阅读质粒图谱 10-30
质粒图谱大全
〔转载〕Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbApTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKitsTEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαApBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
☆如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l＃P/E 启动子/增强子l＃Termsl 终止信号＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
5′粘性末端
3种切口 3′粘性末端 平头末端
① DNA样品纯度
A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生 非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段 电泳观察。 B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染 时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。 C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响 酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。
2) 命名原则
• 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础 上进行了系统分类 ① 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名 (genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ② 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③ 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的 先后顺序用罗马字母表示。
酶切前的DNA
酶切后的DNA
实验材料和试剂
实验材料：质粒pCAMBIA1302 银杏基因组DNA
实验试剂：
① EcoR Ⅴ酶及其酶切缓冲液 ② 琼脂糖(Agarose)、TAE电泳缓冲液等
实验仪器
质粒图谱
)质粒图谱登记号：00012)质粒名称：pIRES3)来源：BD Co4)用途：真核双表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00022)质粒名称：pECFP-C13)来源：BD Co4)用途：检测真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：7)联系方式：pm1)质粒图谱登记号：00032)质粒名称：pShuttle3)来源：4)用途：5)是否可以提供更详细资料：6)是否可以共享：7)联系方式：2)pShuttle MCS很多人用pEGFP-C1，我也来发一个)质粒图谱登记号：00042)质粒名称：pSBR322、pUC183)来源：4)用途：5)是否可以提供更详细资料：6)是否可以共享：7)联系方式：1)质粒图谱登记号：00052)质粒名称：pcDNA3.1(+)/CAT3)来源：invitrogen4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：无偿7)联系方式：PM1)质粒图谱登记号：00062)质粒名称：pQEx3)来源：Qiagen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM2)1)质粒图谱登记号：00072)质粒名称：pIVEX2.33)来源：Rocho4)用途：体外转录翻译5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM质粒图谱登记号：0008质粒名称：pIRES-EGFP来源：用途：是否可以提供更详细资料：是否可以共享：否联系方式：1)质粒图谱登记号：00092)质粒名称：pET-28a（+）3)来源：Novagen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM1)质粒图谱登记号：00112)质粒名称：pET-32a(+)3)来源：novagen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：6)是否可以共享：7)联系方式：pm1)质粒图谱登记号：00132)质粒名称：pcDNA3.1/Zeo (+)3)来源：invitrogen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00132)质粒名称：pEGFP-N33)来源：clontech4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00142)质粒名称：pcDNA33)来源：invitrogen4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00152)质粒名称：pfastbac13)来源：invitrogene4)用途：昆虫表达5)是否可以提供更详细资料：不可以6)是否可以共享：不可以7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00162)质粒名称：pEGFP-C33)来源：clontech4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PMwangjun2002274 edited on 2004-06-22 00:041)质粒图谱登记号：00172)质粒名称：pSecTag23)来源：Invitrogen4)用途：真核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)1质粒图谱登记号：00192)质粒名称：pET20b3)来源：NOVAGEN4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM1)质粒图谱登记号：00222)质粒名称：pThioHisA3)来源：invitrogen4)用途：原核表达5)是否可以提供更详细资料：4.365kb , HP-thioredoxin fusion proteinexpressionvector, trc promoter, Ampr, a EK cleavage site lies between HP-thioredoxin and MCS宿主菌TOP10（基因型为：F-mcrA △（mrr-hsd RMS-mcrBC）Ф80 lacZ M15 △lacX74 deoR recAl araD139 △（ara-leu）7697 galU galK rpsL endAl nupG6)是否可以共享：交换或其它7)联系方式：PM2)3)1)质粒图谱登记号：00242)质粒名称：pcDNA3.1-Myc-His-A-3)来源：invitrogen4)用途：真核核表达4))质粒图谱登记号：00252)质粒名称：pSUPER.neo3)来源：4)用途：siRNA5)是否可以提供更详细资料：可以6)是否可以共享：交换7)联系方式：PM)质粒图谱登记号：00312)质粒名称：pSilencer1.0-siRNA3)来源：Ambion4)用途：RNAi5)是否可以提供更详细资料：/techlib/Documents.html?fkResSxn=7&fkSub Sxn=236)是否可以共享：实验结束后，可提供含shRNA模板的质粒7)联系方式：pm5) )质粒图谱登记号：00322)质粒名称：pSilencer2.0-U6siRNA 3)来源：Ambion4)用途：RNAi ，与1.0相比，可以建立稳转株5)更详细资料：/techlib/prot/fm_7209.pdf 6)是否可以共享：交换 7)联系方式：pm6)会员名：mlluoE-mail：*************可提供试验资源名称和简要介绍：pSilencer 3.1-H1 neo Vector，是Ambion公司目前最高版本的shRNA 载体，为扩增此载体我已插入目的片段，如有战友需要，将此片段双酶切再连上自己的片段即可。
如何阅读质粒图谱
如何阅读质粒图谱⼀、载体主有病毒和⾮病毒两⼤类，其中质粒DNA是⼀种新的⾮病毒转基因载体。
⼀、⼀个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。
原核⽣物DNA分⼦中只有⼀个复制起始点。
⽽真核⽣物DNA分⼦有多个复制起始位点。
抗⽣素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+多克隆位点：MCS克隆携带外源基因⽚段P/E：启动⼦/增强⼦Terms：终⽌信号加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作⽤⼆、如何阅读质粒图谱第⼀步：⾸先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）Ori的箭头指复制⽅向，其他元件标注的箭头多指转录⽅向（正向）。
第⼆步：再看筛选标记，如抗性，决定使⽤什么筛选标记：（1）Ampr：⽔解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻⽌四环素进⼊细胞。
（3）camr：⽣成氯霉素羟⼄酰基衍⽣物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍⽣物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单⼀切点，便于外源基因的插⼊。
如果在这些位点外有外源基因的插⼊，会导致某种标志基因的失活，⽽便于筛选。
决定能不能放⽬的基因以及如何放置⽬的基因。
第四步：再看外源DNA插⼊⽚段⼤⼩。
质粒⼀般只能容纳⼩于10Kb的外源DNA⽚段。
⼀般来说，外源DNA⽚段越长，越难插⼊，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号。
这是⽤来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加⼊⼀些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选⽤那种载体，还是要以实验⽬的为准绳。
相关概念：启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号启动⼦－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵⼦编码顺序的上游，是DNA分⼦上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动⼦本⾝不被转录。
质粒图谱大全之欧阳与创编
（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA,pllp-STII,pMBP-P,pMBP-C,pET-GST,pET-Trx,pET-His,pET-CKS,pET-DsbA 二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusion Systems39band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressio nSystem33bProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressio nSystemsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressio nSystemsplusCompetentCellsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusio nSystems41and42ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusi onSystems43.1and44ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDN AProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinRes insandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
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（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
质粒图谱阅读.pptx
*2-direction insertion
双向插入
*self-reconnection
自身环化
*no easy way of retrieving
the insert
重新筛选插入的片断困难
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A1 A
2 vector
B
2 A
vector 1
B
平齐末端连接时，插入的方向是 随机的，称为双向插入。会给后续 的工作造成很多麻烦。
原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异
性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌
落
。
方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，
若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所
编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可
与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该
抗体可携带酶或荧光，易于检测。
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完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的 表达。
当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物 共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5－溴 －4－氯－靛蓝，使得菌落呈现蓝色。
some cells (actually, very few) become
transformed: they acquire recombinant vector
Pseudo-positive
DNA.
positive
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第四节 重组子的筛选与鉴定
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质粒图谱怎么看
一、质粒（plasmid）：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
载体（Vector）：简单的来说就是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体，分为病毒类和非病毒类两种。
我们平时常说的载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的，通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作，同时加入一些多用途的辅助序列。
二、如何阅读质粒图谱看懂一个质粒图谱我们需要关注以下几点：1）弄清楚质粒的方向看质粒图谱的时候我们会发现大多数质粒都会有顺时针和逆时针两个方向的箭头，箭头的方向：一个方向是复制起始位点的方向，即该质粒在细菌或真菌中DNA复制的一个方向，有时图谱中还会有f1 ori，这个代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，但是可以用来测序。
另一个就是转录方向（一般是正向），主要是从启动子开始，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。
2）复制子复制子又称复制起始区，它控制着质粒DNA的复制，并决定了质粒的宿主和拷贝数。
复制子可分为严谨型复制子与松弛型复制子，分别对应低拷贝数的严紧型质粒和高拷贝数的松弛型质粒。
3）筛选标记：了解筛选标记类型（如抗生素抗性标记），方便后续确定筛选重组质粒载体。
常见抗菌素抗性标记有氨苄青霉素抗性（Amp）、卡那霉素抗性（Kan）、四环素抗性（Tet）、链霉素抗性（Str）、氯霉素（Cmr, 某些酵母表达质粒）、潮霉素（Hyg, 农杆菌里常用的）。
4）多克隆位点MCS区：既外源基因的插入位点。
具有多个限制酶酶切位点，外源性的DNA一般可通过酶切/连接的方式插入质粒。
）其他元件，如表达系统元件和蛋白标签等常见的启动子有：CMV、EF1（常规表达，一般启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），CAMV35S、Ubi（植物表达常用），T7（常用原核系统表达启动子）。
各类质粒载体图谱
pGADT7
Vector Information
as a fusion to a hemagglutinin (HA) epitope tag. HA-tagged proteins can be identified with antibodies raised to this common epitope, eliminating the need to generate specific antibodies to new proteins. The T7 promoter is used for in vitro transcription and translation of the epitope tagged fusion protein and also provides a binding site for sequencing using the T7 Sequencing Primer. Note that the AD is not expressed during the in vitro transcription and translation reactions. The Nco I and Pst I sites may be used to shuttle inserts from pGADT7 into pGBKT7, the MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 DNA-BD Vector. The MCS in pGADT7 is compatible with those in pMyc-CMV and pHA-CMV, CLONTECH's epitope tagged mammalian expression vector set (#K6003-1). As a result, the target gene can be shuttled into these vectors in order to confirm protein interactions in vivo. Location of features: • Full-length S. cerevisiae ADH1 promoter (PADH1): 7–1479 • GAL4 AD polypeptide with SV40 Nuclear Localization Signal (NLS) NLS: 1501–1557 GAL4 amino acids 768–881: 1561–1899 • T7 RNA polymerase promoter: 1905–1927 • HA epitope tag: 1942–1968 • Multiple Cloning Sites: 1969–2041 • Transcription termination signal Fragment carrying the S. cerevisiae ADH1 terminator (TADH1): 2280–2605 • LEU2 coding sequences: 3814–2723 • pUC plasmid replication origin: 4581–5418 • Ampicillin resistance gene: 6432–5575 • Yeast 2 µ replication origin: 6998–7988 Location of primers: • T7 Sequencing Primer: 1905–1925 • 3' AD Sequencing Primer: 2102–2083 • MATCHMAKER 5' AD LD-Insert Screening Amplimer (#9103-1): 1858–1889 • MATCHMAKER 3' AD LD-Insert Screening Amplimer (#9103-1): 2078–2046 Propagation in E. coli: • Suitable host strains: DH5α, DH10 & other general purpose strains • Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 µg/ml) to E. coli hosts • E. coli replication origin: pUC • Copy number: ~500 • Plasmid incompatibility group: pMB1/Col E1 Propagation in S. cerevisiae: • Suitable host strains: Y187(α), Y190(a), SFY526(a), CG1945(a), HF7c(a), or AH109(a) • Selectable marker: LEU2 • S. cerevisiae origin: 2 µ Reference:
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
AccⅠ识别序列
AccⅠ
能切割 T CCGG AGA
不能切割 T ×CCGG 6mATC
注意此处的区别
dam甲基化酶识别序列
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA 的甲基化。
③ 酶的星活性 (star activity)
又称第二活力，是指改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的 一种现象。由于识别特异性的降低，可能对原识别序列相似的序列也产生 切割反应。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆 位点——转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有 关的元件即成为表达载体。
Eco RV (10442)
35S prom oter UTR
多克隆位点 pUC18 MCS lacZ promoter
35S prom oter
Eco RV (8842)
绿色荧光蛋白基因 GFP NOS 终止子加尾信号
T-DNA right border
HPT 潮霉素抗性基因
加尾信号，终止位UT点R T-DNA left border
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
pBNA中由于有较多的EcoR Ⅴ识别位点，因此，经 EcoR Ⅴ酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一 的亮带。
酶切前的DNA
酶切后的DNA
实验材料和试剂
质粒图谱大全之欧阳索引创编
（转载）欧阳家百（2021.03.07）一.九种表达载体Pllp-OmpA,pllp-STII,pMBP-P,pMBP-C,pET-GST,pET-Trx,pET-His,pET-CKS,pET-DsbA 二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39 band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplu sCompetentCellsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41 and42ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems4 3.1and44ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurifi cationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2TpGEX-2TKpGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-) pCDNA3.1( ) pPICZalphaA pGAPZαA PYES2.0pBI121pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
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（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
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阅读质粒图谱星期四, 十月 13th, 2011 | DNA技术, 基础知识 | xumin520jie | 浏览：6载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，负调控序列。
核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down －stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）1. 什么是载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类―――按功能分成：（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）（2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
―――按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
3. 基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
【4】选用质粒（最常用）做载体的4点要求：①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
0 质粒DNA的概述星期四, 十月 13th, 2011 | DNA技术, 基础知识 | xumin520jie | 浏览：5把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。
在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。
如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。