2019年过氧化氢酶米氏常数
生物化学 过氧化氢酶Km值测定
3、实验数据收集（根据实验进程填写下表）
项目
0
①加入H2O2的mL数 ②KMnO4的用量 ③加入H2O2的mmol数 ④剩余H2O2的mmol数＝②
×0.004×2.5
⑤反应速度＝③－④
⑥底物浓度[s]＝③÷10
⑦1/v=1÷⑤÷5
⑧1/[s]=1÷⑥
1 23 4 5
注意事项
反应瓶中H2O2浓度计算：
〔S〕＝H2O2摩尔浓度×加入H2O2的mL数 10
＝加入H2O2的摩尔数 10
＝ （mmol/mL）
反应速度的计算
V = 加入的H2O2的毫摩尔数－ 剩余的H2O2的毫摩尔数/5min
= H2O2的摩尔浓度×加入H2O2 毫升数－0.004×2.5×消耗KMnO4 的ml数/5min 注意硫酸和高锰酸钾使用安全！
பைடு நூலகம்
思考题
酶米氏常数的测定会受到那 些实验条件的影响？
过氧化氢酶米氏常数的测定
生物化学实验 牛卫宁
一、实验目的
了解米氏常数的意义，测定过 氧化氢酶的米氏常数。 学习一种测定酶Km值的方法 熟悉和掌握过氧化氢酶活性的 测定原理和方法
二、相关知识与原理
相关知识 米氏方程与米氏常数（Km值）
米氏方程
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
Km值: 酶促反应速度为Vmax/2时的 底物浓度。单位是mol/L
1/[S] + 1/Vmax
（林－贝氏方程）
绘制1/[S] 与1/V的标准曲线，其与X轴的交点 即为－1/Km ，以此求得该酶在测定条件下的Km值。
实验原理
过氧化氢酶催化2H2O2 2H2O+O2 ↑ 反应一定时间后，剩余过氧化氢 进行下述反应
过氧化氢酶米氏常数
过氧化氢酶米氏常数各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：/L（4）KMnO4实际浓度：/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）实验（2）对照（1）对照（2）（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT??V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=（A-B）= VT====10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel 作图）1/s 1/v2008040（四）求出Km（mol/L）和Vmax （mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=+ x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm= Vmax=第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O24.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
10 过氧化氢酶米氏常数的测定
本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其 Km值和Vm值。
过氧化氢酶
2H2O2
2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4
2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O
过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；
通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差 即为反应速度v；
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数
初速率 v
80 Vm
60
Vm 40 2
动力学曲线
20
K
m
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
底物浓度 [S]
Km值：可通过对米氏方 程 作 图 (V~[S] 图 ) 求 出 。 在数值上等于酶促反应 速度为最大速度一半时 的底物浓度值。单位是 mol/L(或mmol/L)。
0.01
0.015
0.0218 0.025
0.02 v/[S] (L/10min)
14
*Excel直线作图
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
1 0.50
2 0.67 8.83
编号 3 0.83 8.67
4 1.25 8.25
5 2.50 7.00
各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液 0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的时间。30℃反应 5min后立即加入10% H2SO4 5.0mL终止反应。
2.滴定
用0.02mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色， 记录消耗的KMnO4溶液毫升数。 分别求出各瓶反应前后的底物浓度[S]0、[S]1，并计算反 应速度v： [S]0为反应前的底物浓度（mol/L） [S]0=C1V1/10 [S]1为反应后的底物浓度（mol/L） [S]1=2.5C2V2/10 C1为H2O2的浓度（mol/L） v=(C1V1-2.5C2V2)/5 C 为KMnO 用液的浓度（mol/L）
结果记录 与计算
高锰酸钾溶液标定
取5mL 0.1mol/L的草酸和3mL 10% H2SO4溶液于锥形瓶中， 加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液 滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待 溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作 用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但 滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈 现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
与反应速度的关系
v为反应速度 [S]为底物浓度 vmax为最大反应速度 Km为米氏常数
米氏常数Km
Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 在酶学分析中， Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。
Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能 力越弱，反之亦然。
实验二 过氧化氢酶km值的测定
实验二过氧化氢酶km值的测定
过氧化氢酶（H2O2）是一种经典的多功能过氧化物。
它可以在氧化还原或化学反应中发挥作用。
因此，它在生物氧化解氧化反应中非常重要。
H2O2可以与其他过氧化物，包括氧原子和自由基，反应形成复杂的反应物组合。
这些反应控制着氧化脱氢反应，而过氧化氢酶（Km）是这种反应序列的关键步骤。
Km是H2O2和其他过氧化物之间氧化脱氢反应的活性位置，它表示H2O2在氧化脱氢反应中显示出其最大活性的浓度。
它是生物体氧化脱氢反应进行的重要指标，可以帮助我们了解这种反应的效率和机理。
测定Km值可以看出这个过程的氧化-脱氢速率，从而优化氧化脱氢反应的效率。
Km值的测定大致可以分为三个部分：进行反应的准备工作、进行该反应的实验操作和数据处理。
首先，用实验室内的设备准备反应液，其中应包括酶溶液、过氧化氢和反应基质。
其次，把反应液倒入试剂瓶，用磁力搅拌器搅拌均匀，使酶蛋白完全溶解。
然后，用光度仪测定溶液的响应时间，并确定反应停止的时间。
最后，对得到的数据进行分析，以确定Km值。
Km值测定是一个比较复杂的实验，需要实验室设备、当心操作和熟练的数据处理。
这些都是关键因素，控制着测定结果的准确性和可信度。
因此，在实验室中必须做好准备，并且试剂、实验仪器要有正确的温度、湿度和搅拌速度，以保证实验的准确性和可靠性。
此外，实验室人员还需要做好安全防护措施，以防止接触有毒物质，确保实验的安全性。
总之，测定H2O2的Km值是比较复杂的，需要安全准备、细心操作和合理数据分析，以获得准确、可靠的结果，为氧化解氧化反应提供参考。
实验一：米氏常数的测定
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。
这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。
大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。
通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。
过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
2.滴定
用0.02mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色
（在30s内不消失）为终点。
3.计算
酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示 酶活(mgH2O2/g· min)= ( A B ) VT 1.7 式中：
FW V 1 t
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反应后， 用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的 H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4
=5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
底物浓度对酶促反应速度的影响
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反 应的速度有很大的影响。 底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增 加迅速增加；随着底物浓度继续增加，反应速度的增加开 始减慢；当底物浓度增加到一定值时，反应速度达到极限 值（Vmax）。 米氏方程表示底物浓度
酶活力测定为什么需在进程曲线的初速度时间范围内进行？
米氏方程中的Km有何意义及实际应用。 为了准确测得米氏常数值，实验过程需注意哪些问题？
查阅资料，设计应用紫外吸收法测定过氧化氢酶活力的实验。
大组总结交流（PPT）：
内容：实验内容，结果计算和分析，课后研讨题，实验体会等。
结果记录 与计算
结果记录 与计算
用双倒数法（以1/v对1/[S]作图） 计算Km和vmax
三、材料、试剂与器具 1.材料：新鲜马铃薯
2.试剂：
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告
过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告1. 实验目的与背景哎呀，大家好！今天咱们来聊聊一个挺有趣的实验——过氧化氢酶的米氏常数测定。
别被这个名字吓到了，其实就是在研究一种酶的“工作效率”而已。
想象一下过氧化氢（H₂O₂）就像是个小小的坏蛋，它可不是什么好东西；而过氧化氢酶呢，就是那个专门来捉拿坏蛋的超级英雄。
这种酶存在于咱们的细胞里，帮忙把过氧化氢分解成水和氧气，保护我们的身体不被这些“坏蛋”害了。
米氏常数（Km）这东西呢，简单来说就是衡量酶对底物亲和力的一个参数。
如果Km值小，说明酶对底物的“喜欢”程度高，咱们的超级英雄很厉害；反之则说明这个超级英雄对底物的“兴趣”不大。
通过测定这个值，我们可以更好地理解这位超级英雄的“战斗力”，也能对相关的生物化学反应有个更清晰的认识。
2. 实验原理与方法2.1 实验原理好的，接下来咱们进入正题——实验原理。
首先，得了解酶催化的基本过程。
简单来说，酶会跟底物结合，形成一个“酶底物复合物”，然后催化底物转变为产物。
在这个过程中，酶的催化速率会受到底物浓度的影响。
米氏常数就是用来描述这种关系的一个参数。
咱们用的是过氧化氢酶，它催化的反应是这样的：2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂。
底物过氧化氢在反应过程中会被转化成水和氧气。
通过测定不同底物浓度下反应速率的变化，可以绘制出反应速率与底物浓度的关系图，从中找出米氏常数Km。
2.2 实验步骤接下来，就轮到实验步骤了。
首先，准备好过氧化氢酶和不同浓度的过氧化氢溶液。
每一种底物浓度都要做几个重复实验，以确保数据的可靠性。
接着，将过氧化氢酶加入到每种浓度的过氧化氢溶液中，开始反应。
然后，定期取样，测定反应产物的浓度。
这时，咱们就要用上光谱仪之类的仪器来检测氧气的产生情况，这可是个大工程，得小心翼翼地操作，别弄得一团糟。
3. 实验结果与讨论3.1 实验数据分析一切准备妥当，实验终于开始啦！拿到数据后，我们就可以用“米氏方程”来分析实验结果了。
过氧化氢酶的作用机理与速率方程推导
过氧化氢酶的作用机理与速率方程推导过氧化氢酶（catalase）是一种存在于生物体细胞中的一种酶类，在细胞代谢过程中起着重要作用。
它能够催化过氧化氢分解为水和氧，并且对生物体内部的氧化应激起到了很大的作用。
而对于过氧化氢酶的催化机理以及其速率方程的推导，都是十分重要的内容。
本文将通过对过氧化氢酶的催化机理和速率方程的详细介绍，加深对过氧化氢酶作用的理解，同时也为相关领域的研究工作者提供一些有益的信息。
一、过氧化氢酶的催化机理过氧化氢酶是一种催化酶，其作用是将过氧化氢分解为水和氧气。
过氧化氢酶在催化水解过程中发挥着关键作用，并且可以在较温和的条件下加速过氧化氢的分解反应。
该酶主要存在于细胞质以及细胞器中，并且对于细胞内部的氧化应激有着很大的作用。
过氧化氢酶的催化机理主要分为两个关键步骤：1.过氧化氢与过氧化氢酶的结合当过氧化氢与过氧化氢酶结合时，过氧化氢酶的活性部位上的铁离子将催化活化过氧化氢的分解，使其分解为水和氧。
这个步骤是整个过氧化氢酶催化反应的第一步，也是比较关键的一步。
2.过氧化氢的分解过氧化氢在与过氧化氢酶结合后，会通过过氧化氢酶活性部位上的催化作用，发生分解反应，生成水和氧气。
这个步骤是整个过氧化氢酶催化反应的第二步，是整个酶催化反应的决速步骤。
总的来说，过氧化氢酶的催化机理主要包括了过氧化氢与过氧化氢酶的结合和过氧化氢的分解两个关键步骤。
在这两个步骤中，过氧化氢酶通过其活性部位上的催化作用，促进了过氧化氢的分解反应，使得其在细胞内部发挥了重要作用。
二、过氧化氢酶催化反应的速率方程推导速率方程是描述酶催化反应速率与物质浓度之间关系的方程。
过氧化氢酶催化反应的速率方程主要描述了反应速率与过氧化氢和过氧化氢酶的浓度之间的关系。
推导过氧化氢酶催化反应的速率方程，可以更加深入地理解过氧化氢酶的催化机理。
过氧化氢酶催化反应的速率方程可以用Michaelis-Menten方程来描述。
该方程为：v = (V_max [S]) / (K_m + [S])其中，v表示反应速率，V_max表示酶的最大催化速率，[S]表示底物（过氧化氢）的浓度，K_m表示米氏常数，该常数表示的是当反应速率是最大速率的一半时底物的浓度。
过氧化氢酶米氏常数
[标签:标题]篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：5.032g2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L （4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）1.72.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=0.218（A-B）=0.8 VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）1/s 1/v200 111.1149.2 80.6121.9 79.380 45.140 21.2（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm=0.35 Vmax=0.63第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定一、实验目的了解并掌握米氏常数的意义和测定方法二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMnO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
2H2O2 = 2H2O + O22KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。
在保持恒定的条件下，用相同浓度的过氧化氢酶催化不同浓度的H2O2分解。
在一定限度内，酶促反应速度与H2O2浓度成正比。
用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。
三、实验器材锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管四、实验试剂1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7)2、0.004 mol/L KMnO4(需标定)3、0.05 mol/L H2O2(需标定)4、25% H2SO4五、实验操作1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。
2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H2SO4终止反应，充分混匀。
用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
六、实验计算分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v。
C1V110[S] =5 ∕2C2V2C1V1–v =式中 [S]：为底物物质的量浓度(mol/L)C1：为H2O2物质的的量浓度(mol/L)V1：为H2O2的体积(mL)10：反应的总体积v：反应速度(mmol/min)C2: KMnO4物质的量浓度(mol/L)V2：KMnO4的体积(mL)以1/v对1/[S]作图求出Km。
过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：嫩豆芽5.010g2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL ，临用前用草酸钠标定。
（2）Na2C2O4质量数：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
（3）标定数据：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作用）。
随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。
滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
2KMnO4+5Na2C2O4+8H2SO4=2MnSO4+5Na2SO4+K2SO4+10 CO2↑+8H2O（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2↑+2H2O2 5 2 1 1 5 21.9*10-5 4.75*10-5m(H2O2)=4.75*10-5*34*1000=1.615mg2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g•min）酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示酶活(mgH2O2/g·min)=式中：().A B VFW V tT-⨯⨯⨯⨯171A—对照KMnO4滴定毫升数；B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；VT—酶液总量（ml）；V1—反应所用酶液量（ml）；F W—样品鲜重（g）；1.7—1ml 0.02mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2 酶活(mgH2O2/g·min)=0.235*50*1.7/(5.010*2.5*10)=0.159(mgH2O2/g·min)二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）求得线性关系为y=1.3921x+0.0111所以V max=1/0.0111=8.654*10-2K M=1.205*10-1第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 - 生化实验技术
l 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定 该酶活力大小。
l 在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反 应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴 定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
实验二、过氧化氢酶的 活力和动力学常数测定
——高锰酸钾滴定法
一、实验目的
l 1.掌握酶活力测定的方法 l 2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理 l 3.掌握测定过氧化氢酶米氏常数的基本原理和
方法
二、实验原理
l 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁， 它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程 中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又 是还原剂。
（3）高锰酸钾标准液配制：称取KMnO4 （AR），用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000mL ，临用前用草酸钠标定。
高锰酸钾溶液标定：
取的草酸和3mL10% H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至 （75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴 定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动， 待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催 化作用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快， 但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液 呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
l 酶活(mgH2O2/g·min)= (AB)VT1.7
l 式中：
FWV1t
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2019年过氧化氢酶米氏常数篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：5.032g2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158（2）Na2C2O4质量数：134（3）标定数据：0.02mol/L（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65实验（2）0.50对照（1）1.45对照（2）1.30（二）结果计算1．换算系数（1mLKMnO4溶液相当于多少mgH2O2）1.72.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mgH2O2/g?min）(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=0.218（A-B）=0.8VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）1/s1/v200111.1149.280.6121.979.38045.14021.2（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min） Km11??vv[S]v如（三）中图maxmaxy=0.5572x+1.5829x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm=0.35Vmax=0.63第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?R(Fe2+)+H2O2=R(Fe3++OH－)R(Fe3+OH－)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O24.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
5.米氏方程中的Km有何实际应用？米氏常数是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
可用于判断反应级数；判断是否为不同种酶；判断酶的最适底物；确定酶活性测试时所需底物的浓度。
6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？当ν=Vmax/2时，Km=[S]。
Km值是酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
Km值对某一特定酶来说是个常数。
一半根据酶的Km 值来判断这些酶是否是完全相同的酶，或是催化同一反应的一类酶。
Km值越大，酶与底物亲和力越小；Km值越小，酶与底物亲和力越大。
7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反应速度下降。
反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。
8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。
请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。
实验概要本实验用紫外吸收法测定了过氧化氢酶的活性。
主要试剂0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
主要设备紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴。
实验步骤1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表顺序加入试剂。
表紫外吸收法测定H2O2样品液配置表25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
篇二：测定过氧化氢酶Km实验一过氧化氢酶Km的测定【原理】本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。
过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：?????2H2O+O2↑2H2O2?过氧化氢酶H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。
2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4???2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。
作图求出过氧化氢酶的米氏常数。
【试剂】1．0.05mol/L草酸钠标准液将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。
冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO45ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。
2．约0.02mlKMnO4储存液称取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。
3．0.004mol/LKMnO4应用液取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。
4．约0.08mol/LH2O2液取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/LKMnO4标定之，稀释至所需浓度。
5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。
【操作步骤】l．血液稀释吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。
取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。
2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L 的H2O22.0ml和25%H2SO42.0ml，分别用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色。
从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。
3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。
加入物(ml)H2O2(约0.08mol/L)蒸馏水10.503.021.002.5031.502.0042.001.5052.501.00将各瓶置37℃水浴预热5min，依次加入1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO42.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。
最后用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。
【计算】1．反应瓶中H2O2浓度(mol/L)?H2O2mol浓度?加入H2O2ml数4?H2O2mmol数4（式中：4为反应液量4ml）2．反应速度的计算：以反应消耗的H2O2mmol数表示。
反应速度=加入的H2O2mmol数－剩余的H2O2mmol 数即：H2O2mol浓度×加入的毫升数－KMnO40.004mol/L×消耗的KMnO4毫升数×5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）3．求Km值：下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。
己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下：计算程序①加人H2O2数②加人H2O2mmol=①×0.08③底物浓度［S］=②÷4④酶作用后，KMnO4滴定ml10.500.040.011.3521.000.080.023.700.0370.04331.500.120.036.400.0640.05642.000.160.049.800.0980.06252.500.200.0513.200.1320.068⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/20.0135⑥反应速度V=②一⑤0.0265⑦[S]/V=③÷⑥0.3770.4650.5360.6450.735按前述方法作图求得Km＝0.032mol/L。
【思考题】l．Km值的意义是什么？2．测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？篇三：酶工程实验(20XX.3)实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/LKMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/LKMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。