，切割和修复DNA，来实现基因敲除。

基因敲除技术在基因治疗中具有广阔的应用前景。

首先，基因敲除技术可以用于治疗单基因型遗传疾病。

通过针对致病基因进行敲除，可以恢复受影响的细胞正常功能，从而治疗疾病。

例如，囊性纤维化患者常常携带突变的囊性纤维化转膜调节器（CFTR）基因，通过使用基因敲除技术，可以删除异常CFTR基因，恢复肺部细胞的正常功能。

其次，基因敲除技术还可以用于癌症治疗。

癌症是由于细胞基因突变引起的，因此通过敲除异常基因可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。

例如，肿瘤抑制基因TP53的突变在很多类型的癌症中都很常见。

使用基因敲除技术来恢复正常TP53基因的功能，可以促进癌细胞凋亡和抑制其生长。

同源重组的基因敲除

3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授

分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件

4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克隆
重组载体
切割基因使待剔除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠、制备基因敲除的胚胎干细胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性

基因敲除技术

基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因(胸苷激酶基因)等)的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。

因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。

分子生物学常用实验技术概述

分子生物学常用实验技术概述分子生物学是研究生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质等）组成、结构和功能的科学领域。

在分子生物学的研究中，常用各种实验技术来解析生物大分子的结构和功能，为科学研究和应用提供依据。

下面将概述一些常用的分子生物学实验技术。

1.PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种能在体外快速扩增DNA序列的技术，可以从一个DNA模板扩增出百万倍的DNA片段。

PCR包括三个步骤：变性、退火和延伸。

通过PCR，可以在短时间内扩增大量特定的DNA 片段，并常应用于基因分析、疾病诊断以及基因工程等领域。

2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体细胞中，使其表达外源蛋白或产生新的表型。

转基因技术通常包括四个步骤：基因分离、基因克隆、基因传递和基因表达。

转基因技术在农业、医学和生物科学研究中具有广泛的应用。

3.蛋白质电泳：蛋白质电泳是根据蛋白质的电荷和大小差异将其分离的一种方法。

常用的蛋白质电泳方法包括SDS-和二维电泳。

蛋白质电泳可用于纯化蛋白质、分析蛋白质组成以及检测蛋白质的修饰。

4.蛋白质质谱：蛋白质质谱是一种分析蛋白质的结构和功能的方法。

常用的蛋白质质谱技术包括MALDI-TOF质谱和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。

蛋白质质谱可用于鉴定未知蛋白质、确定蛋白质的氨基酸序列以及检测蛋白质的修饰等。

5.分子克隆：分子克隆是将外源DNA或RNA序列插入到载体DNA中，并通过细胞转染等方法将其导入到目标细胞中进行表达的过程。

分子克隆常用的方法包括限制性内切酶切割、连接反应、质粒构建和转染等步骤。

分子克隆技术可用于分析、表达和研究目标基因。

6. Northern blotting：Northern blotting是一种检测RNA的方法，常用于检测特定的mRNA分子。

在Northern blotting中，通过RNA的电泳分离、转移、固定以及杂交等步骤，可以检测目标RNA的存在和表达水平。

植物基因敲除技术步骤

植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是现代植物遗传学领域的一项重要研究工具，它通过利用CRISPR/Cas9等工具精确地切断植物基因，从而实现对植物基因组的精准编辑和改造。

下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，希望对您有所帮助。

植物基因敲除技术步骤一、制备CRISPR/Cas9载体1.选择合适的CRISPR/Cas9载体：首先需要确定用于植物基因敲除的CRISPR/Cas9载体，一般选择含有Cas9核酸酶、sgRNA以及适当的植物选择标记的载体。

2.将目标基因sgRNA序列插入载体：利用分子克隆技术，将设计好的sgRNA序列插入CRISPR/Cas9载体中，确保sgRNA能够专一且高效地识别目标基因序列。

二、转化植物细胞1.选择合适的植物材料：根据研究需要选择适宜的植物组织或细胞系，比如拟南芥、水稻、玉米等。

2.利用农杆菌介导转化技术：将制备好的CRISPR/Cas9载体利用农杆菌介导转化技术导入植物细胞中，促使其整合到植物基因组中。

三、筛选敲除突变体1.培养转化的植物细胞：将转化的植物细胞进行培养，培养条件包括合适的培养基、光照和温度等。

2.筛选突变体：利用PCR、Southern blot等技术筛选出含有目标基因敲除的突变植株，确认其为敲除突变体。

四、鉴定敲除突变体1.验证基因组序列：对候选的敲除突变体进行测序鉴定，确认目标基因已被成功敲除。

2.确认敲除效果：通过表型观察、生物化学分析等方法，评估目标基因敲除对植物的影响，确认敲除效果。

通过以上步骤，可以实现对植物基因的精准敲除，为研究植物基因功能、开发新品种以及改良农作物品质提供了重要的技术手段。

植物基因敲除技术的不断完善和广泛应用，将为农业生产和生物科学研究带来更多的机会和挑战。

基因敲除技术与转基因技术的比较研究

基因敲除技术与转基因技术的比较研究生物技术的发展和应用为人类带来了巨大的利益。

然而，与此同时，也不可避免地带来了一些争议。

在生物技术领域，基因敲除技术和转基因技术是两个热门话题，它们的利用在不同领域具有巨大的应用前景。

本文旨在比较基因敲除技术与转基因技术，帮助读者更好地了解它们的区别和优劣之处。

一、基因敲除技术基因敲除技术是一种通过DNA重组实现基因灭活或剔除的方法。

它通常通过利用重组酶切，将合成的DNA序列植入到细胞中，可以导致目标基因在细胞内被敲除或被靶向沉默。

基因敲除技术的优势在于可以准确地控制目标基因，从而促进基因治疗的发展。

此外，它还可以为疾病基因的研究提供新的平台。

基因敲除技术在基础研究、药物研发、细胞修饰和癌症研究等领域有着广泛的应用。

例如，通过敲除恶性肿瘤细胞中的抑癌基因，可以阻止恶性肿瘤的发展；在研发新的药物时，可以通过基因敲除来验证药物的靶点，从而确定药物的作用机理；以及通过基因敲除来研究不同基因在特定生物过程中的作用，例如神经发育和心肌细胞的分化。

二、转基因技术与基因敲除技术不同，转基因技术针对的是在植物和动物等有机体中插入外来基因的技术。

转基因技术常用的几种方法包括随机插入、受控插入、基因扩增和胚胎基因修饰。

转基因技术可以实现“设计”生物体，也就是人为地改变其生物特性。

转基因技术在食品生产、医疗和工业生产等领域有着广泛的应用。

例如，经过转基因技术改造后的植物可以抵抗病虫害，提高产量和质量，从而为食品生产提供了可能；在医疗领域，转基因技术可以用于生产抗体和蛋白质药物，或者用于治疗癌症、糖尿病和多发性硬化等疾病。

此外，转基因技术还可以用于工业制造，例如用转基因植物生产生物燃料、革命纤维和生物塑料等。

三、基因敲除技术与转基因技术的比较基因敲除技术和转基因技术虽然都是生物技术领域的重要发展方向，但二者还是有所不同的。

基因敲除技术致力于通过切断DNA序列来消除不必要的基因，而转基因技术则是通过插入新的基因来增强或改变生物体的功能。

基因敲除技术基本原理

基因敲除技术基本原理基因敲除技术是一种基因工程技术，用于无害地删除或失活目标生物体中的特定基因，以研究该基因在生物体发育、功能、代谢等方面的作用。

基因敲除技术的基本原理包括选择适当的靶标基因、构建相应的敲除载体、导入宿主细胞、通过重组事件敲除目标基因、筛选和鉴定敲除细胞系等。

首先，选择适当的靶标基因是进行基因敲除实验的第一步。

研究人员通常会选择一些在发育或生理过程中具有重要作用的基因作为靶标基因，或者一些与疾病相关的基因。

通过对该基因进行敲除，可以揭示该基因在生物体中的功能和作用机制。

其次，构建相应的敲除载体。

敲除载体是进行基因敲除实验所必需的工具，它通常包括两个关键部分：敲除引物和选择标记物。

敲除引物是用于诱导目标基因发生重组事件的DNA序列，它的序列与目标基因的某个特定区域相匹配。

选择标记物是一种能够通过对敲除细胞系进行筛选和鉴定的标记物，例如抗生素抗性基因。

将这两个部分合并到一起构建敲除载体。

然后，导入敲除载体到宿主细胞中。

常用的方法包括转染、电穿孔和病毒载体介导等。

转染是将敲除载体转移到宿主细胞内的常用方法之一，可以使用化学物质、离子聚合物、病毒载体或电穿孔来增加细胞膜的通透性。

通过重组事件敲除目标基因。

一旦敲除载体成功导入宿主细胞，敲除引物上的序列与目标基因的特定区域发生配对，启动重组事件。

在细胞的DNA修复机制的作用下，目标基因的部分或全部序列被删除或失活。

在敲除过程中，必须通过适当的实验条件和方法，如适当选择敲除载体的浓度和作用时间，以增强敲除效率。

最后，筛选和鉴定敲除细胞系。

筛选敲除细胞系的方法通常基于选择标记物的作用。

例如，如果选择标记物是一个抗生素抗性基因，那么在培养基中添加相应的抗生素，只有携带了敲除载体的细胞才能存活下来。

通过比较被敲除的细胞系与野生型细胞系的生物学特性和表型差异，可以初步鉴定敲除的目标基因在生物体发育、功能、代谢等方面的作用。

总结起来，基因敲除技术通过选择适当的靶标基因，构建敲除载体，导入宿主细胞，通过重组事件敲除目标基因，筛选和鉴定敲除细胞系等步骤，实现了对特定基因的敲除。

转基因与基因敲除knockoutmice

转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
1 of 10
MicroRNA载体
关键因素
• DNA concentration • Injection buffer • Visualizing pronuclei • Timing of injection • Size of DNA • Copy number ：随机的 • Position Effect insulator
• 1982年，Palmiter和Brinster，Nature，超级鼠
转基因动物研究历史
1. 20世纪60年代末和70年代初，John Gurdon向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能否在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。
2. 1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射法获得SV40DNA转基因小鼠。
Spontaneous P<0.0005%
Induced
Random （随机突变）
Targeted
（定向突变）
X-ray mutagenesis 0.05% Chemical mutagenesis 0.1%
Transgene（转基因）10% Homologous Recombination（同源重组）
转基因与基因敲除
-基因工程动物模型的构建
1. Overview.
（概述）
2. Transgenic technology
（转基因技术）
3. Gene targeting
（基因打靶技术）
4. Present
(动物模型的现状)
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转基因动物(transgenic animal) • 概念：用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能

转基因基因敲除

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基因修饰与转基因知识点总结

基因修饰与转基因知识点总结随着科技的不断进步和人类对生命的探索，基因修饰和转基因成为近年来备受关注的话题。

本文旨在对基因修饰与转基因进行深入的知识点总结，以便读者更好地理解和认识这一领域。

一、基因修饰的概念与方法基因修饰是通过改变生物体的遗传物质（DNA）的组成，使其表现出人工设计的特征或性状的过程。

基因修饰的方法有多种，其中常见的包括基因敲除、基因替换、基因添加等。

1. 基因敲除：通过针对特定基因序列的引入突变，使该基因在生物体中失去功能。

这一方法常用于研究特定基因的功能和作用机制。

2. 基因替换：通过引入人工合成的DNA序列，取代生物体原有的某一基因。

这一方法既可以用于消除有害基因，也可以用于引入新的功能基因。

3. 基因添加：通过在生物体的某一特定部位插入外源基因，使其表达出新的性状或功能。

这一方法常用于改良农作物、治疗基因相关疾病等领域。

二、转基因的定义与应用转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体生物体中，使其表达出新的性状或功能。

转基因技术在农业、医学、工业等领域有广泛的应用。

1. 农业领域：转基因技术的应用在改良农作物方面具有重要意义。

通过导入抗虫基因或耐逆基因，科学家们成功地培育出多种转基因作物，如抗虫转基因玉米、抗病转基因水稻等，有效地提高了农作物的产量和品质。

2. 医学领域：转基因技术在医学领域的应用也日益广泛。

通过导入治疗性基因，科学家们研发出许多对基因相关疾病具有疗效的转基因药物，如基因修复治疗、癌症抑制转基因药物等，为人类的健康提供了新的希望。

3. 工业领域：转基因技术在工业领域的应用主要体现在生物制造和环境修复方面。

通过导入具有特定功能的基因，科学家们利用微生物的代谢途径，实现了高效的产酶和产物生产，并利用转基因微生物进行环境修复工作，解决了一些环境污染问题。

三、基因修饰与转基因的风险与争议尽管基因修饰与转基因技术在各个领域取得了巨大的成就，但也伴随着一些风险和争议。

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？

基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物遗传基因，令特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

目前能实现基因敲除的方法有：1.运用基因同源重组进行基因敲除(1)步骤方法A 构建基因载体：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，使之成为重组载体，常用的标记基因有：neo 基因、TK 基因等。

根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。

B获得胚胎干细胞：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔、猪、鸡等的胚胎干细胞也有使用。

基因敲除一般应用于鼠，常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

有些科研机构和单位已经运用C57BL/6遗传背景的小鼠的胚胎干细胞进行基因打靶，广泛运用于免疫学、神经学、癌症等领域。

C同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般来说，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但操作便利。

D筛选已表达的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，因此要从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞。

目前常用的方法有：正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法，其中应用最多的是PNS法。

E 性状观察：通过观察重组小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。