第三章 紫外-可见分光光度分析法
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仪器分析课件 第3章 紫外分光光度法
检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制
和结果处理
记录装置
二、分光光度计的类型
（一）单光束分光光度计
光源 单色器
参比 样品
检测器
显示器
• 只有一条光路，通过变换参比池和样品池的位 置，使它们分别置于光路来进行测定
国产751型、752型、721型、722型、UV-1100 型、英国SP-500型
E2a ca E2b
(3) 图计算法----两组分吸收光谱完全重叠--混合样品测定 (3)图中，a,b 吸收光谱双向重迭，互相干扰，在最大波长处互相
吸收。处理方法如下：
解线性方程组 过程：
（三）示差分光光度法（示差法）
普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量 较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。
第三节 紫外-可见分光光度计
依据朗伯-比尔定律，测定待测液吸光度A的仪器。（选择不同波
长单色光λ、浓度） 分光光度计外观 分光光度原理图:
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器 信号处理及显示
信号处理 显示器
单色器
分光光度计外观
吸收池 检测器
光源
721型可见分光光度计
一、主要部件
1. 光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
浓度C及液层厚度L的乘积成正比。
注意! 适用范围
①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。 ③吸光度A具有加和性。Aa+b+c= Aa &光系数
A=k c L
k = A /c L
1、摩尔吸光系数或Em： 在一定λ下，c=1mol/L，L=1cm时的吸光度。单位：L/(mol.cm)
第三章紫外可见分光光度法
优点：自动记录， 快速全波段扫描。可 消除光源不稳定、检 测器灵敏度变化等因 素的影响，特别适合 于结构分析。仪器复 杂，价格较高。是目 前用的最多的分光光 度计。
23
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快束交替通 过同一吸收池而后到达检测器。产生交替信号。无需 参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数 光谱。
max也作为定性的依据。不同物质
的λmax有时可能相同，但ε
定量分析的依据。
max不一定相同。
（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比,
10
3．紫外-可见吸收光谱的产生
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分 子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生紫 外-可见吸收光谱。 电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动
紫外分光光度计检测；可作为溶剂使用。
39
2、n→ζ＊跃迁
所需能量较大。 吸收波长为150～250 nm，大部分在远紫外区 ，近紫外区仍不易观察到。
含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤
素等杂原子)均呈现n →ζ*跃迁。 如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n →ζ*跃迁的λ分 别为173 nm、183 nm和227 nm。
38
1、σ →σ ＊跃迁
所需能量最大，ζ电子只有吸收远紫外光的能量 才能发生跃迁。
饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区。
吸收波长λ< 200 nm。 例：甲烷λmax为125 nm , 乙烷λmax为135 nm， 环丙烷（饱和烃中最长） λmax为190 nm。 在近紫外没有饱和碳氢化合物的光谱，需真空
8
2．能级跃迁的讨论
（1）转动能级间的能量差Δ Er：0.005～0.050 eV， 跃迁产生吸收光谱位于远红外区，称为远红外 光谱或分子转动光谱； （2）振动能级的能量差Δ Ev约为：0.05～１eV，跃
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3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快束交替通 过同一吸收池而后到达检测器。产生交替信号。无需 参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数 光谱。
max也作为定性的依据。不同物质
的λmax有时可能相同，但ε
定量分析的依据。
max不一定相同。
（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比,
10
3．紫外-可见吸收光谱的产生
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分 子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生紫 外-可见吸收光谱。 电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动
紫外分光光度计检测；可作为溶剂使用。
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2、n→ζ＊跃迁
所需能量较大。 吸收波长为150～250 nm，大部分在远紫外区 ，近紫外区仍不易观察到。
含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤
素等杂原子)均呈现n →ζ*跃迁。 如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n →ζ*跃迁的λ分 别为173 nm、183 nm和227 nm。
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1、σ →σ ＊跃迁
所需能量最大，ζ电子只有吸收远紫外光的能量 才能发生跃迁。
饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区。
吸收波长λ< 200 nm。 例：甲烷λmax为125 nm , 乙烷λmax为135 nm， 环丙烷（饱和烃中最长） λmax为190 nm。 在近紫外没有饱和碳氢化合物的光谱，需真空
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2．能级跃迁的讨论
（1）转动能级间的能量差Δ Er：0.005～0.050 eV， 跃迁产生吸收光谱位于远红外区，称为远红外 光谱或分子转动光谱； （2）振动能级的能量差Δ Ev约为：0.05～１eV，跃
紫外-可见分光光度法
30.01mg→100ml 5→50ml 浓度为30.01ug/ml
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量 （按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有 的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其 重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池 材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长 度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只 能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用 于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于 可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长 度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸 收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长 范围为190～900nm。
第二节 光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律： 比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的 理论基础。 Lambert于1730年提出了光 强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物 质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都 有各自的空心阴极灯，因此原子 吸收光谱是锐线光谱。
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量 （按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有 的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其 重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池 材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长 度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只 能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用 于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于 可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长 度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸 收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长 范围为190～900nm。
第二节 光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律： 比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的 理论基础。 Lambert于1730年提出了光 强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物 质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都 有各自的空心阴极灯，因此原子 吸收光谱是锐线光谱。
紫外可见分光光度法解析课件
即 T= It/I0
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的
稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、 液层厚度乘积成正比，即
A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质 的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为 吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
2. 使用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理 论基础。
A lg 1 lg I0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓 度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光 系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度 （g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称 为比吸光系数。它们的关系如下：
4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。
4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同 的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的
稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、 液层厚度乘积成正比，即
A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质 的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为 吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
2. 使用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理 论基础。
A lg 1 lg I0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓 度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光 系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度 （g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称 为比吸光系数。它们的关系如下：
4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。
4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同 的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
紫外可见分光光度法
ΔT =1%, 溶液浓度相对误差Δc/c 与其透光度T 的关系曲线如右图。
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
2024/10/5
措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
2024/10/5
2
溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
2024/10/5
可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
2024/10/5
20
紫外可见分光光度的使用
2024/10/5
21
2024/10/5
22
721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
2024/10/5
10
吸光度的加和性
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
2024/10/5
措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
2024/10/5
2
溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
2024/10/5
可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
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紫外可见分光光度的使用
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721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
2024/10/5
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吸光度的加和性
紫外-可见分光光度分析法
2017/12/6
n π*
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▲2、常用术语
▲ 1)生色团与助色团 生色团：能吸收紫外-可见光的基团叫生色团。 对有机化合物：
主要为具有不饱和π键和未成键的孤对电子的基团。
例：—CHO ； —COOH ； C＝C；C＝O；C＝N； —N＝N— 注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的 吸 收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个 发色 团的吸收波长长，强度 也增强。
8
2017/12/6
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长（或能量）的外来辐 射，“表现”出不同形状的吸 收曲线，分析这些曲线，便能 研究分子结构。这是UV-Vis定 性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。9
2. 能级组成：除了电子能级(Electron energy level)外，分子吸
收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动 (Vibration)能级和转动(Rotation)能级的跃迁！据量子力学理 论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱 。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：
四. 分光光度定量分析原理（Lambert-Beer 定律）
a. 定量分析原理
b
A
正偏离
I0
IV
负偏离
I V I 0 e bc
A lg
I0 Iv
紫外-可见分光光度法的基本原理
R
*
n
* 跃迁
所需能量最大； 电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁,
吸收光谱处于远紫外区，多为饱和烃。
甲烷 乙烷 125 nm 135 nm
n * 跃迁
所需能量较大，但小于 *跃迁；含有未共用电子对 （n电子）原子的饱和化合物都可发生,如含杂原子的分子： -NH2、-OH、-S、-X中的未成键的n电子 吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区
圆 折 二 射 色 法 性 法
X 射 干 线 涉 衍 法 射 法
原 旋 子 光 吸 法 收 光 谱
原 子 发 射 光 谱
原 子 荧 光 光 谱
红 外 光 谱 法
分 子 荧 光 光 谱 法
分 子 磷 光 光 谱 法
核 磁 共 振 波 谱 法
紫外-可见分光光度法的基本原理
1、紫外可见吸收光谱法 根据溶液中物质的分子或离子对紫外 光谱区或可见光谱区辐射能的吸收以研 究物质组成和结构的方法。
，即分子中含有孤对电子和键同时存在时，才发生n→ ＊跃迁；
吸收波长为200～400nm，一般在近紫外区；吸收系数较低
O
H3C-C-CH3
例:丙酮有280nm左右的n→ ＊跃迁吸收峰（ =10~30 L· mol-1· cm-1 ）
→ ＊跃迁
所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或 近紫外区 含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁 C=C C=C ; N=N ; C=O 属于强吸收，max >104L· mol-1· cm-1， 具有共轭双键的化合物 → ＊跃迁所需能量降低
（2）准确度较高：相对误差为 2%-10%。如采用精密分光光 度计测量，相对误差可减少至1%-2%。
紫外可见分光光度法测定纯度
紫外可见分光光度法测定纯度
紫外可见分光光度法是一种常用的分析方法，可以用于测定化合物的纯度。
它基于物质对于紫外或可见光的吸收特性进行测量。
测定纯度的步骤如下：
1. 准备样品：将待测物质按照标准操作程序进行样品制备，例如溶解、稀释等。
2. 调节分光光度计：根据待测物质的吸收特性，选择合适的波长和光程进行测量。
通常使用紫外和可见光区域的波长，常用波长为200-800nm。
3. 调节参比溶液：选择一个已知纯度的参比物质制备参比溶液，并使用它校准仪器。
选择合适的波长和光程进行校准。
4. 测定样品吸光度：使用校准后的仪器，将待测溶液放入样品池中，测量吸光度。
注意要保持仪器和溶液的温度和湿度恒定。
5. 计算纯度：根据测得的吸光度，使用已知浓度对应的校准曲线或定量计算方法，计算出样品的纯度。
需要注意的是，测定精度和准确度与样品制备和仪器校准的好坏以及操作流程的控制有关。
为确保结果的准确性，建议进行多次重复实验并计算平均值。
另外，不同的化合物和溶剂可能存在吸收特性或背景吸光的干扰，需要根据具体情况进行考虑和处理。
紫外分光光度计分析方法
紫外—可见分光光度分析法一、基本要求掌握：本章要求掌握分光光度法的特点、基本原理、测定方法及计算方法；分子吸收光谱与电子跃迁类型，物质对光的选择吸收与吸收光谱曲线，摩尔吸收系数与吸收系数，吸光度与透光度，偏离朗伯-比尔定律的原因；掌握显色反应条件及光度测量条件的选择；掌握紫外—可见分光光度计的主要部件，各部件的作用及仪器原理，主要类型及特点；掌握差示分光光度法的原理、特点。
理解：物质分子结构与紫外吸收光谱的关系，吸收波长位移与分子结构变化的关系；紫外—可见分光光度定量分析影响结果准确度的各种因素。
了解：了解紫外—可见分光光度法测定灵敏度和选择性的途径；双波长分光光度法等其它分光光度法定量测定的方法；紫外—可见分光光度法在有机化合物的结构解析方面的作用及在其他方面的应用。
二、基本概念与重点内容A概述1．紫外—可见分光光度法的特点灵敏度与准确度较高；选择性较好；设备简单、操作简便。
2．分光光度法的发展过程目视比色法光电比色法分光光度法3．分子的紫外—可见吸收光谱分子的紫外—可见吸收光谱是基于物质分子吸收紫外辐射或可见光，其外层电子跃迁而成，又称分子的电子跃迁光谱。
紫外—可见分光光度法是基于物质分子的紫外—可见吸收光谱而建立的一种定性、定量分析方法。
4．光的基本性质5．物质对光的吸收及吸收光谱6．紫外—可见吸收光谱与电子跃迁类型7．生色团与助色团B 光的吸收定律1．光吸收的基本定律（朗伯-比尔定律）2．吸光度与透光率、百分透光率之间的关系3．工作曲线的绘制与应用4．吸光系数、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度5．偏离朗伯-比尔定律的因素C紫外-可见分光光度计1．分光光度计的主要部件2．在紫外和可见光区进行测量时，分别选择何种光源3．单色器的主要元件光栅；棱镜4．分光光度计中的检测器类型早期：光电池；光电管；光电倍增管。
5．紫外-可见分光光度计的类型及特点D显色测定试样的制备和光度测定条件的选择1．显色反应及其影响因素2．测定读数误差和测定条件的选择5．入射波长的选择E 分光光度定量测定方法与其他应用1．单组分的测定通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。
紫外可见光分光光度法
紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。
当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。
因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。
物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
北大仪器分析-紫外可见分光光度法3
示例
芦丁含量测定 分别移取0.200mg / mL标样0 ~ 5mL 25mL
样品3.0mg 25mL
0.710mg/25mL
（三）对照法
前 提 ：固 定 仪 器 和 测 定 条 件截；距 为0； 标样与样品浓度相近
过程：一定 分别测定A样和A标
• 同样条件：、C标、A标、A样
随着导数阶数增加，极值数目增加 （极值数=导数阶数+1）。谱带宽度 变小，分辨能力增高 可分离和检 测两个或两个以上重叠的谱带。
• 药物中的杂质： 制定一个允许其存在的限量
（与分析误差的存在相比较）
A < 最大值 A 峰 / A 谷 > 最小允许值
例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算 用0.05mol/L的HCL配制成2mg/mL的溶液，λ 310nm下测 定。规定 A310≤0.05 即符合要求的杂质限量≤0.06%
C
A E11c%m
l
0.05 435 1
1.1104 g /100ml
1.1103 mg / ml
肾上腺酮% 1.1103 100 0.06% 2
三、单组分的定量方法
定量依据：
A = C l A~C（一定）线性
注意要求：
选择：吸收峰， 大，A大，测定灵敏度高。 几个峰，选不易被其它物质干扰的、较高吸收峰。 不选光谱中靠短波长末端的吸收峰。
第三节 紫外-可见分光光度分析法
一、定性分析 二、纯度检查和杂质限量测定 三、单组分的定量方法 四、同时测定多组分的定量方法——计算分光光度法 五、结构分析 六、比色法
一、定性分析 （一）定性鉴别
定性鉴别的依据→吸收光谱的特征 吸收光谱的形状 吸收峰的数目、位置（波长） 吸收峰的强度 相应的吸光系数
紫外可见分光光度法(仪器分析课件)
蓝移：使化合物的吸收峰向短波长方向移动的现 象称为蓝移（或紫移）。改变溶剂的极性会引起蓝移 现象。
影响紫外可见吸收光谱的因素
➢ 共轭效应 ➢ 容剂效应 ➢ 溶液pH
共轭效应 两个或两个以上不饱和键共轭时，由于共轭后π电
子的运动范围增大，引起π*轨道的能量降低，π—π* 跃迁的能级差ΔE减小，吸收光谱产生红移，同时摩尔吸 光系数增大。
溶液pH
不同pH的溶液中，分子或离子的解离形式可 能发生变化，其吸收光谱的形状、λmax和吸收 强度可能不一样，测定这些化合物的紫外可见光 谱时，须注意溶液的pH。
常见有机化合物的紫外可见吸收光谱
饱和烃及其取代衍生物
➢ 只能生σ→σ*跃迁，λ～150nm。 ➢ 可作为测定紫外－可见光谱时的溶剂 。 ➢ 引入杂原子，可产生n→σ*跃迁，吸收波长变大。 ➢ 如：CH3I、CH3Br、CH3Cl 、CH4的λmax分别为259nm、
= c ； 波数 = 1/ = /c
粒子性
光是由光子流组成，光子的能量：
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1eV=1.602×10－19 J
波粒二象性
E h hc
结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越 低)，光量子的能量越低。（P7例1）
数据处理：
以波长(λ)为横坐标，吸光度为纵坐标作图， 得到 A～λ关系曲线，即光谱吸收曲线，通常称 为吸收光谱。
特端吸收
A
吸收峰
峰谷
1
4
2
3
250 300
350
400
λ/nm
λmax
影响紫外可见吸收光谱的因素
➢ 共轭效应 ➢ 容剂效应 ➢ 溶液pH
共轭效应 两个或两个以上不饱和键共轭时，由于共轭后π电
子的运动范围增大，引起π*轨道的能量降低，π—π* 跃迁的能级差ΔE减小，吸收光谱产生红移，同时摩尔吸 光系数增大。
溶液pH
不同pH的溶液中，分子或离子的解离形式可 能发生变化，其吸收光谱的形状、λmax和吸收 强度可能不一样，测定这些化合物的紫外可见光 谱时，须注意溶液的pH。
常见有机化合物的紫外可见吸收光谱
饱和烃及其取代衍生物
➢ 只能生σ→σ*跃迁，λ～150nm。 ➢ 可作为测定紫外－可见光谱时的溶剂 。 ➢ 引入杂原子，可产生n→σ*跃迁，吸收波长变大。 ➢ 如：CH3I、CH3Br、CH3Cl 、CH4的λmax分别为259nm、
= c ； 波数 = 1/ = /c
粒子性
光是由光子流组成，光子的能量：
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1eV=1.602×10－19 J
波粒二象性
E h hc
结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越 低)，光量子的能量越低。（P7例1）
数据处理：
以波长(λ)为横坐标，吸光度为纵坐标作图， 得到 A～λ关系曲线，即光谱吸收曲线，通常称 为吸收光谱。
特端吸收
A
吸收峰
峰谷
1
4
2
3
250 300
350
400
λ/nm
λmax
第三节 紫外-可见分光光度分析方法药剂
同理： 测定咖啡因：则苯甲酸钠是 干扰组分 测量波长 λ2 = 272nm 参比波长 λ1 = 253nm
∆A = A =A
安 272
−A +A
安 253
苯 272
咖 272
− (A
苯 253
+A )
咖 253
= (E
咖 272
− E ) ⋅ C咖 ⋅ l
咖 253
∆A C咖 = 咖 咖 ( E272 − E253 ) ⋅ l
1% 1cm
注：浓度为2mg/ml的肾上腺素HCl溶 液，要求含肾上腺酮小于0.06%
C ≤ 2 × 10 × 0.06% = 1.2 × 10 ( g / 100ml )
−3 −4
A ≤ E Cl = 435 ×1.2 ×10 ×1 = 0.05
1% 1cm
−4
2、在化合物 λ max 处杂质无吸收， 而在化合物 λ min 处杂质有吸收 规定：化合物在 λ max 与 λ min 处吸光度比值为一限量 例：碘磷：λ max : 294 nm λ min : 262 nm 杂质 无吸收 有吸收 A 纯碘磷： 294 = 3 . 39 ，含杂质 A294 < 3 . 39 A262 A262 规定：碘磷药品
A
A样 C样 C
0
图11-19 标准曲线
标准曲线法要求： 1、A与C是一条直线或近似一条直 线关系 2、测量过程中，要求仪器的工作 状态及测量条件保持一致。 3、样品浓度Cx应落在线性范围内 4、标准溶液与试样组成相似。 5、A=a+bC，a要比b小102以上
（三）对照法 操作 1、在相同条件下配制一个标准溶 液和一个样品溶液（C标与C样）
E相同，λmax相同， 但吸收曲线不同
紫外可见分光光度分析法-为龙
某些元素的氧化态，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或 可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行 显色后测定。 例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直接进行光度测
定
2 Mn2＋ ＋5 S2O82-＋8 H2O =2 MnO4＋ + 10 SO42-＋ 16H+ 将Mn2＋ 氧化成紫红色的MnO4＋后，在525 nm处进行测
液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液
；
参比溶液的选择一般遵循以下原则： • ⑶ 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收
，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液； ⑷ 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则 可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂， 作为参比溶液。
如果吸光度读数范围不在此范围，可通过 改变称样量、稀释溶液及选择不同厚度 的吸收池。
3.选择合适的参比溶液
• 为什么需要使用参比溶液？ 测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。 • 参比溶液的选择一般遵循以下原则： ⑴ 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收， 其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液； ⑵ 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试
定。
4.显色剂
无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜 色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选 择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
三、显色反应条件的选择
1.加入掩蔽剂
选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩 蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分 的测定。 例：测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色) 成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S 光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为 Fe2+，消除Fe3+的干扰。
定
2 Mn2＋ ＋5 S2O82-＋8 H2O =2 MnO4＋ + 10 SO42-＋ 16H+ 将Mn2＋ 氧化成紫红色的MnO4＋后，在525 nm处进行测
液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液
；
参比溶液的选择一般遵循以下原则： • ⑶ 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收
，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液； ⑷ 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则 可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂， 作为参比溶液。
如果吸光度读数范围不在此范围，可通过 改变称样量、稀释溶液及选择不同厚度 的吸收池。
3.选择合适的参比溶液
• 为什么需要使用参比溶液？ 测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。 • 参比溶液的选择一般遵循以下原则： ⑴ 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收， 其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液； ⑵ 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试
定。
4.显色剂
无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜 色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选 择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
三、显色反应条件的选择
1.加入掩蔽剂
选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩 蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分 的测定。 例：测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色) 成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S 光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为 Fe2+，消除Fe3+的干扰。
第3章 紫外光谱分析法
则可近似认为是单色光。在低浓度范 围内，不发生偏离。若浓度较高，即使 ｜Δε｜很小， A总 ≠Ａ1 ，且随着c值 增大， A总 与A 1的差异愈大，在图上则 表现为A—c曲线上部(高浓度区)弯曲愈 严重。故朗伯—比耳定律只适用于稀溶 液。 为克服非单色光引起的偏离，首先应 选择比较好的单色器。此外还应将入射 波长选定在待测物质的最大吸收波长且 吸收曲线较平坦处。
透光度(透光率)T
透过度T : 描述入射光透过溶液的程度:
T = I t/ I0
吸光度A与透光度T的关系:
A ＝ －lg T
朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的 依据。应用于各种光度法的吸收测量； 摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚 度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1 g/L、液层 厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。
3.4 紫外—可见分光光 度计
一、基本组成 二、分光光度计的类型
仪器
可见分光光度计
紫外-可见分光光度计
标准曲线法测定未知溶液 的浓度时，发现：标准曲线常 发生弯曲（尤其当溶液浓度较 高时），这种现象称为对朗伯 —比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大 类）：一类是物理性因素，即 仪器的非理想引起的；另一类 是化学性因素。
（1）物理性因素 • 朗—比耳定律的前提条件之一是入射光 为单色光。
• 难以获得真正的纯单色光。分光光度计 只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导 致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。
（2） 化学性因素
朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之 间不发生相互作用；假定只有在稀溶液 (c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光 质点间可能发生缔合等相互作用，直接影 响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液
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4、摩尔吸光系数ε的特征
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和
波长等条件一定时，ε 仅与吸收物质本身的性质有关，与 待测物浓度无关；
（3）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在
最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax 表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法 测定该物质可能达到的最大灵敏度。
4.常用术语
（1）生色团：
最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的、能在紫 外可见光范围内产生吸收的集团。这两种跃迁均要求有机物分子中含有 不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双 键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—。
（2）助色团：
有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X 等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ >200nm的光)，但当它们与生色
3.1 基本原理
3.1.1分子吸收光谱的形成 1、物质内部三种运动形式
（1）电子相对于原子核的运动
（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动 （3）分子本身绕其重心的转动
分子三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级 三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量 分子内能：电子能量Ee 、振动能量Ev 、转动能量Er
（4）可作为定性鉴定的参数；
（ 5 ） ε
max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度
法测定该物质的灵敏度越高。 ε >105：超高灵敏； ε =(6～10）×104 ：高灵敏； ε <2×104 ：不灵敏。
（6）ε 在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm
时该溶液在某一波长下的吸光度。
团相连时，就会发生n—π 共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长
向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。
（3）红移与蓝移 有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶 剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:
λ max向长波方向移动称为红移， 向短波方向移动称为蓝移 (或紫移)。
光度来表示物质对光的吸收程度，吸光度A与透光度
T的关系: A ＝lg1/T = －lgT = lg Io/It
二、朗伯—比耳定律
1、朗伯定律
布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760 年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。当用适当 波长的单色光照射一固定浓度的溶液时，其吸光度与光 透过的液层厚度呈正比，此即朗伯定律， 其数学表达式
5. 结果显示记录系统
数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。
二、分光光度计的类型
1.单光束
经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液， 以进行吸光度的测定。适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一 般不能作全波段光谱扫描。
2.双光束
双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为相等的两束 光，一束通过参比池，另一束通过样品池。 光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经 对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。由于两束 光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引 起的误差。
即 E＝Ee+Ev+Er ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr
2、能级跃迁
紫外-可见光谱属于电子
跃迁光谱。 电子能级间跃迁的同时 总伴随有振动和转动能级间 的跃迁。即电子光谱中总包 含有振动能级和转动能级间 跃迁产生的若干谱线而呈现 宽谱带。
（1）电子能级的能量差ΔEe较大1～20eV。电子跃迁产生 的吸收光谱在紫外—可见光区，紫外—可见光谱或分子的电 子光谱；
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具
有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在320～2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连 续光谱。
2、单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长 单色光的光学系统。 ①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或凹面反
为：
A=k′l
k′为比例系数，l为液层厚度（即样品的光程长度） 朗伯定律适用于任何非散射的均匀介质，但它不能 阐明吸光度与溶液浓度的关系。
例1. 有一单色光通过厚度为1cm的有色溶液, 其强度减弱20%。若通过5cm厚度的相同溶
液, 其强度减弱百分之几?
解： lgT1 lgT2 l1 5 l1
───── = ───
ε：摩尔吸光系数，单位L· mol－１· cm－１；
或: A＝lg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位g· L－１
a：吸光系数，单位L· g－１· cm－１
a与ε的关系为： a =ε/M （M为摩尔质量）
透光度(透光率)T
透过度T : 描述入射光透过溶液的程度: T = I t / I0
射镜，将分光后所得单色光聚
焦至出射狭缝； ⑤出射狭缝。
光栅 和棱 镜分 光原 理
3. 样品室
样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应 的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在
紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。
4. 检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信 号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
吸光度A与透光度T的关系:
A ＝ －lg T
朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的 依据。应用于各种光度法的吸收测量； 摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度 为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数a(L· g-1· cm-1）相当于浓度为1 g/L、液层厚度 为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。
（2）分子振动能级的能量差（能级间隔）Δ Ev约为：
0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或
分子振动光谱；
（3）转动能级间的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，跃迁产
生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级 间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是
三、偏离朗伯—比耳定律的原因
标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线 常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对
朗伯—比耳定律的偏离。
引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想 引起的； （2）化学性因素，与样品溶液有关。
（1）物理性因素——难以获得真正的纯单色光
的强度为It，反射光的强度为Ir
则:I0＝Ia ＋ It ＋ Ir 在吸光光度法中，由于采用同样质料的比色皿进行测量， 反射光的强度基本上相同，其影响可以相互抵消， 上式可简化为:I0＝Ia ＋ It
透过光的强度It与入射光的强度Io之比称为透光度 或透光率，用T表示。
T＝ It/Io
溶液的透射比越大，表示它对光的吸收越小；反 之，透射比越小，表示它对光的吸收越大。常用吸
点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液
(c<10-2mol/L)时才基本符合。
①朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 ②试液中各组分之间的相互作用。 ③试剂对吸收光谱的影响。
④试样为胶体、乳状液或有悬浮物质时的影响。
6.2紫外-可见分光光度计
可见分光光度计
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源 单色器 样品室 检测器 显示
可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 400750nm，主要用于有色物质的定量分析。
紫外—可见光分光光度法是利用某些物质 的分子吸收200-800nm光谱区的辐射来进行分
析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电
子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，
广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。
（4）增色效应和减色效应
由于化合物结构改变或其他原因， 使吸收强度（摩尔吸光系数ε）增强， 称增色效应；使吸收强度减弱，称为 减色效应。
3.1.2光吸收基本定律
一、透射比和吸光度 当一束平行的单色光照射均匀的有色溶液时，光的一 部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿的表面反 射。如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光
电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。
分子轨道理论：一个成键轨道 必定有一个相应的反键轨道。通 常外层电子均处于分子轨道的基 态，即成键轨道或非键轨道上。 外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)
跃迁。主要有四种跃迁所需能量Δ Ε 大小顺序为：
n →π ＊ < π →π ＊ < n →σ
例2. 一符合比尔定律的有色溶液，当浓度为c时，透射
比为T，若其它条件不变，浓度为c/3时，T为 _________，浓度为2c时，T为__________。 解: T1/3 T2
这说明浓度与透射比T 的是指数关系。
3、朗伯—比耳定律
A＝lg（I0/It)= εb c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔质对不同波长的光线具有不同的吸收能力， 物质也只能选择吸收那些能量相当于该分子能量 （ΔΕe、ΔΕv、ΔΕr ）总和的辐射； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正
比，定量分析的依据。
3．有机化合物的紫外—可见光谱
有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价
lgT2 = 5lgT1= 5×lg0.80 = - 0.485
T2= 32.7% , 即减弱67.3%