诺维赞逆转录文档

逆转录

A 包装 500μl
B 包装 1ml
50μl
100μl
1ml
1ml×2
注意事项：
1）用 DEPC 处理实验用到的所有实验器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免 RNA 酶的污染。 2）确保所用试剂中无 RNA 酶污染。 3）试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保扣严。 4）纯化过的 RNA 必须保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链 cDNA 的合成反应。可采用乙醇沉淀 RNA 的方法去除掉痕量污染物。 5）为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量的 RNA 模板。 6）实验结果显示，最快逆转录速度可达 2kb/min，需要提高反转录效率或模板含量较低时可以适当延长反转录时间。
本制品中 Random N6 和 Oligo(dT)18 引物比例经过优化，可均匀合成样品中的 cDNA；
本制品中含有去基因组成分，反转录时可同步去除基因组 DNA 污染。
保存温度：-20℃。
产品包装：
产品组成 2×NovoScript® Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix gDNA Purge RNase Free Water
仅供科研使用，不能直接应用于人体
近岸蛋白质科技有限公司
Novoprotein Scientific Inc.
技术咨询电话：400-600-0940；(021)5079-8060 官方网站：邮箱：product@ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区伽利略路11号1号楼
II.第一链 cDNA 的 PCR 扩增
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
常用反应体系（50μl）：

诺唯赞反转录试剂盒说明书

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•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit是一套用于以RNA为模板高效合成第一链cDNA的完整系统，可合成长达13kb 的cDNA。

试剂盒配套提供的RiboLockRNase Inhibitor，可有效防止RNA模板的降解。

试剂盒配套提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物。

oligo(dT)18引物可以选择性地与mRNA中的poly (A)尾结合。

随机六聚体引物无需poly (A)尾，因此可转录mRNA 5’-端区域，也可以无poly
(A)尾的RNA (如micoRNA)为模板合成cDNA。

该试剂盒也可使用基因
特异性引物。

•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明优点：
•合成全长的第一链cDNA，最长可合成13kb的cDNA
•最佳反应温度为42℃
•完全一提供RT反应所需的所有组分
•应用:
•第一链cDNA合成，作为RT-PCR和实时RT-qPCR的模板
•构建全长cDNA文库
•反义RNA合成
•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成全长cDNA
• 1 μg小鼠心脏总RNA作为模板，用oligo(dT)18 引物进行逆转录反应。

由此合成的cDNA，再作为Taq DNA Polymerase后续PCR扩增的模板。

末端2024 bp片段的成功扩增，表明长度为13.8 kb的全长RN***段得到成功的逆转录。

•。

逆转录 Protocol

逆转录的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法及注意事项如下：一、原理逆转录（reverse transcription）是指以RNA为模板合成DNA的过程。

在某些RNA病毒中，逆转录是一种必要的复制过程。

在细胞中，逆转录也参与基因表达的调节。

逆转录过程由逆转录酶（reverse transcriptase）催化，该酶具有两种活性：1）DNA聚合酶活性，即以DNA为模板合成DNA；2）RNA酶活性，即以RNA为模板合成cDNA。

在逆转录过程中，逆转录酶首先识别并结合到特定的RNA序列（通常是mRNA）上，然后以RNA为模板按照碱基互补配对原则合成cDNA。

合成的cDNA链再经过DNA修复和扩增等过程最终得到大量DNA分子。

二、所需试剂和耗材1.逆转录试剂盒或逆转录酶。

2.RNA酶抑制剂（可选）。

3.Oligo(dT)引物或随机引物。

4.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）。

5.缓冲液（如Tris-HCl、KCl等）。

6.MgCl2（镁离子）。

7.DEPC水或无RNA酶水。

8.RT-PCR仪（若要进行PCR扩增）。

9.离心管、移液器、微量离心管等实验容器。

三、实验仪器1.离心机：用于RNA和DNA的分离、沉淀等。

2.水浴锅：用于逆转录反应保温。

3.PCR仪：用于cDNA的扩增。

4.电泳仪和电泳槽：用于检测和分析DNA。

5.显微镜：观察细胞和组织样品。

6.分光光度计：用于测量RNA和DNA的浓度。

四、准备工作1.实验前应熟悉逆转录的相关知识及操作流程。

2.准备好所需的试剂和耗材，确保其在有效期内且未受污染。

3.实验操作前需清洗实验器具，保证无核酸酶或其他污染源残留。

4.为减小误差，实验过程中应尽量使用随机对照。

五、实验方法1.从细胞或组织中提取总RNA。

2.在逆转录反应中加入所需的原料和缓冲液，包括RNA、Oligo(dT)引物或随机引物、dNTPs、缓冲液、MgCl2等。

3.在适当的温度和时间下进行逆转录反应，合成cDNA。

ezbioscience逆转录说明书

ezbioscience逆转录说明书全文共四篇示例，供您参考第一篇示例：引言逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）是一种能够将RNA 模板转录成相应的DNA的酶，是分子生物学领域中重要的工具。

ezbioscience作为生物技术公司，在逆转录领域有着丰富的经验和专业知识，推出了一系列高质量的逆转录试剂盒，提供给研究人员用于RNA分析和cDNA合成等领域的研究。

一、产品介绍ezbioscience的逆转录试剂盒是基于反转录酶的高效逆转录反应而设计的，具有以下几个特点：1. 高效性：采用高纯度反转录酶，能够在较短的时间内完成RNA 到cDNA的反转录反应。

2. 稳定性：试剂盒中的反转录酶具有较高的热稳定性，确保反应过程的可靠性和稳定性。

3. 专业性：组合了ezbioscience多年的技术积累和经验，能够适应各种不同的RNA模板，并且适用于多种不同类型的研究。

4. 灵敏度：能够在低浓度的RNA模板下进行高效的反转录反应，满足研究需要。

二、使用说明1. 样品处理：将待逆转录的RNA样品进行完整性检测和质量评估，确保样品的纯度和完整性。

2. 试剂配置：按照说明书中的配方准备反转录体系，将RNA模板与反转录酶和其它试剂按比例混合。

3. 反转录反应：将混合好的反转录体系进行反转录反应，根据实验要求设置反应时间和温度。

4. cDNA纯化：反应后的产物进行纯化处理，去除杂质和未反应的物质。

5. cDNA合成：根据实验需求，将反转录得到的cDNA进行进一步的合成和扩增。

三、应用领域ezbioscience的逆转录试剂盒适用于多种生物学研究领域，包括但不限于：1. 基因表达分析：用于将RNA转录成相应的cDNA，进一步进行基因表达分析、PCR扩增等实验。

2. miRNA研究：在miRNA研究中，可用于构建miRNA的cDNA 文库，用于miRNA的表达定量、功能研究等方面。

3. 转录组学：在RNA测序、差异基因表达分析等领域发挥着重要作用。

诺唯赞P111 P1122 Taq Master Mix说明书

Version 9.2Vazyme biotech co., ltd.产品概述本产品包含Taq DNA Polymerase 、dNTP 以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了移液操作，提高了检测通量和结果的重现性。

扩增体系中加入的保护剂使得2 × Master Mix 反复冻融后仍可保持稳定活性。

本品提供含有电泳缓冲液和染料的版本，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便。

PCR 产物的3’端带A ，可直接克隆至T 载体，并适用于ClonExpress ®和拓扑克隆试剂盒(C112/C113/C115/C601)。

质量控制核酸外切酶残留检测：20 μl 本品与50 pmol 单链DNA 底物和双链DNA 底物在37℃下孵育16 h ，经变性PAGE 电泳，DNA 的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：20 μl 本品和0.3 μg pBR322 DNA 在37℃下孵育4 h ，经琼脂糖凝胶电泳，质粒的电泳谱带不发生变化。

大肠杆菌DNA 残留检测：20 μl 本品中残留的核酸经E.coli gDNA 特异性的TaqMan qPCR 检测，E.coli 基因组残留低于10拷贝。

功能检测：50 μl PCR 体系中，分别以1 μl HeLa cDNA 、100 ng 人基因组DNA 、5 ng λDNA 为模板，扩增长度分别为2 - 10 kb 的5个不同目的片段，延伸时间设置为 1 min/kb 。

35个循环后取1/10 PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，可见有单一的相应条带。

保存条件-30 ~ -15℃保存；运输条件：≤0℃。

产品组分2 × Taq Master Mix 5 × 1 ml 15 × 1 ml 50 × 1 ml组分P111-01P111-02P111-032 × Taq Master Mix (Dye Plus) 5 × 1 ml 15 × 1 ml 50 × 1 ml组分P112-01P112-02P112-03* 不同模板最佳反应浓度不同，下表为50 µl 反应体系推荐模板使用量：反应体系ddH 2O2 × Taq Master Mix Primer1 (10 µM)Primer2 (10 µM)Template DNA*To 50 µl 25 µl 2 µl 2 µl x µl动植物基因组DNA 大肠杆菌基因组DNA cDNA 质粒DNA λDNA0.1 - 1 µg 10 - 100 ng1 - 5 µl (不超过PCR 反应总体积的1/10)0.1 - 10 ng 0.5 - 10 ng实验流程a.该预变性条件适合绝大多数扩增反应，可根据模板结构复杂程度修改。

诺唯赞r323说明书

诺唯赞r323说明书
1.简便快捷的操作
HiScriptRll RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme #R323)包含基因组清除模块，可彻底去除RNA模板中残留的基因组DNA;同时Vazyme #R323包含逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板RNA，20 min 内即可完成逆转录反应，操作简便快捷。

2.广泛的模板兼容性
分别以HeLa 细胞、小鼠肝脏、拟南芥叶片的完整RNA与降解RNA 为模板，使用HiScriptRIll RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme#R323)以及市售常见品牌逆转录试剂(Supplier T)进行逆转录。

将得到的cDNA进行多个基因的qPCR定量分析，以不同基因为横坐标，扩增CT值为纵坐标绘图，比较不同产品的逆转录效率。

以HeLa细胞、小鼠肝脏、拟南芥叶片完整RNA以及降解RNA为模板进行逆转录定量，Vazyme #R323的扩增C┐值小于或等于T公司相关产品，说明Vazyme#R323逆转不同物种RNA、完整度较差的RNA模板皆具有卓越的逆转录效率。

3.超强的杂质耐受度
在RNA的提取过程中常常因操作或样本的特殊性导致RNA中混有有机试剂或杂质，这些物质的残留会严重影响逆转录效率。

乙醇、异丙醇、水平衡酚、异硫qing酸胍、腐殖酸是RNA提取过程中较为常见的杂质，测试其对逆转录效率的影响。

诺唯赞同源重组试剂盒说明书

诺唯赞同源重组试剂盒说明书同源重组试剂盒是一种简单、快速并且高效的DNA定向可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。

将载体在克降位点进行线性化并在插入片段PCR物5端引入线性化克隆载体未端序列，使得插入片段PCR产物5和3最未端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp~20bp)。

这种两端带有载体末端序列的PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Exnase的催化下，仅需反应30min即可进行转化完成定向克隆。

克隆阳性率可达95%以上。

产品优点-简单、快速、高效~适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆50bp~10kb片段不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围快速克隆~高通量克隆~无缝克隆-DNA定点突变>产品保存本产品应置于-20°C储存，使用过程中尽量避免反复冻融。

>实验方案1实验流程概览(1）线性化克隆载体制备(2)插入片段扩增物设计(3)插入片段PCR扩增(4)进行重组反应(5).反应产物转化、涂板(6)克隆鉴定2制备线性化载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。

我们推荐您尽量选择无重复序列且GC 含量均匀的区域进行克隆。

当载体克隆位点上下游20bp 区域内GC含量均在40%~60%范围之内时，重组效率将达到最大。

克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化也可以为反向PCR扩增。

A线性化克隆载体由酶切制备双酶切线性化：线性化完全转化背最（假阳性克隆）低。

推荐使用。

单酶切线性化：线性化程度较差，可适当延长酶切时间以降低转化背景。

注：本产品无DNA连接酶，不会发生载体自连反应，因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行未端脱磷酸处理。

重组产物转化后出现的假阳性克隆（无插入片段）是由未线性化环状载体转化而形成的。

逆转录操作规程

逆转录操作规程逆转录操作规程一、实验目的本实验目的是通过逆转录操作将RNA转录成相应的DNA，为后续的分子生物学研究提供基础。

二、实验器材和试剂1. 逆转录酶：选择适合实验需求的逆转录酶，如M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶等。

2. RNA样品：选择合适的RNA样品，如总RNA或特定的mRNA。

3. 引物：根据实验需求选择合适的引物，如随机六聚核苷酸或Oligo(dT)。

4. dNTP混合液：包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP 等。

5. RNase抑制剂：用于抑制RNase活性。

6. RNase-Free水：用于制备反应缓冲液和稀释试剂。

7. 反应缓冲液：根据逆转录酶的要求制备，一般包含Tris-HCl、MgCl2、DTT和RNase抑制剂等。

8. 20X PCR扩增缓冲液：用于后续的PCR扩增反应。

9. DNase I：用于去除RNA模板。

10. 去蛋白酶K：用于去除RNA中的蛋白质。

11. 石蜡：用于固定玻璃管盖。

12. PCR试管：用于反应混合物的配制。

三、实验步骤1. 准备工作（1）将实验器材和试剂彻底去RNase污染。

（2）将反应管、琼脂糖凝胶、电泳仪等实验器材、试剂准备好。

（3）准备一个干净的工作区域，保持其洁净和无RNase的。

（4）将RNA样品提取出来，保证其质量和纯度。

2. 模板处理（1）将RNA样品在RNase-Free水中稀释至适当的浓度，一般为1μg/μl。

（2）将RNA样品与相同体积的去蛋白酶K混合，在56°C孵育30分钟，使其去除蛋白质。

（3）加入相同体积的DNase I，继续在37°C孵育30分钟，去除RNA模板。

（4）加入等体积的EDTA，停止DNase I酶的活性。

（5）通过酚/氯仿提取的方法，将DNA样品提取至RNase-Free水中。

3. 反转录反应（1）将反应缓冲液加入PCR试管中，按照逆转录酶的要求配制。

（2）加入RNA样品，浓度一般为1μg/μl。

逆转录反应的模板

逆转录反应的模板
逆转录反应是一种生物化学反应，它能够将RNA转录成DNA。

这种反应需要一个模板，通常是一种RNA分子。

在逆转录反应中，酶会使用RNA作为模板，合成一条相对应的DNA链。

这个反应在许多生物体中都发生，包括病毒和真核生物。

逆转录反应的结果是合成一条DNA链，这条链可以被转录成一个新的RNA分子，形成一个闭环的反馈机制。

这个过程对于病毒来说尤为重要，因为它使得病毒能够将其RNA转化为DNA，从而让病毒在宿主体内进行复制。

逆转录反应主要由一个酶驱动，称为逆转录酶。

这种酶能够将RNA模板转化为相对应的DNA链。

逆转录酶非常有用，因为它使得科学家们能够将RNA序列转化为DNA，从而进行更深入的研究。

例如，在研究基因表达时，科学家们经常使用逆转录酶将RNA转化为DNA，然后使用PCR技术对其进行扩增，以便进一步分析。

总之，逆转录反应是一种非常有用的生物化学反应，它能够将RNA转化为DNA。

这个过程对于病毒的生存和研究基因表达来说都非常重要。

逆转录（RT）实验步骤

逆转录（RT）实验步骤一、准备工作1、实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP管1。

5ml、100ul（4）水浴箱2、实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

3、试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。

逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1。

5mlEP管中，-20℃中保存备用。

（2）RT中所需要的各种试剂（3）引物浓度计算方法：（新合成的引物的稀释）假如终浓度为XuM（pmol/ul）加DEPC水体积（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）二、RT时注意事项：为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。

三、RT步骤（一）用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）1、准备0、65ml的EP管2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。

3、65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。

4、短暂离心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse Inhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。

5、短暂离心6、50℃水浴60分钟进行逆转录。

7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶8、－20℃保存，或立即进行PCR。

（二）用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）1、准备0.65mlEP管2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA3、稍离心，100℃沸水裕1min4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆转录酶5、稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT6、100℃沸水裕3min灭活AMV7、立即PCR或－20℃保存。

实验篇之RT-PCR

实验篇之RT-PCR逆转录实验作为是常见的分子生物学实验之一，虽然看上去步骤简单，但当你实际操作时就会发现各种问题扑面而来，相信各位小伙伴都有被一个简单的逆转录实验搞得头晕眼花的时候，今天就由小编给大家介绍一下逆转录实验中的注意事项和常见问题，希望大家学以致用哦！图1 逆转录过程逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。

其中Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的3’Poly A 尾配对，可合成全长的cDNA，但仅扩增有polyA 尾的mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。

而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续qPCR 实验。

基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。

所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。

2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3，在高反应温度时可消除mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。

另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNaseH 活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。

3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。

诺唯赞C112说明书

诺唯赞C112说明书
非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒
产品优势：
•简单、快速、高效，适用于任何载体
•无需考虑插入片段携带的酶切位点
•可高效克隆 50 bp-10 kb 的 DNA 片段
•线性化克隆载体和 PCR 产物可不纯化直接克隆
•无连接酶，无自连，阳性率 >95%
•提供在线引物设计软件CE Design
产品描述：
ClonExpress®技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。

ClonExpress®II 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 Exnase®II。

使用任意方式将载体进行线性化；在插入片段正 / 反向 PCR 引物5’ 端引入线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物5’ 和3’ 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15 bp-20 bp)。

这种两端带有载体末端序列的 PCR 产物和线性化载体按一定比例混合后，在Exnase®II 重组酶的催化下，仅需反应 30 min 即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达 95% 以上。

实验案例：
1.克隆效率高
图1
重组产物转化后平板上一般可形成数千个单克隆，而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个单克隆形成。

因此ClonExpress®系统的自连背景会大大降低连接酶依赖的克隆方式。

2.克隆阳性率95%以上
图2
鉴定酶切结果表明，克隆阳性率可达95%以上。

贮存条件：
- 30℃～-15℃保存。

逆转录

201461626合成两组引物随机组合利用真核生物mrna具有多聚腺苷酸polya尾巴的特点polya序列起点前2个碱基除aa外只有12种可能性设计了一组1012个寡聚胸腺嘧啶同时再附加agc三种核苷酸中的任意两种作为mrna3端的锚定引物其通式为5t11mn
第四节逆转录与RT-PCR Reverse transcription & RT-PCR
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四、逆转录
1. 逆转录（reverse transcription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA 的过程。
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2. 逆转录病毒基因组复制过程
• 在逆转录过程中，新合成的DNA链要发生两次 “跳跃”（jump），以改变链间碱基配对的位置，使双链DNA的两端产生相同的长末端重复序列LTR (long terminal repeats)。
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用这12种引物分别对同一总 RNA样品进行 cDNA合成，即进行 12次不同的反转录反应，从而使反转录的 cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类。用这些引物在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。
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2 为扩增出 polyA 上游 500bp 以内所有可能性的 mRNA序列，在5′端设计了20种10bp长的随机引物。以合成的 cDNA 第一链为模板，在 PCR 反应中，掺入 32P 或 35S 标记的 dATP 或 dCTP ，这样正常与异常细胞间差异表达的 cDNA 片段可以通过 DNA测序凝胶显示出来， 3 经过 Northern 杂交分析确证后，这些差别显示的 cDNA 可以作为探针，用于进一步分离 cDNA 及基因组克隆，达到最终分离基因的目的。这样构成的引物对进行 PCR 扩增能产生出 20,000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。

诺唯赞5×逆转录说明书

诺唯赞5×逆转录说明书XXX5×逆转录适用于：Two-step RCR；37RT；蛋白变性。

蛋白变性。

所所用用体体系为系为15-100l，根据我们的体系根据我们的体系设置为设置为20l。

按按F1 protocol library 键出现，选择所需程序，出现，选择所需程序，按enter键键按按enter键后，键后，出现选择view protocol，查看程序检查程序按F5 back键，返回上一级，返回上一级，选择选择run protocol按按enter键。

2、选择Algorithmic measurement向右移动输入体积（输入体积（15-100l）按F5 start键，开始运行。

F1 protocol library 选择程序按Enter键选择view protocol确定程序后F5 back选择run protocol按enter键选择Algorithmic measurement输入体系入体系20lF5 startGeneAmp* PCR system 9700打开开关，按F5 user键。

3、蛋白变性。

所用体系为系为5-100l，根据我们的体系根据我们的体系设置为设置为10l及及20l。

按F5键后出现此画面，选择文件夹chen按F1 accept键按F1键后出现此画面，按F3 edit键按F3键后键后出现此画面，选择所需程序按F2 view键按F2键后键后出现此画面，确定程序后按F1 edit键按F1键后出现此画面，按F1 start键输入体积（5-100l）按F1 start键开始。

F5 userChen F1 acceptF3 edit选择程序选择程序后后F1 editF1 start。

产品特点：1.高效的XXX5×逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。

2.良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。

逆转录技术手册说明书

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目录逆转录 | iii仅供科学研究使用1 逆转录 (1)1.1 发现 (1)1.2 发展 (1)1.3 应用...........................................................22 建立逆转录反应 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32.1 步骤 (3)2.1.1 RNA 模板制备 (3)2.1.2 基因组DNA 去除 (6)2.1.3 选择引物 (6)2.1.4 进行逆转录 (8)2.1.5 基因组DNA 去除 (9)2.2 常见逆转录酶及性质 (9)2.2.1 DNA 聚合酶活性 (9)2.2.2 RNase H 活性 (10)2.2.3 热稳定性 (11)2.2.4 持续合成能力 (12)2.2.5 保真度 (14)2.2.6 末端转移酶（TdT ）活性 (14)2.3 常见问题及解决建议 (15)2.3.1 RT -(q)PCR 扩增量低或未扩增 (15)2.3.2 RT -(q)PCR 非特异性扩增 (16)2.3.3 cDNA 截短 (17)2.3.4 cDNA pool 覆盖率低 (18)2.3.5 cDNA 测序错误 (19)3 应用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1 逆转录聚合酶链式反应（RT -PCR ）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1.1 RT -PCR (20)3.1.2 定量RT -PCR (27)3.1.3 直接RT -qPCR (28)3 .2 cDNA克隆和文库构建 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .293.3 cDNA末端快速扩增 (32)3.4 基因表达芯片 (34)3.5 RNA测序 (36)3.6 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP） (38)iv | 逆转录仅供科学研究使用1 逆转录本章内容涵盖逆转录基础、cDNA合成、酶选择、常见问题处理技巧以及cDNA在分子生物学研究中的应用，是适用于各种层级研究人员的学习资源。

逆转录常见问题及解决方法

逆转录系列常见问题及解决方法一、组织提取1)、Vazyme（诺唯赞生物）的RNA isolater可以提取miRNA吗？可以提取miRNA。

本产品广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物以及代谢较少的植物组织，如幼苗、幼叶等。

2)、RNA浓度不高a)、原始组织样本或细胞量太少：提高加入量。

b)、RNA发生降解：如果使用者确定提取RNA的试剂/器具没有问题，RNA的降解通常发生在样品破碎/匀浆阶段。

有两个办法可以彻底抑制内源RNase活性：1.立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。

这只适合培养细胞及内源RNase含量较低的并且较容易匀浆的组织；2.对于内源RNase含量高或不易匀浆的组织，如肝脏、胰腺、脾脏、肌肉等，或植物组织，需要切成小块后立即投入液氮冷冻，再按说明进行破碎/匀浆。

c)、加入异丙醇后室温沉淀10min或-20℃冰箱沉淀30min即可，无需过夜沉淀。

d)、根据白斑大小选择20-40ul DEPC水进行溶解。

3)、提取的RNA有基因组DNA污染a)、向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下(2-8°C)高速离心。

离心后，RNA被抽提到上层的水相中，中、下层是有机相，含有氯仿。

DNA即存在于中层。

氯仿在常温下会与水以一定比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA污染。

吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层，为此牺牲一点得率，保留一些上清不吸，是非常值得的。

4)、RNA应如何保存建议分装后在-80°C长期保存。

在-20°C可以短期保存，但应尽快使用。

5)、RT-PCR反应失败a)、RT-PCR是多步反应，应首先检查反应体系。

在确认PCR以及逆转录反应体系没有问题的情况下，RNA降解是导致实验失败的最主要的原因。

可以取少量新鲜提取或冻存的RNA跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验完整性。

以哺乳动物细胞/组织为例，完整的总RNA在胶上能看见清晰的三条带，分子量从大到小分别为28 s、18 s,、5 s；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即开始逆转录反应，并适量增大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。

逆转录实验原理

逆转录实验原理简介逆转录实验是一种用于合成DNA的生化过程，它模拟了逆转录酶的行为。

逆转录是指将RNA转录成DNA的过程，逆转录酶是执行此过程的酶。

逆转录实验的原理涉及到逆转录酶的结构和功能，以及逆转录实验所需的材料和步骤。

逆转录酶的结构和功能逆转录酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，它能将RNA作为模板合成相应的DNA序列。

逆转录酶通常由一个多聚体组成，其中包括至少一个RNA依赖的DNA聚合酶活性中心。

逆转录酶的功能是将RNA的核苷酸序列复制到DNA分子中，并逆转录酶的活性中心提供了合成DNA所需的催化能力。

逆转录实验的材料和步骤逆转录实验需要以下材料和步骤：材料1.RNA模板：作为逆转录实验的起点，可以是通过RNA提取、合成或放射性标记得到的RNA分子。

2.逆转录酶：用于合成DNA的酶，常用的逆转录酶有反转录酶、MuLV逆转录酶等。

3.引物：用于指导逆转录酶合成DNA的DNA分子，通常是具有互补序列的DNA寡核苷酸。

4.核酸四聚体：逆转录酶合成DNA时所需的辅助因子。

5.缓冲液：维持逆转录实验反应的正常pH值和离子浓度的缓冲液。

步骤1.准备逆转录实验体系：将RNA模板、引物、逆转录酶和核酸四聚体依次加入到一个合适的实验管中，并加入适量的缓冲液。

2.反应温度和反应时间：根据逆转录酶的要求，将反应体系置于合适的温度下反应一定的时间，通常在37-42°C反应1-2个小时。

3.停止反应：通过改变反应条件，如加热、改变pH值或加入逆转录酶的抑制剂，来停止逆转录实验。

常用的方法是将反应体系加热至70°C，此时逆转录酶活性会失活。

4.分离DNA：利用凝胶电泳或其他分离技术，将反应体系中的DNA分子分离出来。

通常使用琼脂糖凝胶电泳来判断是否成功合成了DNA。

应用领域逆转录实验在许多生物学研究中起着重要的作用。

以下是逆转录实验在某些应用领域的具体应用：1. 病毒学研究逆转录实验可用于病毒学研究中，特别是对于逆转录病毒如HIV的研究。

逆转录的基本过程

逆转录的基本过程嗨，朋友！今天咱们来聊聊一个超酷的生物过程——逆转录。

这可不是个简单的事儿，就像一场奇妙的生物魔法。

先来说说什么是逆转录吧。

你看，在正常的生物世界里，大多数生物都是按照从DNA到RNA再到蛋白质这样的顺序来传递遗传信息的。

这就像是一条已经铺好的道路，大家都规规矩矩地沿着走。

可是呢，逆转录就像是个叛逆的小淘气，它偏要反着来，从RNA到DNA。

这可就打破常规啦！那这个逆转录是怎么发生的呢？这得先从逆转录酶说起。

逆转录酶就像是一个超级工匠，它可是这个过程中的关键角色。

想象一下，RNA就像是一张设计图纸，不过这张图纸不是我们常见的那种，而是一种有点特殊的蓝图。

逆转录酶看到这张RNA蓝图后，就开始动手干活啦。

它首先要做的就是以RNA为模板合成互补的DNA链。

这就好比是照着一张有点模糊的画，在另一张纸上重新画一幅相似的画，但是用的颜料和笔触都有点不一样。

这个过程可不容易呢。

逆转录酶得一个一个地把那些RNA上的核苷酸信息转化成DNA的核苷酸。

这个时候，它就像一个超级细心的抄写员，不能出一点差错。

要是出了错，那可就像建房子的时候打歪了地基一样，后面的事情可就全乱套了。

我给你举个例子哈。

假如RNA是一串特殊的密码，像“1 - 2 - 3 - 4- 5”这样，逆转录酶就得把它翻译成对应的DNA密码，可能就变成了“a - b - c - d - e”。

这个过程中，逆转录酶要用到一些原料，就像画家画画需要颜料一样，这些原料就是脱氧核苷酸。

要是周围没有足够的脱氧核苷酸，那这个逆转录酶就像是巧妇难为无米之炊，干着急也没办法把这个互补的DNA链合成好。

等这个互补的DNA链合成得差不多了，这个过程还没完呢。

这个新合成的DNA链和原来的RNA链就像一对临时搭档，它们还得再进一步。

接下来，这个逆转录酶就像一个神奇的裁缝，它要把RNA - DNA杂交双链中的RNA给去掉。

这就好比是把一件衣服上多余的线头剪掉，让这件衣服看起来更完美。

逆转录实验说明

逆转录实验说明一、反转录酶的选择1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

RNA保存：为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。