核糖体展示技术
抗体药物的研究现状和发展趋势
抗体药物的研究现状和发展趋势一、研究现状1．抗体研究发展历程抗体作为药物用于人类疾病的治疗拥有很长历史。
但整个抗体药物的发展却并非一帆风顺，而是在曲折中前进。
第一代抗体药物源于动物多价抗血清，主要用于一些细菌感染性疾病的早期被动免疫治疗。
虽然具有一定的疗效，但异源性蛋白引起的较强的人体免疫反应限制了这类药物的应用，因而逐渐被抗生素类药物所代替。
第二代抗体药物是利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。
单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在实验研究和疾病诊断中得到了广泛应用。
单抗最早被用于疾病治疗是在 1982 年，美国斯坦福医学中心 Levy 等人利用制备的抗独特型单抗治疗 B 细胞淋巴瘤，治疗后患者病情缓解，瘤体消失，这使人们对抗体药物产生了极大的期望。
1986 年，美国 FDA批准了世界上第一个单抗治疗性药物——抗 CD3单抗 OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。
此时抗体药物的研制和应用达到了顶点。
随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显。
同时一些抗肿瘤单抗未显示出理想效果。
人们的热情开始下降。
到 20 世纪 90 年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症失败使得抗体药物的研究进入低谷。
由于大多数单抗均为鼠源性，在人体内反复应用会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而降低疗效，甚至可引起过敏反应。
因此，一方面在给药途径上改进，如使用片段抗体、交联同位素、局部用药等使鼠源性抗体用量减少，也增强了疗效；另一方面，积极发展基因工程抗体和人源抗体。
近年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明， DNA 重组技术开始用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造以消除抗体应用不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备各种形式的重组抗体。
抗体药物的研发进入了第三代，即基因工程抗体时代。
与第二代单抗相比，基因工程抗体具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据治疗的需要，制备新型抗体；④可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。
全人源单克隆抗体体外亲和力成熟的策略
全人源单克隆抗体体外亲和力成熟的策略作者：徐金兵刘煜来源：《医学信息》2014年第20期摘要：单克隆抗体已广泛地应用于临床治疗。
人源化的单克隆抗体是目前已上市的治疗性抗体的主要形式。
不管是来源于杂交瘤细胞还是噬菌体展示库的抗体，其亲和力在治疗应用上可能都需要改善。
抗体体外亲和力成熟是解决这一问题的重要途径。
作者将就全人源单克隆抗体亲和力成熟的策略方面进行综述。
关键词：单克隆抗体；抗体体外亲和力成熟单克隆抗体自问世以来，由于其独有的特征已迅速应用于医学很多领域。
其中人源化的单克隆抗体是目前已上市的治疗性抗体的主要形式。
目前获得全人源单克隆抗体的方法主要是抗体库技术和转基因技术。
但是以上方法获得的抗体治疗效果一般很难达到最佳水平，因此需要在体外进行亲和力成熟以期达到临床应用的要求。
抗体的体外亲和力成熟是基于体内的亲和力成熟突变和选择的原则。
体外亲和力成熟主要包括以下两方面：对低亲和力抗体可变区基因进行突变的引入；有效的筛选方法。
本文综述了基于分子水平的全人源单克隆抗体体外抗体亲和力成熟的研究进展、该领域的研究现状以及今后可能的发展方向。
1突变的引入进行体外亲和力成熟的首要任务就是获得大量突变体。
因此，突变引入策略的选择在体外亲和力成熟中十分关键。
1.1致突变细胞株使用大肠杆菌突变细胞在目的DNA序列上随机引入突变的方法来进行抗体亲和力成熟已经被成功使用过了。
大肠杆菌突变细胞比正常细胞造成的单碱基替换要高105倍，因为该细胞在DNA复制时期缺失校正性外切酶的活性。
但是运用这个方法一般需要反复选择再放大，需要至少4~10轮连续的细菌培养和筛选过程，其周期和工作量非常大。
1.2易错PCR易错PCR(error-prone PCR)经常被用来随机突变产生突变体。
这项技术基于分子生物学建立的标准PCR技术上进行修改来改变和提高聚合酶错误率。
易错PCR的不同在于通过改变反应缓冲液的组成来改变Taq DNA 聚合酶。
mRNA展示技术ppt课件
人们已利用这种新的技术鉴定了许多功能性 多肽，包括 RNA 结合肽、TNF-α 结合因 子等，建立了以 mRNA 体外展示技术筛选 与抗肿瘤药物的重要靶酶———胸苷酸合 成酶mRNA高度亲和多肽的方讨
Structure of mRNA-linker
体积25ul,其中含10xPCR缓冲液2.5 u凝胶载体上，然后加入 400ul
洗涤5~6遍后，加入洗脱液(无酵母 tRNA) 及
mRNA展示技 术
应用：
CAT(Cambridge Antibody Technology) 应用体外展示技术制备单克隆抗体用于疾 病的治疗：
D2E7 ABT-874 CAT-192and GC1008
CAT-5001 (formerly SS1P)
目前应用的组合多肽/蛋白质库技术包括 噬菌体展示技术(phage display) 酵母双杂交 与核糖体展示技术(ribosome display，RD) mRNA体外展示技术( mRNA display)
基本原理：借助一种蛋白质合成 抑制剂嘌呤霉素(puromycin)来 形成mRNA- 蛋白质融合体，从 而实现基因表型 (RNA)与蛋白质 表型(多肽) 的结合. 嘌呤霉素是 一种模拟子的3’端，当 mRNA 翻译完成时，嘌呤霉素进入核糖 体的 A 位点接纳新生肽，抑制蛋 白质翻译，在多肽与嘌呤霉素的 O- 甲基酪氨酸之间形成稳定的 酰胺键，生成肽酰嘌呤霉素复物， 而使mRNA3 ’端和蛋白质的羧基 端通过嘌呤霉素分子共价地联系 在一起。
DNA展示技术
mRNA体外展示又称mRNA- 蛋白质融合体 展示(mRNA-protein fusion display)，是 近年来发展的一种高效多肽选择技术。 它可以由大容量的多肽库中(1013 ~1015 个分子)获得具有特定生物学功能的多肽分子. 与噬菌体和核糖体展示技术相比，mRNA 体 外展示技术具有多肽库容量大、筛选方法简 便等优点，特别适用于获得小分子功能性多 肽
比较三代抗体在制备和应用方面的优缺点
比较三代抗体在制备和应用方面的优缺点摘要：抗体技术的发展主要经历了三个时期，相应产生了三代抗体：多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。
多克隆抗体技术即免疫血清制备技术较简便，但免疫血清特异性较低。
自从第一个单克隆抗体产生以来，单抗已广泛地应用于疾病的诊治上。
为了克服传统的鼠源性单抗存在的弊端，随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，基因工程抗体技术取得了比较大的进展，包括对鼠源性单抗的改造、人源性单抗的研制及对抗体分子结构和功能的改造，尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠技术为代表的人源性单抗制备技术的研制最为瞩目。
本文就三代抗体在制备及应用方面的优缺点作了简单的比较。
关键词：多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
抗体技术的发展主要分为三个时期，1890年Emil A. V. Behring等发现白喉抗毒素，并用于人工被动免疫，第一代抗体——多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb)，继而产生。
第二代抗体于1975年，Köhler和Milstein创建杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体(Moclonal antibody, McAb)，单克隆抗体是均质的异源抗体。
20世纪80年代采用基因工程的手段研制抗体及其与功能的关系，并对抗体基因进行改造和重组等，而制备出的抗体为基因工程抗体（Genetic engineering antibody, GEAb），即第三代抗体。
[1]一、多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb)1、免疫血清的制备（1）抗原的制备制备多克隆抗体对抗原纯度要求十分严格。
抗原越纯，获得抗体的特异性越高，要求至少达到电泳纯或色谱纯。
（2）佐剂（Adjuvant）的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
皖西学院生物工程专业大三蛋白质与酶工程复习题及答案
皖西学院生物工程专业大三蛋白质与酶工程复习题及答案蛋白质与酶工程课程复习题一．名词解释：1.蛋白质工程概念:通过基因工程技术或化学修饰技术改造现有蛋白或组建新型蛋白的现代生物技术、2.蛋白质的一级结构；蛋白质多链中氨基酸残基的排列顺序3.蛋白质的二级结构：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元5.β－折叠:是蛋白质中的常见的二级结构，是由伸展的多肽链组成的。
6.α－螺旋:是蛋白质分子的一种基本结构7.超二级结构:在蛋白质分子中，特别是球状蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（即α—螺旋、β—折叠片和β—转角等）彼此相互作用组合在一起，，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件单元，称超二级结构。
8.三级结构是指球状蛋白质的多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使β－折叠α－螺旋和无规则卷曲等二级结构相互配置而形成特定的构象。
9四级结构指由相同或不同的称作亚基（ubunit）的亚单位按照一定排布方式缔合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。
10蛋白质折叠:蛋白质可凭借相互作用在细胞环境（特定的酸碱度、温度等）下自己组装自己11蛋白质变性:是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。
12蛋白质复性:、13回拆:所连接的肽链发生180°的反相弯曲14第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在的对应关系15分子伴侣:是一类相互之间有关系的蛋白，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行非共价健的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常生物学功能的永久组成成分、蛋白质的化学修饰:凡通过活性基团的引入或除去，而使蛋白质一级结构发生改变的过程、19模拟酶:就是利用有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分子，可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性、20生物传感器—将生物体的成份（酶、抗原、抗体、DNA、激素）或生物体本身（细胞、细胞器、组织）固定化在一器件上作为敏感元件的传感器。
分子生物学试题试卷3
一、名词解释1.SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。
2.E位点：是脱氨酰tRNA(deaminoacyl-tRNA)离开A位点到完全从核糖体释放出来的一个中间停靠点，只是作暂时的停留。
当E位点被占据之后,A位点同氨酰tRNA的亲和力降低,防止了氨酰tRNA的结合,直到核糖体准备就绪,E位点腾空,才会接受下一个氨酰tRNA3.P位点：即肽酰tRNA位点(peptidyl-tRNA site), 又叫供位(donor site), 或肽酰基位点,主要位于大亚基, 是肽基tRNA移交肽链后肽酰tRNA所占据的位置, 即与延伸中的肽酰tRNA结合位点。
4.A位点：即氨酰基位点，是与新掺入的氨酰tRNA(aminoacyl-tRNA )结合的位点，又叫受位(entry site)，主要位于大亚基，是接受氨酰tRNA的部位5.Kozak序列：是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是ACCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。
对应于原核生物的SD序列。
6.内部核糖体进入位点：缩写IRES，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能。
通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5‘端开始，因为翻译起始必须依赖于5’端的帽子结构。
一般来讲，内部核糖体进入位点通常位于RNA病毒基因组的5’非翻译区（UTR），这样病毒蛋白的翻译就可以不依赖于5‘帽子结构。
7.上游可读框：mRNA前导序列中的可读框，可作为顺式调节元件将mRNA的翻译速率与氨基酸水平相偶联8.分子伴侣：是细胞中一大类蛋白质，是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分9.核定位序列(Nuclear localization sequence)：蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。
09135蛋白质工程
《蛋白质工程》课程（09135）教学大纲一、课程基本信息课程中文名称：蛋白质工程课程代码：09135学分与学时：2学分38学时课程性质：专业选修授课对象：生物工程专业二、本课程教学目标与任务蛋白质工程是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学等的发展密切相关，是融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。
由于蛋白质工程学科的边缘性，所以本课程在介绍蛋白质基本内容的同时，兼顾学科发展动向，旨在使学生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。
通过本课程的学习，使学生掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在蛋白质工程上的应用及典型研究实例，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。
努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，为未来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。
三、学时安排四、课程教学内容与基本要求第一章绪论教学目的：使学生了解蛋白质工程的基本概况。
基本要求：理解掌握蛋白质工程研究内容和蛋白质工程设计的原理。
重点与难点：蛋白质工程的原理，蛋白质工程的程序和操作方法。
教学方法：课堂讲授为主。
主要内容：一、蛋白质工程的物质基础二、蛋白质工程的原理三、蛋白质工程的程序和操作方法四、蛋白质工程的产生与发展五、蛋白质工程的应用领域第二章蛋白质结构基础教学目的：使学生理解蛋白质的结构与功能及二者之间的关系，理解蛋白质多肽链的折叠方式。
基本要求：要求掌握蛋白质各个结构层次的组成、基本特点和维持结构的作用力、结构与功能的关系。
蛋白质的变性和复性、蛋白质的折叠以及分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠中的作用。
重点与难点：重点：蛋白质的结构与功能，蛋白质结构与功能的关系。
难点：多肽链的折叠。
基因工程抗体研究进展
・综述与专论・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第10期基因工程抗体研究进展李菁林彤宋帅高闪电邵军军丛国政独军政常惠芸(中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州730046) 摘 要: 随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。
基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。
关键词: 基因工程抗体人源化抗体小分子抗体核糖体展示Advances i n Geneti c Engi n eer i n g Anti bodyL i Jing L in Tong Song ShuaiGao ShandianShao JunjunCong GuozhengDu Junzheng Chang Huiyun(Key Laboratory of Ani m al V irology of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,N ational F MD Reference Laboratory,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Acade m y of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046) Abs trac t: W ith the devel opment of research in molecular bi ol ogy and structure,functi on of antibody,antibody was rebuild by celland genetic engineering and had a ne w functi on,theref oreit was app lied in many fields,which attribute the devel opment of monocle anti 2body .Genetic engineering antibody was reasse mbled under design,which reserve and increase the s pecificity and bi ol ogic activity of nat 2ural antibody,re move and decrease the irres pective structure,getting rid of the defecti on of monocle antibody in clinical app licati on .Key wo rd s: Genetic engineering antibodyHu manized antibody M icr omolecular antibody R ibos ome dis p lay收稿日期:2009204223基金项目:国家科技支撑计划(2006BAD06A14,2006BAD06A10)作者简介:李菁(19832),女,在读硕士,研究方向:分子病毒学;E 2mail:lj w y831114@通讯作者:常惠芸(19652),女,博士,研究员,主要从事口蹄疫病毒分子生物学和免疫学研究工作;E 2mail:changhuiyun@ 抗体在生物医学领域中的应用极为广泛,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。
酶工程题库及答案
酶工程题库及答案一、单选题（共40题，每题1分，共40分）1、动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等，一般加入（）就可以满足要求。
A、葡萄糖B、无机盐C、血清D、维生素正确答案：C2、搅拌罐反应器中进行某酶催化反应，反应液体积为5立方米，反应液温度从20℃升至40℃，热利用率为80%，反应过程中实际所需热量为（）kcal。
A、80B、125000C、125D、80000正确答案：B3、电泳分离蛋白质的依据是（）A、蛋白质溶液为亲水胶体B、蛋白质紫外吸收的最大波长280nmC、蛋白质分子大小不同D、蛋白质多肽链中氨基酸是借肽键相连E、蛋白质是两性电解质正确答案：E4、葡萄糖氧化酶可以用于食品保鲜，主要原因是通过该酶的作用可以（）。
A、杀灭细菌B、除去氧气C、生成过氧化氢D、生成葡萄糖酸正确答案：B5、有机介质中酶催化的最适水活度是（）。
A、酶催化反应速度达到最大时的水活度B、酶活力到最大时的水活度C、底物溶解度达到最大时的水活度D、酶溶解度达到最大时的水活度正确答案：A6、必需水是指（）。
A、维持酶催化反应速度所必需的最低水量B、维持酶分子催化能力所必需的最低水量C、维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量D、酶催化反应速度达到最大时所需的水量正确答案：C7、在进行易错PCR时，提高镁离子浓度的作用是（）。
A、稳定互补的碱基对B、稳定非互补的碱基对C、增强酶的稳定性D、减弱酶的稳定性正确答案：B8、有些酶在细胞进入平衡期以后还可以继续合成较长的一段时间，这是由于（）。
A、该酶所对应的mRNA稳定性好B、该酶所对应的DNA稳定性好C、细胞自溶后使酶分泌出来D、培养基中还有充足的营养成分正确答案：A9、制备酵母原生质体时主要采用（）A、溶菌酶B、果胶酶C、B-1，4葡聚糖酶D、B-1，3葡聚糖酶正确答案：D10、以下关于酶在疾病诊断方面的应用，错误的是（）。
A、酸性磷酸酶可用于测定尿素含量，从而诊断肝脏、肾脏病变B、检测体细胞内端粒酶活性，可用于诊断细胞是否发生癌变C、利用葡萄糖氧化酶可检测血糖含量，进行糖尿病的诊断D、血清中转氨酶的活性变化，可用于肝脏疾病的诊断正确答案：A11、RNA剪切酶是（）。
单克隆抗体基础知识
1 .在肿瘤治疗方面的应用: 单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不
良反应。如2005年我国开发出癌症治疗药——重组人 源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生
联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高
30%以上。
2 .在器官移植中的应用: 近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐
人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段
（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力
，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。
全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用 。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬 菌体显示技术（phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenic mouse）和单个B
——进行SDR移植改良
嵌合抗体
人源化抗体
3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody)
在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密 切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一 步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗 体潜在的免疫原性降至最低。
4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody)
药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆 抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗
利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立
利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立摘要：核糖体展示(ribosome display)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具。
利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示。
筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质：人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmic domain of erythrocyte membrane protein Band 3，Cdb3)作为模式分子，希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因．用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建，通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件。
在亲和筛选步骤后，只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因，而不能利用对照牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)筛选得到，从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用。
关键词：核糖体展示；体外筛选；功能性蛋白；锚蛋白；红血球膜带3蛋白核糖体展示是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具。
首先，Mattheakis等人建立了一种用于能够展示和筛选肽的体外系统，随后由Hanes和Pluckthun等人正式建立了这种功能性蛋白体外筛选技术。
迄今为止，这一技术已经被成功地应用于体外筛选与靶分子有亲和能力的功能性分子的相关领域。
与其他的体内蛋白质筛选系统不同的是，核糖体展示库的建立不需要细菌转化步骤，其展示库的多样性能够得到充分保留。
在特定的反应条件下，蛋白质基因型和表型可以通过mRNA-核糖体-蛋白质三联体复合物的形式联系起来．构建的核糖体展示DNA库中，可能包含有编码靶蛋白例如功能性蛋白的DNA分子。
DNA库在体外进行转录，转录后的mRNA纯化后可用于体外翻译，由于构建的mRNA分子缺乏终止子，核糖体会与mRNA的末端保持结合状态从而形成mRNA-核糖体，蛋白质三联复合物，在高浓度镁离子和低温条件下该复合物非常稳定。
核糖体展示技术
优点
• 作为一种体外展示技术，mRNA具有多 肽库容量大、筛选效率高、操作简便等 共同特点。反转录的cDNA/mRNA的杂交 双链，避免了RNA二级结构、三级结构 对体外筛选的干扰。
应用
• 主要应用于发现RNA、小分子、蛋白质 等新的蛋白质配体和阐明蛋白质与药物 在细胞中的相互作用机制。其他可能的 特殊技术主要有两类:
体内筛选技术，如噬菌体展示技术、选择性感 染噬菌体技术等。 体外筛选技术，如核糖体展示技术mRNA展示 技术
传统筛选技术的缺陷：
1必须经过细菌转化的步骤 2抗体库的容量不能超过1010 3而且在表达某些候选抗体分子时,大肠杆菌宿主 菌的生长被抑制或者由于其毒性作用而不能生长, 导致亲和筛选的偏差 4另外,亲和筛选时,具有极高亲和力的抗体分子与 抗原结合后,很难被洗脱,所以无法捕获其编码基 因。 5采用噬菌体展示技术进行抗体分子定向进化时, 除了以上各种限制之外,基因突变与表型筛选之间 的转换也很烦琐。
核糖体展示技术分类
• 1997年Pluckthun提出的以RNA-核糖体蛋白质三聚体形式的核糖体展示技术 • Roberts等设计的mRNA-多肽融合技术 • 2002年zhou JM等改进的核糖体失活展示 技术
核糖体展示技术的基本流程
First generation
mRNA-多肽融合技术的基本流程 Second generation
背景
研究证实： 体外翻译时,蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行； 与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。 1997年, Pluckthun实验室在以上研究成果 的基础上,建立了体外筛选完整功能蛋白的新技术 ——核糖体展示技术。
核糖体筛选技术
定义：核糖体展示技术是一种筛选蛋白质强 有力的工具,通过将基因型和蛋白表型联系在 一起核 糖 体 展 示 技 术
利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒单链抗体基因
２ 剖检 变化
尸体外观消瘦 、肝脏严重变性 、坏死 、肿大、色黄、质脆 、
防大肠 杆菌 感染 ，肌 肉注射 ２ ％痢 菌净 １ ０ ｍ ｌ 。
５ 小结与讨论
全身粘膜和皮下肌 肉可见出血点和出血斑 、胃肠粘膜有出血性炎 ５ ． １ 诊 断 症。 根据饲料分析 、剖检变化、实验室诊断，我们认为此猪场发 生二元育肥仔猪死亡病情是 由于饲喂了发霉变质麦麸引起 的黄曲 ３ 实验室诊断
中国畜牧兽医文摘
２ ０ １ ３ 年
２ ９ 卷
第ｌ 期
临 床 兽 医
仔 猪 黄 曲霉毒 素 中毒 的病 例报 告
何 维 坚
（ 广东省大埔县银江镇畜牧兽 医站 ，大埔 ５ １ ４ ２ ６ １ ）
２ ０ １ １ 年６ 月 ，梅州 市 属某 养猪 场 二元 育肥 仔 猪发 生病 情 ，１ ０ ｄ ３ ． ２ 病 料 涂 片 取病变肝组织接种于氯化钠琼脂培养基上，置３ ０ ℃培养２ ｄ 内死 亡 ｌ ５ 头 。兽 医站 相关 人 员 通过 现 场调 查 、病 理 解 剖 、实 验 室 检查确诊为黄曲霉毒素中毒 ，经及时治疗控制了病情 ，现将病情 后 ，长出白色或黄色绒毛状霉素 ，镜检与饲料 中霉素一致。 报 告如 下 。
霉 素 中毒病 。 ３ ． １ 饲料取样培 养 从 饲 喂 麦麸 各 部 随 机 取样 １ ０ 份 ，每份 约 １ ０ ｇ ，放 于无 菌 平 皿 ５ ． ２ 临床注意事项 中 ，用 ７ ５ ％酒 精处 理 １ — ２ ｍ ｉ ｎ ￣ Ｉ 无 菌蒸 馏水 荡洗 后 ，取 饲料 或浸 液 仔猪黄曲霉素中毒容易误诊为大肠杆菌病故诊断时不可忽视 分 点 接种 于 ７ ． ５ ％氯 化钠 琼 脂 培养 基上 ，每块 平 板 接种 ７ —８ Ａ 。 置 对 饲料 的分 析 。 ３ Ｏ ℃培 养４ ８ ｈ 后 ，１ Ｏ 块 平 板共 ６ ５ 个 接种 点 上 有霉 菌 生 长 。菌 落 为 ５ ． ３ 对 症 治 疗 增强肝脏的解毒能力，改善血液循环 ， 长 菌落 颜 色逐 渐 变 黄 。取培 养 物 深
《核糖体展示技术》课件
术。
3
应用领域拓展
将核糖体展示技术应用于更广泛的领域， 如生物传感、肿瘤治疗等。
核糖体展示技术的成功案例
抗体筛选
酶选择
核糖体展示技术在抗体筛选领域 取得了重要突破，加速新药研发。
利用核糖体展示技术可快速筛选 高效酶催化剂，推动生物催化领 域的发展。
蛋白质相互作用
核糖体展示技术帮助研究人员解 析了许多重要蛋白质相互作用的 机制。
3 局限性
目前主要适用于细胞外展 示，对细胞内蛋白质的展 示仍存在挑战。
核糖体展示技术的应用领域
抗体研发
通过核糖体展示技术可以高效筛选出与特定抗原相互作用的抗体。
药物研发
核糖体展示技术可用于筛选小分子药物的靶点并优化药物特性。
生物催化
利用核糖体展展示技术的优势和局限性
总结和展望
1 总结
核糖体展示技术是一种创新的蛋白质工程技 术，具有广泛的应用前景。
2 展望
未来，核糖体展示技术将继续改进和发展， 为蛋白质工程领域的研究和应用提供更多可 能。
《核糖体展示技术》PPT 课件
核糖体展示技术是一种创新的蛋白质工程技术，通过利用核糖体作为生物反 应器，实现外源蛋白质在细胞表面展示和筛选。
核糖体展示技术简介
1 原理
利用核糖体的翻译系统将 目标蛋白与其编码RNA相 连接，使得目标蛋白通过 核糖体生长来展示在细胞 表面。
2 优势
高通量、高灵敏度，可应 用于抗体筛选、药物研发 等领域。
优势
• 高通量、高灵敏度 • 可应用于多个领域 • 稳定性高，易于操作
局限性
• 目前适用于细胞外展示 • 对细胞内蛋白质的展示仍有挑战 • 技术需要进一步改进和优化
核糖体展示技术的未来发展方向
2021目前单克隆抗体药物研发的一般流程范文1
2021目前单克隆抗体药物研发的一般流程范文 国家十二五规划中明确提出:增强新药创制能力,加快单克隆抗体药物的研究,重点开发治疗恶性肿瘤的抗体药物,突破生物技术药物产业化的技术瓶颈,开发自主知识产权产品,抢占世界生物技术制药的制高点.笔者主要总结了目前单克隆抗体药物研发的一般流程,为发现、降低研发技术风险提供参考. 1背景与现状 随着当前工业化、城市化、老龄化进程的不断推进,生态环境的恶化和生活压力的不断加大,恶性肿瘤的发病率越来越高.近20年来我国癌症有年轻化趋势,发病率和死亡率"三线"不断走高,每年新发肿瘤病例约为 312 万例,平均发病率为 285. 91 /10万,平均每分钟有 6 人被诊断为恶性肿瘤. 恶性肿瘤的严重性导致肿瘤治疗的需求不断增加,抗肿瘤药物的种类不断增加,药物市场迅猛发展.2007年以来,抗肿瘤药物一直是全球医药市场的领头羊,目前全球流行的抗肿瘤药物主要是生物药物、靶向小分子药、激素等.单克隆抗体(McAb,简称单抗) 技术又被称为肿瘤"生物导弹",是能直接导向肿瘤的药物[ 1 - 2 ].单抗抗肿瘤药物以其良好的临床效果和极佳的生物靶向性,稳居抗肿瘤药物的前 3 位[ 3 ].2007 年至2011 年全球抗肿瘤药物销售总额前 5 名中,利妥昔单抗 291. 65 亿美元,贝伐单抗261. 3 亿美元,曲妥珠单抗 247. 33 亿美元,伊马替尼 195. 88 亿美元,亮丙瑞林116. 89 亿美元.可见,2007 年到 2011 年抗肿瘤药物的销售额巨大,排名前 3 位的都是以单抗技术制备的抗肿瘤药物.2012 年,利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗的销售额分别达到了 56. 22 亿、58. 89 亿和 57. 64 亿瑞士法郎,占其制药公司药品收入比重的 16% ,17% 和 16%[ 4 ]. 单抗肿瘤药物的市场需求巨大,形成鲜明对比的是,我国单抗抗肿瘤药物研发能力的薄弱.单抗抗肿瘤药物的研发壁垒高,我国单克隆药物技术和国外先进水平有很大差距.单抗抗肿瘤药物的巨大市场需求和国内现阶段的技术发展水平,促使我们必须降低新药的研发风险,增强单抗抗肿瘤药物的研发能力. 2研发的一般流程及风险分析 2.1肿瘤靶点的发现和选择 新药的研发过程时间较长.据美国食品药物管理局(FDA)统计,一种新药从研发到最后投入市场平均需要 12 年,其中实验室研究阶段需占用约 5 年时间[ 5 ].药物靶标是新药研发的基础,单抗抗肿瘤药物研发正是要找到相关肿瘤靶点,才能研制出针对肿瘤疾病的抗体药物.单克隆抗体药物出现的 30 多年来,针对抗肿瘤药物的靶点,已经研制出多种单抗药物.目前已发现的肿瘤靶点和肿瘤药物如表 1 所示[ 6 - 8 ].对未知靶点研究的缺乏制约着单抗抗肿瘤新药的研发,随着以基因工程和分子生物学为代表的生物技术的发展,使针对靶点的高通量筛选成为可能,肿瘤靶点的研究不断深入,靶点集中于细胞死亡通路、血管生成、细胞周期调控信号转导等方面[ 9 ].目前国内单抗抗肿瘤药物靶点的发现主要基于 3 个纵向层次的研究,即基因水平、转录水平和蛋白水平的靶点发现[ 10 ]. 基因水平的单抗药物靶标发现:从基因库中搜寻,人类基因组的不断发展,扩大了新基因的筛选范围,根据建立的基因数据库,通过计算机模拟,就会增加药物靶标发现的概率; 基因芯片技术,利用核酸杂交和碱基互补配对,用大量生物分子检测样品的遗传信息,筛选药物靶标[ 11 ]; 基因敲除技术,是指对 1 个结构已知而功能未知的基因,从分子水平上设计试验,将该基因去除或用其序列相近的基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能,发现药物的相关靶点. 转录水平的单抗药物靶标发现:主要分为反义寡核苷酸技术和 RNA 干扰技术,对于单抗抗肿瘤药物运用最广泛的是 RNA 干扰技术.该技术能特异、高效地抑制基因表达,引起功能表型丢失,可以确定相应蛋白质功能,快速有效地鉴别药物新靶点. 蛋白水平的单抗药物靶标发现:噬菌体展示技术,利用肿瘤外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异性亲和作用,将特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集,然后通过测序分析噬菌体表面展示的蛋白结构,发现可与药物特异性结合的靶点; 蛋白芯片技术,是以蛋白质代替 DNA 作为检测对象,测基因的表达和蛋白分子间的相互作用,以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子;三杂交系统,利用蛋白质间的相互作用,可检测出与特定小分子作用的蛋白,从而发现肿瘤靶点. 目前靶点发现存在的困难可总结为以下几个方面:基因水平筛选的风险主要来自于基因技术发展还不成熟,对所有基因的作用不明了导致获得靶点的效果不理想[ 10 ]; 转录水平筛选的风险主要来自 RNA 干扰技术,该技术在肿瘤细胞中转染效率较低,动物体内和人体内结果的相似性有待考察,在特异性设计上还有较大难度[ 12 ]; 蛋白水平筛选风险来自噬菌体展示的容量大小,特异性检测水平的程度以及筛选后蛋白功能具体测定的精确度[ 13 ]. 2.2单抗抗肿瘤药抗原制备 靶点明确之后,就可以进入抗原的制备阶段.根据特异性的不同,肿瘤抗原可以分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原;根据抗原种类的不同,可分为天然蛋白质抗原、基因重组抗原、合成性抗原和小分子半抗原.就抗体制备而言,天然抗原的效果最好,运用反复冻融法、超声破碎法等直接从肿瘤标本中分离抗原; 基因重组抗原是指将目的基因插入载体,在原核或真核系统中表达,获得相应抗原; 合成性抗原是根据蛋白的氨基酸序列,通过抗原表位分析找到抗原性好的多肽片段,通过固相合成制备抗原; 小分子半抗原分子量较小,免疫原性较弱,必须与载体连接之后才能产生免疫应答反应. 制备出的抗原,根据性质可分为颗粒型抗原和可溶性抗原,可溶性抗原要添加佐剂增强免疫原性.从纯度上来说,虽然要求不高,但高纯度的抗原能提高抗体获得的可能性.目前纯化抗原的定性鉴定的常用方法有亲和层析法、双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酞胺凝胶电泳等.纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法[14 ]. 2.3抗肿瘤单克隆抗体制备 2.3. 1杂交瘤技术 单克隆抗体制备的基本原理是,致敏的B 淋巴细胞能分泌特异性抗体,但这些细胞不能在体外存活.骨髓瘤细胞可在体外大量繁殖的 HGPRT 缺陷株,但不能分泌特异性的抗体.将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的 B 淋巴细胞融合,则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性,又具有 B 淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力.由于每个致敏的 B 淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体,所以克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一抗原决定簇的单克隆抗体[ 15 ].国内杂交瘤技术生产抗体的技术相对较为成熟,主要包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、目的抗体检测、杂交瘤细胞的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单抗的鉴定( 包括纯化、效价测定、亚型测定、染色体数目检测、特异性检测、结合位点和亲和力检测) 等环节[ 16 - 17 ]. 杂交瘤技术对于单抗药物的研发有着划时代的意义,但随着研究的深入,其自身特点就为单抗抗肿瘤药物的研发带来了风险:通过人肿瘤细胞免疫动物,不能产生足够量的抗体,人和以小鼠为代表的实验动物有很高的同源性,功能性蛋白易造成耐受状态; 另一方面,人和动物的同源性还是有一定的区别,动物产生的抗体所带有的免疫原性引起的 HAMA 反应又是人用药所不能忽视的. 2.3. 2抗体人源化技术 在基因工程快速发展之前,单克隆抗体的制备到杂交瘤细胞筛选出阳性克隆、检测抗体亲和力和特异性为终点.但严重的免疫原性制约了单抗抗肿瘤药物的发展,基因工程的快速发展推动了抗体药物的人源化改造,在鼠源抗体上进行人为改造并获得成功.贝伐单抗、西妥昔单抗等都是通过人源化改造所得,在肿瘤临床的效果和市场效益方面取得了巨大成功[18 ].抗体人源化改造包括 2 种,即嵌合抗体和改型抗体. 嵌合抗体:是最先出现的人源化单克隆抗体,其可变区来自鼠单克隆抗体,恒定区来自人的单克隆抗体.国内普遍采用的技术是从制备好的杂交瘤分离出功能区基因,插入适当的表达载体中,获得人源化嵌合抗体[ 19 ].一般用 PCR 方法将鼠源单抗 V 区基因克隆,与带有人 CL 区和 CH 区的载体相拼接,构建嵌合抗体蛋白载体,将表达载体转染到同一哺乳动物细胞内表达.嵌合抗体制备抗肿瘤药物过程中的风险不能忽视,嵌合抗体保留的鼠抗体的可变区占整个抗体结构的 30% ,仍能引起较强的免疫原性,解决HAMA 反应的效果并不理想,同时还引起了抗嵌合抗体反应(HACA)[ 20 ].这一风险直接制约了嵌合抗体技术研发抗肿瘤药物的前景.此外,国内技术的不成熟会导致人源化抗体的特异亲和力降低,抗体表达产量、表达载体的构建也是影响嵌合抗体成药前景的风险因素. 改型抗体:在嵌合抗体的制备过程中,又引进了重构抗体技术和表面重塑技术以提高抗体的人源化,形成人源化更高的改型抗体[ 21 ].改型抗体,又称互补决定区(CDR ) 移植抗体,是把鼠单抗的 CDR 移植到人单抗的骨架区(FR) 构建而成的抗体[ 22 ]; 这进一步降低了鼠单抗的异源性,仅有 9% 的序列来源于亲本鼠单抗[ 23 ].抗体分子的可变区是由 CDR 和 FR 两部分构成,VH 和 VL中各有 3 个 CDR 和 4 个 FR,VH 和 VL 上的 6 个 CDR 折叠成环状,形成抗原结合位点,抗体的特异性和亲和力主要由此区决定. FR的基本序列保守,在不同的抗体间具有较高的同源性,CDR 在序列和构象上的变异对 FR 构象影响较小,同一抗体的 FR 可适用于不同抗原结合位点的移植,抗体分子的上述结构特性提供了设计和构建改型抗体的物质基础.改型抗体的免疫原性进一步降低,人源化达到了 90% ,但潜在的 10% 鼠源性仍有引起人体产生抗独特型免疫反应的风险; 就国内技术而言,可选择的人源 FR模板较少,且 FR 模板是不可以随意替代的,CDR 移植后抗体与抗原的结合能力会减弱[ 24 ].这些都是改型单抗抗肿瘤药物研发过程中不能忽略的风险因素. 2.3. 3全人抗体制备技术 单克隆抗体的人源化改造确实降低了鼠源程度,但鼠源免疫原性仍然存在,同时人源化改造过程复杂、实验周期长,获得的抗体质量不稳定.20世纪 90 年代以来,以噬菌体抗体库技术为代表的全人抗体制备技术逐渐发展并不断成熟,开拓了单抗抗肿瘤药物研发的新思路.全人抗体的制备包括抗体库技术和转基因小鼠技术[ 25 ].通过全人抗体制备技术得到的抗体进行 ELISA 活性鉴定,酶切鉴定及可溶性表达,最终得到单克隆抗体[ 26 ].可以看出,全人抗体制备的关键风险因素,在于筛选技术的成熟与否、检测水平的精确度、恰当技术的选择. 1)抗体库技术噬菌体抗体库技术: 是基于噬菌体展示技术发展起来的抗体库技术,是一项基因重组的方法.将编码外源基因的 DNA 片段利用基因工程的方法,导入到噬菌体载体上,将外源基因表达的蛋白与噬菌体蛋白融合,展示在子代噬菌体表面,一般得到抗原结合片段(Fab 片段) 或单链抗体(scFV) .噬菌体抗体库除依靠噬菌体展示技术外,还依靠 PCR 技术和大肠杆菌分泌的有效免疫蛋白. 目前噬菌体抗体库的构建方法是从人的淋巴细胞、肿瘤细胞通过PCR方法提取总RNA,反转录成 cDNA,构建文库.王净等[ 27 ]通过PCR 等方法构建成半合成、合成、天然或免疫的全人抗体库,然后用已知抗原直接从全人抗体库中通过亲和筛选或全细胞筛选方法等得到与此抗原结合的噬菌体颗粒,再经历一次体外融合,就能产生具有完整功能的全人抗体.但噬菌体抗体库技术制备的抗体通常为 Fab 片段或 scFv 片段,由于没有 Fc 片段而使亲和力降低,受到外源基因的影响,导致转化效率受到影响,这些是噬菌体抗体库技术制备全人抗体的主要风险. 核糖体展示技术:其基本原理是通过 PCR 扩增目的基因的DNA 文库,同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环,并置于具有耦联转录 /翻译的无细胞翻译系统中孵育,使目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面,并形成"mRNA - 蛋白质 - 核糖体"三元复合体,翻译出来的抗体可用肿瘤抗原进行筛选,最后通过常规的免疫学检测方法,通过固相化的靶分子直接从复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体,再利用 RT - PCR 扩增,经过多次循环过程,最终筛选出高亲和力的目标分子[ 27 ].但核糖体展示技术表达的蛋白质折叠和转录后修饰功能与目标所要的蛋白功能有冲突,故其所展示的抗体不能形成正确的三级结构,亲和力往往较低,表达及纯化难度大. 2)转基因小鼠技术其抗体生成过程是从鼠抗体生成基因被相应的人基因所取代的小鼠开始的.转基因小鼠的 Ig 基因是用人的相应基因替代,产生对人免疫系统非异种抗体.这种影响人抗体的策略是改造小鼠的体液免疫系统,将人 Ig 基因微位点转入小鼠,产生能分泌人Ig 的转基因小鼠.利用鼠体体内亲和力的成熟机制,一步即能产生一系列高亲和力的全人单抗[ 28 - 29 ].理论上讲,转基因小鼠是目前生产全人单抗的最理想方法,但技术难度较大,国内并未获得真正的突破. 2.4抗肿瘤单克隆抗体功能鉴定 获得抗体之后,要进行抗体功能鉴定.特异性是指抗体选择性地与某种或某类抗原结合的特性,亲和力则是抗体结合部位与抗原决定簇的结合强度,抗体的特异性和亲和力是鉴定抗体特性最重要的两个指标[27 .单克隆抗体的靶向治疗通过抗体依赖性细胞介导细胞毒性反应和补体依赖细胞毒性反应杀伤肿瘤细胞; 通过抗体竞争地与受体结合,干扰配体 - 受体的结合和相互作用,影响其发挥生物效应,抑制肿瘤生长; 抑制肿瘤新生血管形成,限制肿瘤的生长和转移; 与受体结合直接诱导肿瘤细胞凋亡; 产生抗独特型抗体,引起针对抗独特型抗体的免疫应答等[ 15,26,30 ].提取肿瘤细胞,发现肿瘤表面相关标志物,采用酶联免疫吸附试验(ELISA) 、免疫组织化学(IHC) 、流式细胞学(FACS) 、免疫印迹杂交(Western blot)、免疫共沉淀等技术检测[ 31 - 33 ]单克隆抗体特异性结合抗原的性质.通过临床标本验证和交叉反应测试,检测抗体对肿瘤细胞的杀伤效果和不良反应.所有检测过程都应符合要求后,才能进行抗体的大量生产. 3结语 从国内单抗抗肿瘤药物的研发环节来看,主要分为靶点发现、靶点选择、抗原制备、单克隆抗体制备技术的选择以及抗体功能鉴定5 个部分.其中靶点可以从基因水平、转录水平和蛋白水平 3 个方面发现和选择,这 3 个方面的技术均存在各自的风险和缺陷; 单克隆抗体制备技术集中于杂交瘤技术、人源化技术和全人抗体制备技术,3 项技术各有利弊,目前哪种技术更具优势还没有共识.在各个环节中,可以通过不同环节的技术特点发现影响研发成果的风险因素,找到风险因素,并运用风险管理的思维和方法进行分析.由此,新药研发管理者们就可以科学地避免或降低研发过程中技术风险带来的损失,加快肿瘤抗体药物的研发进度,尽早大力使新药研发向中下游推进.。
酶定向进化文库的筛选方法
酶定向进化文库的筛选方法徐匆;李艳芳;黄皓;梁卫驱;胡珊;陈仕丽;罗鸿斌;罗华建【摘要】酶工程作为生物技术的主体之一,对农产品加工等的发展具有广泛作用.自然界中的酶往往不能满足实际生产,因此需要通过模拟自然界中的蛋白质进化,对酶进行改造和突变文库筛选,最终得到符合实际生产的酶.目前,改造酶的途径主要有定点突变和定向突变两种.突变体文库的建立方法较为成熟,并且建立起的文库库容也能够达到研究者的要求,但是突变体文库的筛选受现有技术等所局限,成为了定向进化技术的瓶颈.介绍了几种常用的突变体文库的筛选方法,对它们的原理及特点进行阐述,并对未来的发展方向及趋势进行了总结.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)005【总页数】5页(P194-197,207)【关键词】酶定向进化;筛选方法;FASC【作者】徐匆;李艳芳;黄皓;梁卫驱;胡珊;陈仕丽;罗鸿斌;罗华建【作者单位】东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086;东莞理工学院,广东东莞523086;东莞市农业科学研究中心,广东东莞523086【正文语种】中文【中图分类】Q814生物技术是当今发展最迅速、应用领域最广泛的高新技术。
农业生物技术正在成为农业竞争的焦点和核心，酶工程作为生物技术中重要的组成部分，是现代酶学理论与化学技术的交叉学科[1]，酶制剂在农产品加工，如淀粉、甜味剂、乳品、果蔬贮藏、饲料加工等方面都有广泛应用。
随着生物技术和酶动力学的研究进步，酶学进入了一个快速发展的阶段。
1个多世纪以来，酶的特殊催化功能和效果使其在很多领域都代替了非生物催化剂。
目前全世界都在倡导可持续发展、可再生资源利用，使用清洁生产技术已经成为不可回避的应用技术现状，而使用酶制剂是其中非常重要的一部分。
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2具体方法
1）基因片段的改造 为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接 上T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密 码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端, 将蛋白质和mRNA连接在一起。在对基因片段改 造时,常进行多次延伸PCR： ①分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来
② 用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因 和间隔子连接起来，引物5含有SD序列, 引物4含 有3′端茎环结构序列。 ③ PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动 子序列和5′端茎环结构序列,下游产物同前。最 后得到的PCR产物,5′端接上T7启动子和茎环结 构以及SD序列,3′端则融合了间隔序列并含有 3′端的茎环结构(见图2)
4）体外分子定A shuffering)等方法引 入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获 得高亲和力、良好稳定性或增加酶活性靶标分子 的机率.Plückthumx小组利用核糖体展示技术筛 选到1.1 nmol高亲和力的ScFv,之后通过引入 DNA重排技术,又将其亲和力提高了30倍。
tRNA离开，再去转运新的氨基酸
U U A G A U A U C
以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质
1、核糖体展示技术原理
核糖体展示技术是一种筛选蛋白质强有力的工具, 通过将基因型和蛋白表型联系在一起理：对体外进行转录与翻译,编码蛋白的DNA进 行特殊的加工与修饰,如:去掉3′末端终止密码子或 者利用了嘌呤霉素将mRNA与多肽以共价键的形式 联系起来,使得核糖体-mRNA-蛋白质三元复合物稳
？
U A C
反密码子
A U G G A U A U C
mRNA
核糖体
亮氨酸
天门冬 酰氨
A A U C U A U U A G A U A U C
tRNA将氨基酸转运到mRNA上的相应位置
缩合
亮氨酸 天门冬 酰氨
A A U C U A U U A G A U A U C
两个氨基酸分子缩合
亮氨酸
天门冬 酰氨
对于含二硫桥的ScFv抗体和其他蛋白质,转录和 翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在 氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合 酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性。 如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体 外转录/翻译偶联体系效果可能更好.
若分别进行,则需要控制RNase的影响.VRC— 过渡态类似物—作为RNase抑制剂,能有效抑制 核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率。翻译结束后 立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行 降低RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环 结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和 核酸内切酶RNase E的影响。
特别是如何防止mRNA的降解和形成稳固的蛋白质核糖体-mRNA三聚体无疑是该技术的关键问题；如 何提高大分子蛋白质在核糖体上的展示也是未来研 究需要关注的问题。 c 前景：随着对核糖体展示技术的进一步研究,以 上问题将逐步得到解决,核糖体展示技术作为一种新 兴的克隆展示技术,必将在蛋白质相互作用研究、新 药开发以及蛋白组学等方面显示出更为广泛的应用 空间.
异亮氨酸
C U A U A G U U A G A U A U C
核糖体随着 mRNA滑动. 另一个 tRNA 上的碱基与 mRNA上的 密码子配对.
亮氨酸
天门冬 酰氨
异亮氨酸
U A G C U A U U A G A U A U C
一个个氨基酸分子缩合成链状结构
亮氨酸
天门冬 酰氨
异亮氨酸
U A G U U A G A U A U C
①亲和筛选 分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和 磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法中，抗原包被 在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会 影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗 体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗 原上连接捕获标签，如生物素，然后在形成抗 原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标 签,进行亲和筛选。
2）体外转录和翻译
体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞 蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液 和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统 更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以 偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为 模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外 转录与翻译偶联的商用系统问世。
②mRNA的分离
筛选完后，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷缓 冲液洗脱mRNA。洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ 处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR反应重 新引入T7启动子，SD序列等核糖体展示必需元 件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评 价筛选效率。将最后一轮筛选到的靶标基因与质 粒连接,转化到大肠杆菌中，可以得到单个靶标 克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体 型)表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。
3）亲和筛选
体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终 止反应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+ 浓度，稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。 可以直接用于筛选实验，也可以于4℃保存， 核糖体复合物在4℃至少可以稳定10 d，但产 量会逐渐减少。体外筛选时加入1%~2%脱脂 奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异 性反应,肝素还能抑制核酸酶。
定。然后利用ELISA微孔或磁珠筛选出含有目标蛋 白的核糖体三聚体，对筛选得到的复合物进行分解, 释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应(RT- PCR ),PCR产物进入下一轮循环,经过多次循环,最终使目 标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离(见 图1)。
.
体外核糖体展示肽库构建与筛选原理示意图
3 核糖体展示技术的优势、问题、展 望
a 优势: 核糖体展示技术完全在体外进行,与噬菌
体或酵母菌展示技术相比具有建库简单、库容量 大、分子多样性强、筛选方法简便、无需选择压力, 还可通过引入突变和重组技术来提高的问题:如何进一步地提高该系统的稳定性；
核糖体展示技术
基因控制生物性状
指导 合成
体现者
蛋白质
基因指导蛋白质合成的过程，叫基因的表达。
问题：基因是怎样指导蛋白质的合成呢？
mRNA在细胞核中合成
DNA
细胞核
A A T C A A T A G U U A G U U A U C
mRNA
核孔 细胞质
U U A G U U Aห้องสมุดไป่ตู้U C
mRNA
甲硫氨酸