分子生物学-聚合酶链反应(PCR)

2014年12月8日星期一 14
耐热DNA聚合酶包括 TaqDNA聚 合酶、TthDNA聚合酶、VENTDNA聚 合酶和SacDNA聚合酶。其中TaqDNA 聚合酶应用最广泛。 TaqDNA聚合酶 在92.5℃、95 ℃和97.5 ℃时半衰期分 别为40分钟、30分钟和5~6分钟，故 PCR反应中变性温度不宜高于95 ℃。 Taq DNA聚合酶最适温度是72 ℃，较 高温度下的DNA合成错误率较低。因 此，一次加酶可满足PCR反应全过程的 需要，使PCR走向自动化。
2014年12月8日星期一 31
5’ 3
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 年12月8日星期一 2014
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 32
30
2014年12月8日星期一
筑
巢 PCR
筑巢PCR用两对引物进行扩增。第一对引 物（外引物），扩增含目的基因的大片段，再 用第二对引物（内引物）以扩增的大片段为模 板进行扩增的方式，称筑巢PCR。 进行筑巢PCR时，外引物设计得比内引物 长一些，且用量较少，采用较高退火温度使内 引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。待 外引物用尽后，降低退火温度即可直接进行内 引物的扩增。 特点：筑巢PCR扩增时，对目的DNA的特异性 高且适合于极少量模板的扩增。
2014年12月8日星期一 22
延伸温度与时间：
• Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行
2014年12月8日星期一
23
延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间
DNA的合成，无论是在 体内，还是在体外，都是在 DNA聚合酶的作用下，在模 板的指导下合成的。在PCR 反应中的模板，指的是待扩 增的DNA片段。
2014年12月8日星期一 13
模板DNA：模板可以是基因组DNA、质粒 DNA、扩增后的DNA或cDNA等，RNA的扩 增需要首先反转录成cDNA后才能进行正常 PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双 链形式加入PCR混合液。通常小片段模板 DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此 PCR反应前用机械剪切或用稀有限制酶酶解 基因组DNA，以提高产量。PCR反应中模板 加入量一般为102~105拷贝。1μg人基因组 DNA相当于3×105个单拷贝的靶分子；10ng 酵母DNA相当于3×105 靶分子；1ng大肠杆 菌DNA相当于3×105 靶分子。
2014年12月8日星期一 20
引物3’端错配对扩增效率的影响
5’
2014年12月8日星期一
21
PCR反应的缓冲体系：PCR的缓冲液一般 制成10×，含有：500mmol/LKCl; 100mmol/LTris-HCl(pH8.3);15mmol/L MgCl2;0.1%明胶。 使用时稀释10倍。其中Tris-HCl可维持 反应体系的pH， KCl有利于引物的复性， 但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性， 明胶可保护酶不变性失活，Taq酶需要Mg2+， 它会影响反应的特异性和扩增DNA的产率， 因此要将Mg 2+浓度调至最佳。
从变性、退火到延伸一次称为一个 循环，每循环一次产物增加一倍，即以 指数增长。理论上讲，循环次数越多， 产物积累越多。但PCR反应是在酶的作 用下完成的，随着产物的增加，引物和 底物的消耗，使酶促反应越来越慢，达 到所谓的平台期。
2014年12月8日星期一 29
PCR 技术的主要类型
P C R 技 术 的 类 型
靶序列
靶序列
2014年12月8日星期一
5
PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火
2014年12月8日星期一
6
PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸
2014年12月8日星期一
7
第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列
2014年12月8日星期一
8
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
back
36
锚
定
PCR
一般的PCR反应，必须知道模板两侧的序 列，以便设计引物。但在许多情况下，对模 板两侧的序列并不清楚。对这样的模板进行 扩增时，可用锚定PCR技术。这一技术经常其原 理为，在一通用引物反转录产生的第一条 cDNA3’加上同聚物尾（polyG），再用锚定 引物（polyC）和通用引物进行cDNA的扩增。
Polymerase chain reaction
2014年12月8日星期一
1
聚合酶 链反应（polymerase chain reaction），简称PCR技术，是近年来 发展起来的一种选择性体外扩增DNA 或RNA片段的方法。 PCR特点：操作简单；扩增速度快， 可在数小时内使DNA或RNA片段放大 百万倍。 PCR应用：PCR技术已渗透到分子 生物学的各处领域，在分子克隆、遗传 病的基因诊断、法医学等方面得到了广 泛应用。
2014年12月8日星期一 2
PCR的基本原理
细胞中的DNA复制是一个复杂 的过程。参与复制的因素有多种。 PCR是在试管中进行的DNA复制反应 （在体外模拟DNA复制反应），基本 原理与细胞内DNA复制相似，但反应 体系相对较简单。
2014年12月8日星期一
3
2014年12月8日星期一
4
PCR 循环 – 第一步 – 加热变性
PCR实验中应注意的事项： 由于PCR反应具有极强的扩增能力和检 测的灵敏性，微量的样品污染便有可能导致 假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨 防污染的发生，并设臵严格的对照，以提高 PCR结果的正确性。常采用的措施有（1） 隔离不同操作区，包括样品制备区；PCR操 作区；反应产物分析区等；（2）对于所用 试剂必须分装，以减少重复取样所致的污染； （3）采用一次性吸头和加样器进行PCR取 样和加样操作，样品制备应严格按无菌操作 原则进行。
–常用温度为72℃ –过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定
–1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） –3～4kb的靶序列需3～4min –扩增10Kb需延伸至15min
• 延伸进间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
2014年12月8日星期一 24
PCR温度循环参数：
PCR反应中，变性温度一般为90~95 ℃。 变性所需的时间取决于DNA的复杂性，多 用94 ℃30秒对模板DNA进行变性，过高的 温度及过长的时间会降低Taq酶的活性。引 物的退火温度通过Tm=4（G+C）+2 （A+T）计算得到，一般55~80 ℃30秒。 延伸温度选在70~75 ℃之间，此时Taq酶 的活性最高。延伸反应的时间根据扩增片 段的长度而定，一般1kb以内延伸一分钟， 更长的片段需相应延长时间。PCR的循环次 数取决于模板 DNA 的浓度一般 20~30 次。 26 2014年12月8日星期一
2014年12月8日星期一 27
为防止PCR过程中出现假阳性，应设 臵以下几个对照： （1）阳性对照：阳性DNA模板参与的 PCR反应； （2）阴性对照：阴性DNA模板参与 的PCR反应； （3）试剂对照：不含任何DNA模板， 但具有所有反应试剂的PCR反应。
2014年12月8日星期一 28
PCR循环次数与产物的积累：
6 cycle = 64 Amplicon
6 20 30
7 cycle = 128 Amplicon
2014年12月8日星期一
2014年12月8日星期一
10
PCR扩增过程图示
2014年12月8日星期一
11
典型PCR反应体系
复制模板 耐热DNA聚合酶 引物 缓冲体系 底物
2014年12月8日星期一 12
18
（6）引物3’端碱基是引发延伸的起点， 因此一定要与模板DNA配对。引物3’ 端最佳碱基选择是G和C。因为它们形 成的碱基配对比较稳定。 （7）引物浓度，引物的浓度一般为 0.1~0.5μmol/L，引物浓度偏高会引 起错配和非特异性产物扩增。
2014年12月8日星期一
19
引物3’端错配对扩增产物的影 响是有一定规律的。在标准反应体系 中用2U TaqDNA聚合酶和 200μmol/LdNTP,以质粒（103个拷 贝）为模板，按95 ℃，25秒；55 ℃， 25秒；72 ℃，1分钟的循环参数扩增 HIV-1 gag区时，引物3’端错配对扩 增效率的影响为：
2014年12月8日星期一 34
不 对 称
PCR
不对称PCR是一种快速制备单 链DNA的技术。目前DNA测序时， DNA样品常用这种方法制备。 不对称扩增时，两条引物链的 比例相着较大，当较少的引物用尽 后，再进行扩增时，所得到的扩增 产物，全部为单链DNA产物。
2014年12月8日星期一 35
2014年12月8日星期一
2014年12月8日星期一 16
（2）引物中的碱基组成尽可能随机分布， 避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。尤 其是引物的3’端不应有连续3个G和C。 使引物在模板的G+C富集序列区错误配 对。G+C含量在引物碱基中一般占 40%~60%。设计引物时要考虑3’端和5’ 端具有相似的Tm值，按引物的碱基组成 计算Tm值的公式为： Tm值=4（G+C）+2（A+T）
No. of Cycles 1 2
No. Amplicon Copies of Target 2 4